Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Published: March 20, 2014 doi: 10.3791/51458

Summary

Her beskriver vi en tilpasning af protokoller, der anvendes til at fremkalde homøostatisk plasticitet i neuroner til studiet af plasticitet astrocytic G-protein-koblede receptorer. Senest anvendt til at undersøge ændringer i astrocytisk gruppe I mGluR'er med unge mus, kan anvendes den metode til at måle skalering af forskellige astrocytiske GPCRs, i væv fra voksne mus in situ og in vivo, og for at få en bedre forståelse af følsomheden af astrocytiske receptorer ændringer i neuronal aktivitet.

Abstract

Tæt på to årtiers forskning har fastslået, at astrocytter in situ og in vivo udtrykker mange G-protein-koblede receptorer (GPCR), der kan blive stimuleret af neuron-frigivet transmitter. Imidlertid har evne astrocytiske receptorer at udstille plasticitet som reaktion på ændringer i neuronal aktivitet fået lidt opmærksomhed. Her beskriver vi en model, der kan bruges til globalt at skalere op eller ned astrocytisk gruppe I metabotrope glutamatreceptorer (mGluR'er) i akutte hjernesnit. Inkluderet er metoder til, hvordan man forbereder parasagittal hippocampusskiver, konstruere kamre er egnet til langsigtet skive inkubation bidirektionalt manipulere neuronal handling potentiale frekvens, load astrocytter og astrocyt processer med fluorescerende Ca 2 +-indikator, og måle ændringer i astrocytisk Gq GPCR aktivitet ved optagelse spontan og fremkaldte astrocyt Ca 2 + begivenheder ved hjælp af konfokal mikroskopi. I det væsentlige, en "calcium roadmap "er fastsat i, hvordan man måler plasticitet astrocytic GQ GPCRs. Anvendelser af teknik til undersøgelse af astrocytter diskuteres. Have en forståelse af, hvordan astrocytisk receptor signalering er påvirket af ændringer i neuronal aktivitet har stor betydning for både normal synaptisk funktion samt processer tilgrundliggende neurologiske lidelser og neurodegenerative sygdomme.

Introduction

Astrocytter reagere inden for få sekunder til stimulering af neuroner eller neuronale axoner med stigninger i cytoplasmatisk Ca 2 + følge næsten udelukkende fra aktivering af astrocytic GQ GPCRs. For eksempel muskarine acetylcholinreceptorer 1, cannabinoidreceptorer 2, α 1A adrenerge receptorer 3, 4 og gruppe I-mGluR'er (se nedenfor), er alle astrocytic Gq GPCR undertyper, der akut reagerer på neuronal aktivitet. Aktivering af astrocytisk gruppe I-mGluR'er er blevet vist mest omfattende, efter stimulering af neuronale glutamaterge afferenter in situ (såsom akutte hippocampusskiver) 5-7, såvel som hos voksne mus cortex in vivo efter sensorisk stimulation 8. Resultatet af aktivering af astrocytisk Gq GPCR signalering på biologi og fysiologi astrocytter, neuroner, eller astrocyt-neuron interaktioner har været et spørgsmål om debat 9-12. Det vil være sogle tid, før funktionen af ​​neuron-til-astrocyt-receptor signalering er fuldt forstået.

Mens det er klart, at neuroner kan aktivere astrocytiske receptorer ved hjælp af forsøgsprotokoller, der er aspekter af neuron-til-astrocyte receptor kommunikation, der fortsat er dårligt forstået. Først, den faktiske mængde neuronal aktivitet, der kræves for at aktivere astrocytisk Gq GPCRs ikke veldefineret, og for det andet har den evne astrocytiske receptorer at udstille brug afhængige plasticitet fået lidt opmærksomhed. Til at begynde at behandle disse spørgsmål, vi for nylig udviklet en protokol til at fremkalde tovejs skalering af astrocytisk gruppe I mGluR'er i akutte juvenil hippocampusskiver svar på langsigtede ændringer i neuronal handling potentiale (AP) er afhængige synaptisk aktivitet. Svarende til hvad der er blevet opdaget for tovejs homeostatiske plasticitet neuronale ionotrope glutamatreceptorer 13, 14, astrocytisk gruppe I-mGