Summary
Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren krijgen veranderingen in neuronale activiteit.
Abstract
Bijna twee decennia van onderzoek heeft aangetoond dat astrocyten in situ en in vivo te uiten tal van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) die kunnen worden gestimuleerd door neuronaal uitgebracht zender. Echter, het vermogen van astrocytaire receptoren plasticiteit vertonen in reactie op veranderingen in neuronale activiteit weinig aandacht gekregen. Hier beschrijven we een model dat kan worden gebruikt om globaal opschalen of omlaag astrocytaire I metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) bij acute hersencoupes. Inbegrepen zijn methodes over hoe te bereiden parasagittal hippocampale plakken, bouwen kamers geschikt voor slice langdurige incubatie, bidirectioneel manipuleren neuronale actiepotentiaal frequentie, belasting astrocyten en astrocyten processen met fluorescerende Ca 2 +-indicator, en veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit door opname te meten spontane en uitgelokte astrocyten Ca 2 + evenementen met behulp van confocale microscopie. In wezen, een "calcium roadmap "is bedoeld voor informatie over plasticiteit van astrocytaire Gq GPCR's te meten. Toepassingen van de techniek voor de studie van astrocyten worden besproken. Het hebben van een goed begrip van hoe astrocytaire receptor signalering wordt beïnvloed door veranderingen in neuronale activiteit heeft belangrijke implicaties voor zowel de normale synaptische functie, alsook processen onderliggende neurologische aandoeningen en neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
Astrocyten reageren binnen enkele seconden op stimulatie van neuronen of neuronale axonen met stijgingen van cytoplasmatische Ca 2 + bijna uitsluitend als gevolg van de activering van astrocytaire Gq GPCR's. Bijvoorbeeld, muscarine acetylcholine receptoren 1, cannabinoidreceptoren 2, α 1A adrenergische receptoren 3, 4, en groep I mGluR's (zie hieronder) zijn astrocytaire Gq GPCR subtypen acuut reageren neuronale activiteit. Activering van astrocytaire groep I mGluR's is het meest uitgebreid aangetoond na stimulatie van neuronale glutamaat afferenten in situ (zoals acute hippocampale plakken) 5-7, en bij volwassen muizen cortex in vivo na sensorische stimulatie 8. Het resultaat van de activering van astrocytaire Gq GPCR signalering op de biologie en fysiologie van astrocyten, neuronen, of astrocyten-neuron interacties heeft een kwestie van debat 9-12 geweest. Het zal s zijnome tijd voordat de functie van neuron-to-astrocyten receptor signalering wordt volledig gewaardeerd.
Hoewel het duidelijk is dat neuronen astrocytaire receptoren kunnen activeren met experimentele protocollen er aspecten van neuron naar astrocyten receptor communicatie die blijven slecht begrepen. Ten eerste, het werkelijke bedrag van de neuronale activiteit die nodig is om astrocytaire Gq GPCR te activeren is niet goed gedefinieerd, en ten tweede, is het vermogen van astrocytaire receptoren gebruik-afhankelijke plasticiteit vertonen weinig aandacht gekregen. Om te beginnen om deze vragen te beantwoorden, hebben we onlangs een protocol ontwikkeld om bidirectionele schaling van astrocytaire groep I mGluRs in acute juveniele hippocampus plakjes induceren in respons op lange termijn veranderingen in neuronale actiepotentiaal (AP) synaptische activiteit. Vergelijkbaar met wat is ontdekt voor bidirectionele homeostatische plasticiteit van neuronale ionotrope glutamaatreceptoren 13, 14, astrocytische I mGluRs opschalen following blokkade van neuronale actiepotentialen en afbouwen wanneer neuronale actiepotentiaal frequentie wordt verhoogd 15. De compenserende veranderingen in astrocytaire receptoren worden gemeten door spontane en uitgelokte astrocyte Ca2 + transiënten en vergelijken van de eigenschappen van deze gebeurtenissen die van astrocyten in controle omstandigheden. In dit manuscript beschrijven we de volledige methodologie voor het gebruik van dit protocol, inclusief de voorbereiding van acute plakjes van de hippocampus, incubatie-omstandigheden te astrocyten receptor scaling induceren, astrocyten Ca 2 +-indicator kleurstof laden, Ca 2 + imaging technieken met behulp van confocale microscopie, en de verwachte effecten op astrocyten Gq GPCR-activiteit. Voorspelbaar effect op astrocyten Ca 2 + signaaloverdrachtseigenschappen - die overeenkomen met de eerder in gekweekte cellen getransfecteerd met verschillende expressie niveaus van Gq GPCRs - een "routekaart" die kunnen worden gebruikt in toekomstige studies te testen op veranderingen alstrocytic GPCR expressie. De vertakkingen en potentiële toepassingen voor het gebruik van deze techniek zal bijdragen tot het begrijpen van de astrocyt-neuronale interacties in gezonde en zieke hersenen.
Protocol
De procedures die volgen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië, Riverside.
1. Bouw van incubatiekamer en Slice Holder
- Het construeren van de incubatiekamer: Construeer de incubatiekamer van materiaal dat niet giftig. Zorg ervoor dat de kamer luchtcirculatie Geregelde houdt een voldoende hoeveelheid ACSF voor een stuk houder te drijven en is groot genoeg zodat de slice houder drijft aan een einde van de kamer, terwijl het gas dispersie van zuurstof lijnen optreedt bij de andere uiteinde. De lade gedeelte van een pipet opslagcontainer met zijn luchtdichte deksel (Figuur 1A) past deze criteria mooi.
- Boor een gat aan de zijkant van de houder ongeveer 1 ¼ van boven en ¼ vanaf de zijkant. Breng een stuk flexibele slang door het gat (Figuur 1B). Wees voorzichtig boren laag genoeg zodat de buis niet wordt gecomprimeerd wanneer de klep gesloten is, maar hoog genoeg zodat het boven de oplossing.
- Solliciteer siliconen naadafdichting ("aquarium nadenkit") om een waterdichte afdichting tussen de zuurstof lijn en de kamer te creëren.
- Verbind de "buiten" einde van de buis een gastank (95% zuurstof, 5% kooldioxide) met een mannelijke Luer-fitting. Voor een perfecte pasvorm, cut-to-fit een natuurlijke afgeschuind 200 ul pipet tip (figuur 1C).
- Sluit de "binnenkant" uiteinde van de slang aan op een een-op-zes lijn kunststof spruitstuk. Cut-to-fit zes 20 pi Eppendorf microloader pipet tips om elk inlaatspruitstuk (figuur 1D). De fijne opening van het microloaders is ideaal voor het produceren van een constante stroom van kleine belletjes.
- Met het oog op de ventilatie, boor twee kleine gaatjes op het deksel van de houder (figuur 1E).
- Het construeren van de slice houder: De slice houder is gemaakt van een Floating Bubble Rack (Figuur 1F).
- Verwijder de onderste "benen" van de bel rack, en snijd de bovenkant tot ongeveer 1 ¾ inch
- Lijm een stuk nylon mesh materiaal onderaan de ronde rek met cyanoacrylaatlijm (zoals standaard Krazy Glue) een acht putjes slice houder (fig. 1G) creëren. Elk putje kan een enkele muis hippocampus slice passen.
- Breng de slice houder aan een einde van de incubatiekamer en microloader-verdeelstuk inrichting aan de andere kant. Laat de microloader tips te rusten op de kamer vloer (Figuur 1H). Deze opstelling is bedoeld om voldoende zuurstof te zorgen zowel de bovenkant als de onderkant van de acute hippocampale plakken, en vermijd luchtbellen die uit direct onder het segment houder om slice roeren minimaliseren en geen direct contact van bellen met de hippocampale plakken.
- Spoel de incubatie kamers eend slice houders grondig met DDH 2 O na elk experiment, en ontsmetten met 70% EtOH wekelijks. Bij incuberen segmenten in verschillende oplossingen zullen meerdere kamers / plak houders nodig zijn.
2. Oplossingen en Drugs
- Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF): Bereid 4 L standaard ACSF in DDH 2 O met het volgende (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2, MgCl2 1.3, 1.25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose en 0,1 Trolox. Meet de osmolariteit van de oplossing met een osmometer, aan ~ 310 mOsm moet komen. ACSF composities voor experimentele condities worden hieronder beschreven (zie Protocol nr. 3). Filter alle oplossingen met behulp van een 0,22 pm bottle-top filter in geautoclaveerd glazen flessen. Oplossingen zijn stabiel 4 ° C gedurende maximaal een maand.
- Snijden Buffer: Bereid plakken met een aangepaste ACSF met (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3,8 MGCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose en 1.3 ascorbinezuur. Meet de osmolariteit van de oplossing met een osmometer, aan ~ 310 mOsm moet komen. Vervanging van CaCl2 met MgCl2 in de buffer snijden verbetert segment gezondheid.
- Sulforhodamine 101 (SR-101, 1 uM) wordt gebruikt voor astrocyten acute hippocampale plakken identificeren. Voeg een 1 mM voorraad SR-101 bij verdunning 60,67 mg SR-101 in 100 ml van een gemodificeerde laag calciumgehalte ACSF als volgt (in mM) bereid: 125 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, MgCl2 6, 1.25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose en 1.3 ascorbinezuur. Controleer of de osmolariteit van de lage calcium ACSF is ~ 310 mOsm. Verdun de 1 mM SR-101 stock 1.000 keer in gewijzigde lage Ca 2 + ACSF voor het laden. Bewaar de uiteindelijke SR-101 oplossing 4 ° C en beschermd tegen licht tot noodzakelijk voor het experiment.
3. Manipulatie van Long Term neuronale tarieven in Acute hippocampus Slices
Gebruik een incubatie van twee protocollen afzonderlijke experimenten langdurige neuronale rates manipuleren:
- Remmen neuronale: Incubate in tetrodotoxine (TTX, 1 uM): LET OP: Behandel TTX met zorg omdat het fataal kan zijn indien ingenomen in voldoende hoeveelheden. Handschoenen en een veiligheidsbril wordt aanbevolen. TTX afschaft volledig AP-driven neuronale in acute plakjes. Incubeer plakjes in 3,5 mM K + ACSF, plus 1 uM TTX in de experimentele conditie. In de controle conditie, incubeer plakjes in 3,5 mM K + ACSF zonder TTX. De vergelijking tussen de twee voorwaarden onthult de opschaling effect in astrocytaire Gq GPCR-activiteit. 3,5 mM K + ACSF dient als controleconditie (in tegenstelling zeggen, 2,5 mM K +) om het effect van TTX behandeling te maximaliseren.
- OF -
- Verhoog neuronale bovenbasale snelheden: Incubate in hoog kalium: Het verhogen van de extracellulaire K + concentratie depolariseert neuronen en verhoogt hun basale vuursnelheid. Incubatie in 5,0 mM K + ACSF aanzienlijk verhoogt neuronale actiepotentiaal frequentie en 2,5 mM K + ACSF 15. Incubeer plakjes in 5,0 mM K + ACSF voor de experimentele conditie en de controle conditie, incubeer plakjes in standaard 2,5 mM K + ACSF. De vergelijking tussen de twee voorwaarden onthult de down-scaling effect in astrocytaire Gq GPCR-activiteit.
4. Acute hippocampus slice voorbereiding
- Het opzetten van de warme herstel kamer:
- Verwarm het waterbad tot 35 ° C, leg dan de bereide incubatie kamers binnen. Vul het bad met water tot aan de hoogte van de ACSF binnen de incubatie kamers (figuur 1G).
- Zuurstof de experimentele en controle ACSF met 95% O 2, 5% CO 2. De belletjes die uit de microloader-spruitstuk apparaat moet klein en overvloedig, maar ook zacht zijn, er mag geen zichtbare beweging van ACSF binnen de kamer niet.
- Het opzetten van de ijskoude dissectie kamer:
- Neem twee emmers ijs. Plaats een fles ongeveer 300 ml snijden buffer in een emmer ijs en houden zuurstof met 95% O2, 5% CO2 gedurende 20 minuten. Dompel een 100 mm petrischaal in de andere ijsemmer, net onder het oppervlak van ijs. Het zijpaneel van de petrischaal in direct contact met het ijs. Giet wat snijden buffer in de petrischaal en houd het zuurstofrijk ook.
- Chill het snijvlak van de single-edge scheermes door het onder te dompelen in het ijskoude snijden buffer in de petrischaal voor meer dan 1 min.
- Vibratome setup:
- Zet de vibratome en zorg ervoor dat de drainage is gesloten.
- Zet de snijkamer in de trillingentome en pakijs rond de snijkamer. Precool aan 0-4 ° C.
- Verwijder fabriek vetten uit de dubbele rand scheermesje door het weken het in 70% EtOH gedurende 5 minuten en daarna spoelen met ddH2O. Snijd het in helften voorzichtig (niet buigen het blad) en monteer de ene helft mes op de snij-blok.
- Het verwijderen van de hersenen van muizen:
- Verdoven een twaalf tot achttien dagen oude C57BL/6J muis in een kleine kamer voorgeladen met 0,5 ml isofluraan gedrenkt in een Kimwipe of wattenschijfje. Knijp de tenen van het dier om te controleren of er geen pijn reflex.
- Onthoofden de muis met behulp van een scherpe schaar, verwijder vervolgens de hoofdhuid met behulp van kleine tang. Gebruik kleine been schaar om de schedel gesneden uit het cerebellum naar de olfactorische bollen langs de longitudinale spleet. Verwijder de craniale flappen met de kleine tang. Verwijder voorzichtig de hersenen met een spatel, en dompel het in de ijskoude zuurstofrijk slicing buffer in de petrischaal.
- Bisect de hersenen van muizen met de gekoelde scheermesje in de petrischaal om meer oppervlakte zorgen voor koeling en oxygenatie. Laat de doorsneden hemisferen zitten in het ijskoude snijden buffer gedurende 2-3 minuten. De hersenen moeten volledig afkoelen en meer solide geworden.
- Breng een dun laagje van cyanoacrylaat lijm op het platform van de vibratome. Lijm beide hersenhelften aan het platform gesneden kant naar beneden en de zijkanten omhoog, met de reukbol naar voren. Zet het platform in de snijkamer, vul dan de maaikamer met ijskoud, goed zuurstofrijk slicing buffer.
- Doorgaan zuurstof de maaikamer terwijl de voorbereiding van 300 micrometer dikke parasagittal plakjes met behulp van de vibratome. Snijd de plakjes op een frequentie van 85 Hz, een voorwaartse snelheid van 0,20 mm / s en een amplitude van 1,40 mm. LET OP: Wij hebben gevonden dat de belangrijkste variabele in de voorbereiding van gezonde acute plakjes van de hippocampus is de kwaliteit van de vibratome. Ons laboratorium maakt gebruik van de Leica VT 1200 S magneetic rijden vibratome met Vibrocheck tot "z" de trillingen te verminderen.
- Na het snijden, ontleden de hippocampus en de aangrenzende entorhinalschors uit elke parasagittal slice behulp scherpe tang. Voer deze procedure uit in de ijskoude, goed zuurstofrijk snijden buffer in de snij-kamer van de vibratome. De scherpte van de tang is zeer belangrijk voor het segment gezondheid minimaliseert behandeling van de segmenten.
- Maak een transferpipet door het afbreken van de lange punt van een glas Pasteur pipet en topping het defecte onderdeel met een pipet lamp. Dit maakt gebruik van het brede uiteinde van de pipet segmenten dragen. Zorg ervoor dat pipetten bestellen, zonder de katoen stekker in het grote einde (zie ook Materiaal tabel). Als plakjes worden bereid in steriel omstandigheden, is het niet nodig de pipet voor gebruik autoclaaf, hoewel een nieuwe pipet moet worden en gebruikt voor elk experiment.
- Breng elke hippocampus slice om de incubatie kamers in de 35 ° C waterbad, door dompelen de overdracht pipet in de ACSF in elk putje van de slice houder en opzuigen van de slice. Beweging van het segment te minimaliseren tijdens dit proces. Directe overdracht van de schijfjes naar de warme incubatie bad resulteert in een betere kwaliteit plakjes dan "opvoeren" de temperatuur geleidelijk.
- Laat de plakjes van de hippocampus te herstellen in het warme water bad voor een totaal van 45 minuten, als volgt verdeeld: Incubeer plakken voor 20 min in 1 uM SR-101 verdund in laag calcium ACSF, vervolgens overbrengen naar de lage calcium ACSF (zonder SR-101) gedurende 10 minuten. Vervolgens dragen de schijfjes te controleren of experimentele ACSF voor de resterende 15 minuten van de warme incubatie.
- Na 45 minuten warme herstel voorzichtig bewegen de incubatie kamers van het 35 ° C waterbad voor het werkblad en laat vervolgens de plakjes blijven incuberen bij kamertemperatuur gedurende een totale incubatietijd van 3 uur voor het begin van de bolus-loading protocol (zie hieronder). 5. Bolus Laden van Astrocytes met Ca 2 +-indicator
- Voorbereiden van Ca 2 +-indicator bolus-loading dye:
- Voor elk flesje kleurstof (50 ug), voeg 3,87 ul van verse dimethylsulfoxide (DMSO) en vortex grondig. De frisheid van DMSO is belangrijk voor een goede laden en derhalve openbreken een nieuwe ampul per keer.
- Meng in 9 ul van 20% pluronzuur en vortex grondig. Meng de kleurstof met 100 ul van de juiste experimentele of controle ACSF en vortex goed, voor een laatste kleurstof concentratie van 10 uM.
- Filter de oplossing met behulp van een centrifuge filterbuis. Deze stap voorkomt dat de laad-pipet verstopt raakt tijdens het uitwerpen van de kleurstof.
- Bereid een pipet uit een borosilicaatglas capillaire getrokken om een weerstand van ongeveer 1,3 MQ wanneer gevuld met kleurstof oplossing.
- Plaats een hippocampus sneetje in een opname kamer ontworpen voor gebruik met de microscoopen continu perfuseren met zuurstof ACSF met dezelfde samenstelling die werd geïncubeerd in (1,5 ml / min). Alternate tussen controle en experimentele omstandigheden bij het selecteren van een hippocampus slice.
- Gooi ongezond uitziende hippocampus plakjes. De kwaliteit van segmenten variëren zelfs binnen een bepaald experiment. Er zijn geen vaste criteria voor het kwantificeren stukje gezondheid, daarom bepaling van slice gezondheid is subjectief en vooral gebaseerd op ervaring.
- In het algemeen houdt segmenten met een glad oppervlak verschijnen en een hoog percentage gezonde CA1 pyramidale cellen (Figuur 2A) zijn. CA1 piramidale cellen zijn bijzonder gevoelig en kwetsbaar voor CNS beledigingen, dus met een groot percentage (≥ 75%) van de gezonde CA1 piramidale neuronen kan een bruikbare criteria voor het aanvaarden of verwerpen van een schijfje.
- Gooi plakjes dat ongeveer> 25% dode neuronen. Dode neuronen hebben een gebakken ei-achtige uitstraling (Figuur 2B). LET OP: We have opgemerkt dat de hoek van de snede speelt een belangrijke rol in de vraag of gezonde neuronen of niet. Als neuronale dendrieten naar boven projecteert (uit de slice), dan zal de neuronen meestal dood. Dit is waarschijnlijk omdat een dergelijk groot deel van het neuron volume is opgenomen in de vertakte boom, die versnijden de dendrieten is dodelijk voor de cellen. Anderzijds, indien de dendrieten projecteren evenwijdig aan of onder een neerwaartse hoek van het segment oppervlak, zal een hoog percentage gezonde neuronen. Soms derhalve neuronen hoofdzakelijk dode aan een zijde van het segment en gezond ogende aan de andere kant.
- Zoek een geschikte gebied van sr astrocyten 40-70 micrometer onder de slice oppervlak op basis van grootte, morfologie en locatie met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) optiek.
- Plaats de glazen pipet met kleurstofoplossing en laat het op het oppervlak van het deel boven dit gebied met een standaard patch-clamp microelektrode holder. Met de pipet op het oppervlak van de plak toepassing tegendruk op de pipet uitwerpen kleurstof beginnen. Uitwerpen van kleurstof wordt zichtbaar onder beide DIC optiek en een geschikte laser zoals een 488 lijn voor een groene kleurstof.
- Langzaam de pipet tot ongeveer 40 urn onder het oppervlak segment met een micromanipulator en laat de kleurstof te verwijderen ongeveer 45-60 sec. Vervolgens laat de pipet een extra 35 micrometer (75 urn onder slice oppervlak) en uitwerpen kleurstof voor ongeveer 45-60 sec. Langzaam trekken de pipet tip van de slice. Kortere injectietijd waarschijnlijk resulteren in onvoldoende pigment laden, terwijl langere injectie neigt achtergrond belasting, welk signaal-ruisverhouding van de opname af te verhogen.
- Om ervoor te zorgen dat een groot aantal van de astrocyten nemen de kleurstof, is het meestal nuttig om te injecteren een tweede kleurstof bolus een korte afstand. Breng de pipet terug naar de oppervlakte van het schijfje, zorg ervoor dat de pipet niet verstopt is, dan move de pipet ongeveer 80-100 micrometer afstand van de eerste injectieplaats, langs de stratum radiatum. Herhaal bolusinjectie op deze site.
- Laat 30-45 minuten voor de beeldvorming voor de astrocyten tot het nemen van de kleurstof en voor de achtergrond signaal af te nemen. Laat de slice in de perfusie kamer in deze tijd. Zorg ervoor dat deze incubatietijd wordt ingebouwd in het totaal 4 uur behandeling van het experiment. Het verkrijgen van de volgende slice en herhaal de stappen 5,2-5,8.
- Het opzetten van de confocale microscoop voor beeldvorming:
- Het beperken slice blootstelling aan laserlicht is van het grootste belang, een hoge blootstelling kan leiden tot bleken en / of fototoxiciteit verven. Het gebruik van hogere optische vergroting of een verhoogde zoominstellingen verhoogt blootstelling aan licht aan het afgebeelde veld. Daarom zet de standaardwaarden voor elke laser een hoge fotovermenigvuldiger setting, 1x winst en 0,5% laser uitgangsvermogen.
- Breng een 1.5x zoom voor een betere visualisatie van astrocyten processen.
- Stel het veld resolutie tot 512 x 512 pixels.
- Stel de scansnelheid tot de snelst mogelijke, dat is ~ 1.2 sec per scan met behulp van de modus een manier scan.
- Verzamel emissie spectra met behulp van bandfilters van 503-548 nm voor de 488 nm laser, en 624-724 nm voor de 559 nm laser. Met deze instellingen kunt beeldvorming van een gebied van ~ 5-8 astrocyten in een relatief hoog tempo met een resolutie voldoende is om astrocyten cellichamen en de belangrijkste processen te observeren. Idealiter zal astrocyten in het veld helder genoeg om duidelijk te zien, maar zonder pixel verzadiging.
- Bevestiging van de identiteit van de cellen geladen met Ca 2 + kleurstof zoals astrocyten door het visualiseren van de SR-101 colabeling met de 559 nm laser.
- Opnemen astrocyten Ca 2 +-activiteit:
- Teken dozen met behulp van het beeld acquisitie software over regio's van belang (ROIs) binnen de cel, in dit geval via astrocyten cellichamen. De boxen hebben geen betrekking achtergrondpixels, om de beste signaal-ruisverhouding mogelijk bereiken. Teken een vak over achtergrond als referentie.
- Schakel de perfusie experimentele ACSF plus 1 uM TTX (Abcam) door de rest van het experiment. Dit voorkomt mogelijke neuronale AP-driven astrocyten calcium reacties. Resterende stijgingen van astrocytaire Ca2 +-concentratie dan vereist om quantale vesiculaire release constitutieve (basale) GPCR-activiteit of een combinatie van beide mechanismen.
- Record fluorescentie in de tijd van alle ROI's. Een stijging van de fluorescentie in de uitgangssituatie dan verhogingen cytoplasmatische Ca2 +-concentratie 16 en dus GPCR-activiteit in astrocyten 10, 17, 18. Om eventuele vroege scaling effecten op astrocytaire receptoren vermijden door TTX, compleet experimenten binnen 40 min frOM toen de 1 uM TTX perfusie begon.
- Na het behalen van 10 min van de baseline opname van spontane Ca 2 +-activiteit, van toepassing een agonist van belang (zoals DHPG) op achtereenvolgens toenemende concentraties. Laat minstens 5 minuten tussen applicaties mogelijk receptor desensitisatie verminderen.
- Aan het einde van de opname, passen een cocktail van agonisten voor andere astrocytaire Gq GPCRs als positieve controle voor intacte astrocytaire Gq GPCR signaalwegen. Onderdelen van de agonist cocktail zal afhangen van de receptor van interesse. 10 uM van elk van de Gq GPCR agonisten histamine, carbachol en 2Na-ATP histamine H1 receptoren stimuleren [H1R] muscarinische acetylcholinereceptoren [mAChR] en purinerge receptoren [P2YR] respectievelijk een veelgebruikte agonist cocktail.
- Post-experiment beeldverwerving:
- Bij de voltooiing van de Ca2 + opname nemen foto's met de 488 nm en 559 nm lasers, fof latere bevestiging van de astrocyten identiteit en ROI plaatsing. Laservermogen en HV instellingen kunnen vrijelijk op dit punt worden gewijzigd optimaal voor colocalization verkrijgen, aangezien er niet langer een probleem over laser intensiteit die de gegevens (Figuur 2A).
- Herhaal de stappen 6,1-6,3 voor een totaal van ongeveer 8 sneetjes en 40 astrocyten / groep. Slices moet komen van een minimum van 3 verschillende muizen.
- Het definiëren van een Ca 2 + hoogte: Standaardisatie in het definiëren van Ca 2 + transiënten niet is stevig binnen de wetenschappelijke gemeenschap gevestigd. Wat volgt is een typisch protocol dat de gevoeligheid maximaliseert terwijl het beperken van de herkenning van valse positieve gebeurtenissen uit basislijnruis.
- Hebben een ander lab lid toewijzen elk sneetje een numerieke code om ze blindelings te analyseren. Aan het einde van analyse decodeert elk segment.
- Analyseer spontane en uitgelokte astrocyten Ca 2 + verhogingen offline gebruik beeldvorming analyse software. Hertekenen en / of de grootte, vorm en locatie van de ROI naar wens.
- Score toename in fluorescentie intensiteit over basislijn als een Ca2 + hoogte als de piek amplitude groter dan twee standaarddeviaties (SD) boven het gemiddelde van 30 seconden gemiddelde basislijn fluorescentie gedurende ten minste twee opeenvolgende meetpunten. In bijzonder luidruchtig opnames (lage signaal-ruis), kan het nodig zijn deze criteria te worden aangepast aan 3 SD boven het gemiddelde uitgangswaarde van fluorescentie. Definieer het begin van elk Ca 2 + hoogte als het laatste meetpunt voor de fluorescentie-intensiteit van meer dan een standaarddeviatie boven het gemiddelde.
- Onderscheid te maken tussen multipeak vs opeenvolgende single-piek evenementen. Score een evenement als "multipeak" wanneer de fluorescentie-intensiteit niet terugkeert naar de uitgangswaarde (onder het gemiddelde basiswaarde 2 SD) voor &# 8804; 9 opeenvolgende datapunten (10.8 sec) tussen pieken. Zo zal enkele piek gebeurtenissen 10 of meer opeenvolgende basislijn punten nodig in-tussen hen.
- Classificeren gebeurtenissen als "plateau"-type responsen bij fluorescentie-intensiteit onderhoudt piekamplitude (± 10% van de piekwaarde) gedurende ten minste 3,6 sec.
- Analyseer de amplitude, frequentie, en kinetiek van spontane en-agonist opgeroepen calcium transiënten.
- Definieer piek amplitude van de Ca 2 + hoogte als de data punt met de hoogste intensiteit waarde (in gevallen van "multipeak" antwoorden gebruikt de eerste piek, zie figuur 2B).
- Bereken stijgtijd als het verschil tussen de reactie ontstaan en de tijd die overeenkomt met de piekamplitude. OPMERKING: 0 tot 100% stijgtijd moet worden gebruikt om voldoende gegevenspunten moet een tijdwaarde verkrijgen; scansnelheid is een belangrijke variabele here.
- Bereken latency als de tijdtussen het begin van agonist perfusie reactie ontstaan. Rise tijd kan een nuttige maatregel zijn in de hersenen plakjes, zo lang was-in tijden creëren een beschamen bij de berekening van reactietijden.
- Bepalen of er statistisch significante verschillen tussen de twee groepen van de parameters met onafhankelijke t-test van Student. Gebruik aantal astrocyten als de 'n'. Gebruik Pearson-chi-kwadraat test om de Ca 2 +-activiteit patronen tussen controlegroep en de testgroepen te vergelijken. Gebruik Fisher's exact 2-staart test om te vergelijken percentages van specifieke Ca 2 +-activiteit patronen tussen de controle-en behandelingsgroepen. Express verschillen * p <0,05, ** p <0,01 en *** p <0,001.
6. Opnemen Spontane en Gq GPCR Agonist opgewekte astrocyten Ca 2 + activiteit in hippocampus Slices
7. Analyse van Astrocyte Ca 2 + Activiteit
Representative Results
Representatieve resultaten in Figuur 3 tonen het effect van incubatie van acute muis hippocampale plakjes TTX 4-6 uur op sr astrocyten Ca 2 +-activiteit. Gegevens omvatten zowel spontane Ca 2 + transiënten en DHPG opgewekte groep I mGluR Ca 2 + reacties van plakken geïncubeerd in controle ACSF vs ACSF plus TTX. Anders dan basiskenmerk morfologische kenmerken, gestraalde proces assemblage en kleine soma grootte (~ 10 micrometer), zijn astrocyten die in de sr door overlay van de Ca 2 +-indicator OGB-01:00 met de selectieve astrocyten marker SR-101 19 20 ( Figuur 3A). De genummerde dozen over astrocytcellijnen lichamen overeen met de genummerde fluorescentie in de tijd sporen weergegeven in figuur 3B. De groep 1 mGluR-agonist (RS)-3.5-DHPG wordt toegepast op het specifieke schaal effecten groep 1 mGluRs in astrocyten bepalen. Om onderscheid te maken tussen Physiology in de specificiteit van de schaal effect groep 1 mGluRs versus andere Gq GPCR, is een cocktail van agonisten die aan het einde van elk experiment. Hier gebruikten we 10 uM elk van de GQ-GPCR agonisten histamine, carbamylcholine chloride (carbachol) en adenosine 5'-ATP dinatrium (Na-ATP). De agonist cocktail dient ook als een positieve controle levensvatbare, responsief astrocyten bepalen wanneer cellen niet reageren DHPG, waarschijnlijk omdat die bepaalde astrocyten niet voldoende hoeveelheden van de receptor tot expressie een reactie op DHPG wekken.
We gebruikten verschillende concentraties DHPG, waaronder 5 uM en 15 uM (Figuur 3B) en 30 uM en 50 uM (Figuur 4A) om te helpen bij het openbaren veranderingen in astrocytaire I mGluRs. De relatie tussen cellulaire Ca2 + responsen en Gq GPCR expressieniveaus eerder onderzocht vitro 21-24. Ten eerste, dedrempel te reageren op een bepaalde agonist concentratie afhankelijk van de dichtheid van receptoren door elke cel expressie. In een populatie van cellen, meer cellen reageren met Ca2 + verhoging aan een bepaalde concentratie van agonist wanneer de cellen worden getransfecteerd met hogere dichtheden receptoren. Na incubatie segmenten in TTX het percentage astrocyten in de populatie reageert op een vaste concentratie van agonist verhogingen (Figuren 3B en 3C). We hebben gevonden dat 5 pM en 15 pM DHPG onthullen duidelijke verschillen in het percentage reagerende astrocyten tussen het bedieningsorgaan en TTX behandelde cellen, terwijl 30 en 50 uM DHPG moeten I mGluR reacties vergelijken 5,0 mM K + behandelde versus controle cellen (Figuur 4A).
De relatie tussen astrocytaire Ca2 + reactiepatronen en agonist concentratie ook in situ onderzocht. Verhoging van de agonistconcentratie verschuift het patroon van de Ca 2 + reactie in astrocyten van enkele piek Ca 2 + verhogingen tot 2 + verhogingen 25-27 multipeak en plateau Ca. Op basis van deze eerdere bevindingen, voorspelden we dat de reactiepatroon op een concentratie van agonist zal veranderen wanneer er veranderingen in het niveau van receptor expressie. Aldus, afhankelijk van welke van de twee schalen werkwijzen wordt gebruikt (remmende neuronale of vooruit spelen), de concentratie van agonist nodig om een bepaalde respons patroon te produceren verhogen of verlagen. Bijvoorbeeld, astrocyten geïncubeerd in TTX verschuiven hun DHPG opgewekte Ca 2 + reactiepatroon meer plateau type Ca 2 + verhogingen en reageren op agonist concentraties vergeleken met astrocyten (figuur 3C) controle te verlagen. Rekening houdend met de eerdere studies suggereren deze waarnemingen dat de groep I mGluR receptor expressieniveaus in astrocyten toegenomen.
Stijgtijd en aanzet (latency) van de Ca2 + verhogingen zijn ook getoond om direct correleren met veranderingen in GPCR Gq expressieniveaus in gekweekte cellen 22-24. Hogere receptor expressie resulteren in kortere reactietijden en snellere stijgtijd terwijl vermindering receptordensiteit produceert het tegenovergestelde effect. Voor astrocyten geïncubeerd in TTX, Ca 2 + transiënten opgewekt door toepassing van DHPG hebben aanzienlijk sneller stijgen tijden vergeleken met astrocyten geïncubeerd in controle ACSF (Figuur 3D). Zoals eerder vermeld, amplitudes van agonist opgewekte Ca2 + responsen onveranderd ongeacht de agonist concentratie of het schaalmodel 15 (Figuur 3D).
Naast de waargenomen door direct activeren groepsveranderingen mGluRs I met DHPG, is spontane astrocyten Ca2 + is mede sterk beïnvloed door deze bewerking. We observerenda 2,26 voudige toename in het percentage spontaan actieve astrocyten geïncubeerd TTX versus controle. Dit is een toename van slechts 12,9% van de controle astrocyten vertonen spontane activiteit in de soma tot 42,1% in het TTX geïncubeerd astrocyten (figuur 3E). Omdat bekend is dat GPCRs Exhibit "intrinsieke" of constitutieve activiteit in afwezigheid van agonist 21, 26, 28, en dat het niveau van deze intrinsieke activiteit toeneemt met receptor expressieniveaus, suggereren deze gegevens dat de dichtheid van astrocytaire Gq GPCRs toeneemt na langdurige vermindering van neuronale actiepotentiaal afvuren. Soortgelijke-agonist opgewekte reacties, worden de stijgtijd van de spontane Ca2 + verhogingen toegenomen (figuur 3E).
Representatieve gegevens met behulp van het tweede protocol, incubatie in verhoogde extracellulaire kalium (5,0 mm), is weergegeven in Fi-guur 4. Een toename van extracellulaire K + 2,5-5,0 mM resulteert in een significante toename van de basale CA3 neuron actiepotentialen frequentie 15. Hogere concentraties DHPG (30 uM en 50 uM) zijn noodzakelijk groep I mGluR Ca2 + responsen opwekken van astrocyten geïncubeerd in hoge kaliumgehalte (Figuren 4A en 4B). Dit is consistent met een verlaagd niveau van groep I mGluR responsiviteit in astrocyten na een langdurige toename van neuronale actiepotentialen. Bovendien, de opgewekte responspatroon een vaste concentratie van DHPG verschuift van plateau-achtige reacties op zwakkere enkele piek responsen (Figuur 4B). Onderzoeken percentage spontaan actieve astrocyten in de twee kalium voorwaarden blijkt dat minder astrocyten geïncubeerd in hoge K + zijn spontaan actief vergeleken met de controlegroep (figuur 4C). Dit effect is in het Tegenovere richting van de TTX toestand waarin het percentage van de astrocyten vertonen spontane Ca 2 + verhogingen wordt verhoogd. Laatste, zowel opgeroepen en spontane Ca 2 + een hoogte hebben tragere stijging keer in astrocyten geïncubeerd in hoge K + ten opzichte van de controle conditie (figuren 4C en 4D). Genomen suggereren deze gegevens dat astrocytaire Gq GPCR expressie niveaus bidirectioneel schaal afhankelijk van het niveau van neuronale actiepotentiaal activiteit over een langere periode.
Figuur 1. Plak incubatiekamer fabricage en ingesteld. (A) De lade deel van een Brinkmann pipet opslagcontainer samen met luchtdicht deksel gebruikt worden om het deel incubatiekamer construeren. (B) Dril een gat in de zijkant van de houder ongeveer 1 ¼ van boven en ¼ vanaf de zijkant. Breng in een stuk flexibele buis. (C) Sluit de microloader verdeelstuk-inrichting aan het binneneinde van de flexibele buis. Opmerking cut-to-fit natuurlijke 200 ul pipet (witte pijl). (D) Zes 20 pi Eppendorf microloaders zijn cut-to-fit om een een-op-zes lijn spruitstuk een microloader-spruitstuk apparaat te creëren. (E) Boor twee kleine gaatjes aan het deksel. (F) Een Drijvende Bubble Rack voor het maken van de slice houder. (G) De onderste "poten" van de drijvende rek bel verwijderd zodat een stuk nylon mesh materiaal kan worden vastgelijmd aan de onderzijde. (H) Vul de incubatiekamer met voldoende hoeveelheid ACSF zodat de slice houder praalwagens. Pas de lengte van de leidingen, zodat de uiteinden van de microloaders kunnen rusten in een hoek van de kamer vloer. Bij het plaatsen van de incubatiekamer inhet waterbad, moet het waterniveau in het bad op hetzelfde niveau als de ACSF in de kamer. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Schatting van slice gezondheid. (A) Een gezond ogende hippocampus slice gebruik differentieel interferentie contrast (DIC) optiek. Gezonde segmenten hebben een glad, fluweelachtig uiterlijk en een hoog percentage gezonde CA1 pyramidale neuronen. Let op de apicale dendrieten uitsteken in stratum radiatum. Patch-clamp van neuronen die lijken op de hier getoonde onthullen een laag rustmembraanpotentiaal (-61 tot -62 mV) in de standaard 2,5 mM K + ACSF met weinig spontane actiepotentialen. Membraanpotentiaal en afvuren snelheid kan variëren als functie van exextracellulaire K + (Xie et al.. 15). Pijlen wijzen naar vermeende astrocyten. Afkortingen: sr, stratum radiatum; s.py., stratum pyramidale. Schaal bar, 10 micrometer. (B) Ongezonde schijfjes zal hebben een hoog percentage dode CA1 piramidale neuronen, die de verschijning van gebakken eieren (witte pijlen wijzen naar de kernen van dode neuronen - de "dooier" van het gebakken ei) hebben. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Opname versterkt Gq GPCR-activiteit en opgeroepen groep I mGluR Ca 2 + reacties na remming op lange termijn van neuronale AP door incubatie in TTX. (A) Vertegenwoordiger beelden van cellen in de field recording geïncubeerd in controle voorwaarden (bovenste panelen) of TTX (onderste panelen) die zich hebben genomen Oregon Green BAPTA-01:00 Ca 2 +-indicator kleurstof (linker panelen) en SR-101 (middelste panelen). Schaal bar is 10 micrometer. Overlay van beide signalen ("merge") geeft aan dat astrocyten lading met Ca 2 +-indicator. Dozen worden getrokken boven individuele astrocyten soma naar fluorescentie-intensiteit op te nemen in de tijd in het groene kanaal om Ca 2 +-activiteit in astrocyten te monitoren. (B) Monster sporen uit de kassa's in A) van Ca 2 + activiteit in de astrocyten. Astrocyten geïncubeerd in TTX vertonen verhoogde spontane activiteit en robuuster opgeroepen groep I mGluR Ca 2 + reacties zoals blijkt uit veranderingen in het patroon van de respons. Voorbeelden van enkele piek (cirkel), multipeak (rechthoek), en plateau (gestippelde rechthoek) Ca 2 + transiënten worden getoond. (C) Veranderingen in reactie patronen zijn vooral duidelijk met behulp van verschillende concentrantsoenen van de groep I mGluR agonist DHPG. Meer multipeak en plateau reacties zijn duidelijk na incubatie in TTX vergelijking met de controle bij een bepaalde concentratie agonist. (D) stijgtijd van DHPG opgewekte Ca2 + responsen sneller in astrocyten TTX geïncubeerd in vergelijking met de controlegroep (bovenste paneel), terwijl amplituden veranderen niet (onderste paneel), indicatief voor "alles-of-niets" reactie amplitudes eenmaal de drempel reactie is bereikt. (E) stijgtijd van spontane astrocyten Ca2 + transiënten ook sneller TTX geïncubeerd versus controle geïncubeerd astrocyten (bovenste paneel), terwijl het percentage astrocyten in de populatie vertoont spontane Gq GPCR Ca2 + activiteit toeneemt (onderste paneel). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Opname verminderd astrocytaire Gq GPCR-activiteit en opgeroepen groep I mGluR Ca 2 + reacties na langdurige toename van neuronale AP door incubatie in verhoogde extracellulaire kalium. (A) Vertegenwoordiger sporen van astrocyten Ca 2 +-opnamen uit plakjes geïncubeerd in 5,0 mM K + ACSF aan neuronen depolariseren en hun basale vuursnelheid vergelijking met ACSF (2,5 mM K + ACSF) controleren. Astrocyten geïncubeerd met 5,0 mM K + ACSF vertonen minder spontane somatische Ca 2 + transiënten en zwakkere DHPG reacties van de consument ten opzichte van astrocyten geïncubeerd in controle ACSF. (B) Een vergelijking van patronen van reacties van de consument om meerdere concentraties DHPG openbaart zwakkere soorten respons na langdurige toename in neuronale AP. (C) Een verlaging van het gehalte van astrocyten in het population vertonen spontane Ca 2 +-activiteit wordt waargenomen na langdurige incubatie in verhoogde K + in vergelijking met ACSF (bovenste paneel) te controleren, terwijl opkomst tijden van de spontane activiteit trager (onderste paneel). (D) Rise tijden van evoked astrocyten Ca 2 + reacties op verschillende concentraties van DHPG trager na 5,0 mM K + behandeling in vergelijking met astrocyten geïncubeerd in controle ACSF. Klik hier voor grotere afbeelding.
Discussion
De beschreven schaalvergroting modellen vertegenwoordigen praktische methoden voor het onderzoeken van de lange termijn plasticiteit van astrocytaire groep I mGluRs. Imaging spontane en uitgelokte Ca2 + gebeurtenissen verschaft een gevoelige test voor het meten van veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit, zoals duidelijk bewijs is vastgesteld dat astrocyten Ca2 + verhoging optreden bij ontslag uit IP 3R-gevoelige winkels stroomafwaarts van Gq GPCR activering 10, 12, 17, 18. Het percentage van astrocyten in de bevolking reageert op groep I mGluR agonist en het patroon van dergelijke Ca 2 + reacties rapporteren veranderingen in groep I mGluRs door astrocyten.
De specifieke techniek die gebruikt astrocyten geladen met Ca 2 +-indicator is een belangrijke overweging bij het ontwerpen van experimenten om te zoeken naar veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit. Bolus-laden of bulk laden meerdere astrocyten, of patch-clamp laden van individuele astrocyten kunnen worden gebruikt om beelden Ca2 + transiënten in astrocyten. Elke benadering heeft bepaalde voordelen en nadelen. Direct vullen astrocyten met Ca 2 +-indicator via patch clamp maakt eenduidige identificatie van de cel als een astrocyten zonder behoefte aan een secundaire marker zoals SR-101. Patch-clamp levering indicator maakt ook opname van Ca2 +-activiteit van kleine astrocytaire compartimenten inclusief Borstelig fijne processen mogelijk dieper in het segment waar de cellen gezonder en met meer intacte interacties met synapsen (afhankelijk van het laservermogen beschikbaar). Echter, patch-clamp laden kampen met een lage doorvoersnelheid als gegevens worden verzameld een cel tegelijk. Bulk-laden, daarentegen kan een groot aantal astrocyten worden geladen met Ca2 + indicator gelijktijdig afgebeeld. Slechts astrocyten nabij het oppervlak (<20 urn) van het segment zijn geladen, met bijbehorende bezorgdheids over gezondheid cel en intact synapsen.
De tegendruk bolus-loading protocol hier gepresenteerde biedt een middenweg, met relatief hoge capaciteit en het vermogen om Ca2 + te monitoren dieper in de plak (40-75 urn). Een aanzienlijke toename van het percentage spontaan actieve astrocyten met de bolus-loading techniek waargenomen vergeleken met bulk-loading, suggereert dat de verbindingen tussen neuronen synapsen en astrocytaire processen vollediger 15. Met goede lading, kan men vaak controleren Ca 2 + activiteit hoofdprocessen van astrocyten (gegevens niet getoond) of kan zelfs kleinere compartimenten met 2-foton microscopie. Echter, zorg zou moeten worden uitgeoefend in het toewijzen van de kleinere processen om een bepaalde astrocyten, zoals de grenzen opgaan in de niet-specifieke achtergrond kleuring. Een bijkomend probleem bij het gebruik van bulk-laden of bolus-laadprocedures is de behoefte aan een tweede marker voor astrocyten identificatie. Hoewel het is vele jaren bekend dat astrocyten duren voorkeur van AM ester Ca2 + indicatoren wordt de tweede marker SR-101 vaak gebruikt om het geladen cellen zoals astrocyten verifiëren. SR-101 kan op zichzelf veranderen de intrinsieke prikkelbaarheid van neuronen 29. Gebruik van SR-101 bevestigt de noodzaak alle astrocyten Ca2 + metingen in TTX mogelijke SR-101 effecten op neuronale exciteerbaarheid beperken. Aangenomen dat zowel controle en experimentele groepen omvatten SR-101, moet de marker op zichzelf geen rekening met de effecten waargenomen in astrocyten Ca2 +-signalen na langdurige manipulatie van neuronale actiepotentialen. SR-101 kan meer een zorg in hoge K + experimenten, maar omdat het verschil tussen 2,5 mM K + vs verminderen 5,0 mM K + als het basale vuursnelheid niet proportioneel gewijzigd.
Een veelbelovende aanpak van Ca 2 + leveren Ca2 + kleurstoffen. Grote vooruitgang is geboekt in de afgelopen jaren met genetisch gecodeerd calcium indicatoren (GECIS) gericht op astrocyten 30-32. GECIS kan tot astrocyten worden geleverd door in vivo micro-injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in een gebied van de hersenen van belang, zoals de hippocampus. Expressie van GECIS wordt bereikt na ongeveer twee weken na virale infectie 32. Er zijn vele voordelen zijn aan het gebruik van GECIS in astrocyten. Eerst worden de vectoren gericht op astrocyten met een astrocyt-specifieke promoter, zodat de gelabelde cellen astrocyten 32. Ten tweede, de ruis signaal-lijkt nu vergelijkbaar met wat kan worden verkregen met behulp van patch-clamp levering van kleurstof, maar zonder het invasieve karakter van een patch pipet op de cel 32 hebben gehad. Ten derde kan de indicatoren delivered en uitgedrukt in volwassen weefsel, wat problematisch is met behulp van bulk-loading levering methoden. Verder is de uitdrukking is mozaïek, het aanbieden van de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen meerdere astrocyten. Aldus verschillende astrocyten kan mogelijk worden tegelijk afgebeeld, terwijl ook het opnemen in de soma en fijne vertakkingen op hetzelfde moment. Daarom zou kunnen een enkele techniek worden gebruikt in plaats van drie afzonderlijke technieken (bulk-loading, bolus-laden, en patch-clamp lading) te schalen activiteit van astrocytaire Gq GPCRs opnemen, aanzienlijke verhoging van efficiëntie.
Een potentieel nadeel van het gebruik van virale-gemedieerde levering van Ca 2 +-indicatoren om astrocyten is het mogelijk effect op de gezondheid slice 32. De adeno-geassocieerde virale vectoren gebruikt om de GECIS leveren zijn eerder aangetoond reactieve gliosis van astrocyten 33 veroorzaken. Voorbereiding van de hersenen plakjes in het algemeen waarschijnlijk initieert vroege stadia van de pathologie waaronder release van inflammatory moleculen 10. Daarom gecombineerd met lange incubatietijden vereist schaling van astrocytaire receptoren induceren, gebruik van GECIS geleverd met behulp van virale vectoren zouden moeten extra aandacht krijgen in de context van segment gezondheid in dit soort experimenten.
Bij toepassing van dit protocol is het belangrijk om in gedachten te houden dat de inwerktijd voor agonist een respons zal variëren als een functie van de beschikbaarheid receptor. Voor een bepaalde concentratie van agonist, zal de verwerkingstijd te langer als receptoren verkleind en korter als receptoren opgeschaald voor het geneesmiddel voldoende concentratie te bereiken in het weefsel voldoende receptoren activeren om een Ca 2 + produceren respons. Daarom kunnen geneesmiddelen verwerkingstijden en eventueel de concentratie moeten worden aangepast afhankelijk van de beoogde richting van de schaal. Zo moet de agonist concentratie worden verlaagd in de case van TTX om te voorkomen dat het verzadigen van de reacties, en de toegenomen na incubatie plakjes in een hoge K + tot zelfs een reactie. Specifiek werd de DHPG concentratie verschoven van 5-15 uM TTX na behandeling met 30-50 pM na 5,0 mM K + behandeling teneinde Ca2 + reactiepatronen bestuderen, zoals 5-15 uM vaak te laag om betrouwbare reacties produceren astrocyten na afbouw van groep I mGluRs.
Opname van Ca 2 + astrocyten activiteit geeft geen direct bewijs van receptor internalisatie of insertie van of naar de plasmamembraan. Op basis van de opmerkelijke gelijkenis van de gegevens met die van eerdere studies in vitro waarin de directe relatie tussen Gq GPCR expressieniveaus en spontane onderzocht en uitgelokte Ca2 + transiënten 21-24, het meest logische interpretatie van de wijzigingen in Ca 2 + signalering dat de astrocyt oppervlak receptor expressie niveausgewijzigd. Een complementaire aanpak kan een belangrijke overweging zijn als men wil om aanvullend bewijs te verstrekken over de plaats van het effect op de Ca 2 +-activiteit. Een strategie die wij gebruikten was het effect van TTX incubatie op hippocampale plakken van astrocytaire MrgA1R muizen onderzocht. Deze transgene muizen brengen een buitenlandse Gq GPCR (het MrgA1R) alleen in astrocyten. Omdat deze receptor is niet afkomstig van de hersenen, is er geen endogene neurotransmitter aanwezig om zijn activiteit te veranderen. Vorige werk gesuggereerd dat deze receptor aangrijpt dezelfde intracellulaire signaalmoleculen als endogene groep I mGluRs in dezelfde astrocyten 34. Na langdurige incubatie van segmenten van MrgA1R muizen in TTX geen verschillen in-agonist opgewekte MrgA1R responsen in vergelijking met hetzelfde nest controle geïncubeerd segmenten zou aantonen dat het effect van astrocyt Ca2 + activiteit door veranderingen gelokaliseerd aan de oppervlakte receptor, vooral als groep I mGluR reacties zijn nog steeds significantly versterkt dezelfde astrocyten. Een alternatief, hoewel misschien meer betrokken strategie zou zijn om astrocyten isoleren van de plakken voor Western blot-analyse, zolang een membraanfractie kan worden geanalyseerd op veranderingen in de oppervlakte receptor expressieniveaus. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of flowcytometrie kan hier nuttig zijn.
De mogelijke toepassingen van deze techniek voor de studie van neuronen, astrocyten en astrocyt-neuronale interacties velen. In onze experimenten alleen DHPG opgewekte groep I mGluR astrocytaire Ca2 + responsen werden bestudeerd in geïsoleerde acute hippocampale plakken van jonge muizen. Dit preparaat heeft niet alleen intacte afferenten (Schaffer collateralen), maar ook neuronen die leiden tot hun (CA3 pyramidale cellen), waardoor aan het afvuren tarieven van deze glutamaterge neuronen manipuleren op de postsynaptische cellen (CA1 pyramidale cellen) en de astrocyten in stratum radiatum wiens processen geassoe met deze synapsen. De acute hippocampus slice niet de beste voorbereiding voor het manipuleren afvuren bekijken van andere soorten neuronen echter zoveel afferente vezels worden gescheiden van de neuronen die leiden tot hen. Toch kan het mogelijk in bepaalde slice preparaat plasticiteit andere astrocytaire Gq GPCR subtypen zien. Bijvoorbeeld zou segmenten worden bereid met basale voorhersenen cholinerge neuronen en hun uitsteeksels intact hippocampus. Incubatie van deze segmenten in TTX of verhoogde K + zou beïnvloeden basale werkingsveld van cholinerge neuronen, waardoor schaling van mAchRs in astrocyten stratum Oriens, die een aanzienlijk deel van de cholinerge ingang 1 ontvangen. Een alternatieve benadering nog niet geteste studeren astrocytaire receptor schaal binnen een bepaald gebied van de hersenen, met alle verbindingen intact terwijl schaalvergroting optreedt, kan een in vivo model waarbij een vertraagde afgifte van TTX wordt verkregen door implantatie van een plast gebruikenic polymeer Elvax 40W boven de regio van belang 35. Deze benadering is eerder gebruikt in een studie van neuronale schalen maar ook voor astrocytaire schaling. Tot slot, met de juiste uitlezing, toekomstige studies zouden andere GPCR families, waaronder veranderingen in G s of G i GPCR's te onderzoeken. Men zou astrocytaire GABA B G voorspellen i GPCR's worden beïnvloed volgende remming van de vuren in lokaal projecteren GABA interneuronen binnen een slice voorbereiding. Ontwikkeling van nieuwe indicatoren richten andere signaalmoleculen, zoals een real-time indicator van de second messenger cAMP, zou opent een heel nieuw gebied van onderzoek naar neuron-to-astrocyten receptor communicatie.
Bidirectionele schaling van astrocytaire mGluRs door manipulatie van basale neuron vuren tarieven biedt een maatstaf voor de gevoeligheid van astrocyten om AP-gemedieerde afgifte van neurotransmitter. Astrocyten kan blijkbaar voelen spontane AP's en glutamate vrijkomen ten Schaffer onderpand-CA1 pyramidale cel synapsen zelfs wanneer extracellulaire K + is binnen een fysiologische bereik. Terwijl acute toepassing van TTX niet de frequentie van spontane astrocyten Ca 2 +-activiteit 18, 36, 37, de Ca2 + activiteit onder de astrocyten in de populatie wordt gedecorreleerde 36, waarin wordt aangetoond dat astrocytaire receptoren AP detectoren verminderen. Dit suggereert dat astrocyten voelen spontane neuronale AP's zonder invloed op hun algemene Ca 2 +-activiteit. Het is algemeen aanvaard dat de intracellulaire concentraties van IP-3 moet een drempelwaarde om IP 3 Rs voldoende stimuleren om tot een detecteerbare Ca 2 + hoogte bereiken. Kan spontane neuronale AP activeren astrocytaire GPCR's zonder dat meetbare Ca 2 + verhogingen? Toekomstige studies zouden Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) of een soortgelijke techn gebruiken ique (zoals BRET) de verhouding tussen G-eiwit koppelen aan de receptor (een maat voor receptor activatie) en Ca2 + afgifte uit interne opslag te onderzoeken. BRET is uitgebreid gebruikt in vitro G-eiwit naar GPCR koppeling 38 detecteren, hoewel het enige tijd kan duren voordat deze technologie beschikbaar voor gebruik in intact weefsel preparaten. Het is mogelijk dat astrocytaire Gq GPCRs worden geactiveerd veel vaker dan kan worden opgenomen met de momenteel beschikbare Ca 2 + imaging-tools. Naast sensing actiepotentialen, kan astrocytaire Gq GPCRs ook kunnen miniatuur quantale afgifte van neurotransmitter detecteren zoals gerapporteerd in een recente studie 39. De bidirectionele schaling hier beschreven methode kan worden gebruikt in toekomstige studies een maat voor de mate waarin astrocytaire Gq GPCRs detecteren quantale vesiculaire afgifte van neurotransmitter, door het opnemen van bafilomycine A1 incubatie protocol verschaffen.
ntent "> Tot dusverre de schaal protocollen slechts bij hippocampale plakken aan juveniele muizen (p12-p18). Daarom is nog onbekend of astrocytaire receptor schaalverdeling kan ook worden geïnduceerd in weefsel verkregen uit volwassen muizen. Een boeiende recente studie stelt I mGluR expressie in astrocyten vermindert aanzienlijk na de eerste week en blijft dalen tot volwassenheid, met zeer lage niveaus van receptor expressie in volwassen astrocyten 40. Het zou dan ook interessant zijn om te bepalen of astrocytaire mGluRs opschalen na lange remming van de neuronale in volwassen muis hippocampus plakjes tot vrijwel die gezien in astrocyten van juveniele muizen termijn. Deze bevinding suggereert dat astrocytaire receptor expressie is niet statisch op een bepaalde leeftijd, maar kan snel veranderen, afhankelijk van niveaus van neuronale activiteit. In tegenstelling tot verminderde expressie van groep I mGluRs in volwassen muizen, is het bewijs in opkomst dat adrenerge receptoren, met inbegrip van & #945, 1A, 2A α en β 1 subtypes, worden voornamelijk uitgedrukt door astrocyten in de volwassen hersenen 3, 4. De α 1A adrenergische Gq GPCR kan een aantrekkelijk doelwit voor toekomstige studies neuron naar astrocyten communicatie, inclusief of deze receptoren zijn gevoelig voor adrenerge neuronen vuren tarieven.Disclosures
De auteurs willen onthullen dat de tetrodotoxin gebruikt in deze studies werd gekocht van Abcam. Abcam had geen betrokkenheid bij de hypothesen, ontwerp, of het verzamelen van gegevens. Alle communicatie met betrekking tot sponsoring van het werk van Abcam opgetreden na het peer review proces was voltooid.
Acknowledgments
De auteurs willen graag UC Riverside Center for Gliale-neuronale interacties voor waardevolle discussie over de schaalvergroting protocollen en data te erkennen. De auteurs willen ook graag een oprecht bedankje geven aan Abcam voor het sponsoren van de publicatie van hun werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber Supplies | |||
| Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
| Electrical drill | |||
| Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
| Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
| Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
| Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
| One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
| Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
| 600 µm Sefar Nitex Nylon mesh | ELKO Filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
| Krazy Glue | For slice holder | ||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| KCl | Fisher | P333-500 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
| Glucose | Fisher | Fisher | |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
| Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
| Tetrodotoxin citrate (TTX) | Abcam | ab120055 | |
| Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Abcam | ab120020 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
| Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Dissection Tools | |||
| Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
| Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
| Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
| Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
| Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
| Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
| Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
| Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
| Polystyrene 100 mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
| Vibratome | Leica | VT 1200S | |
| Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
| Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
| Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
| Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |
References
- Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices. J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).
- Navarrete, M., Araque, A. Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication. Neuron. 57, 883-893 (2008).
- Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo. Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).
- Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2. Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).
- Porter, J. T., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals. J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).
- Bernardinelli, Y., et al. Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus. J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Wang, X., et al. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. Sorting out astrocyte physiology from pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).
- Agulhon, C., et al. Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes. Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).
- Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
- Nizar, K., et al. In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase. J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).
- Sutton, M. A., et al. Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis. Cell. 125, 785-799 (2006).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57, 819-826 (2008).
- Xie, A. X., et al. Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).
- Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity. J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).
- Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).
- Prezeau, L., et al. Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).
- Shao, Y., McCarthy, K. D. Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells. Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).
- Wang, S. S., Thompson, S. H. Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics. Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).
- Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization. Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).
- Shelton, M. K., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ. J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).
- Hermans, E., Challiss, R. A. Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors. Biochem. J. 359, 465-484 (2001).
- Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ. Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).
- de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).
- Kang, J., et al. Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Fiacco, T. A., et al. Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity. Neuron. 54, 611-626 (2007).
- Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence. PLoS One. 2, (2007).
- Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ. J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).
- Takata, N., Hirase, H. Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo. PLoS ONE. 3, e2525 (2008).
- Salahpour, A., et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).
- Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).
- Sun, W., et al. Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult. Science. 339, 197-200 (2013).
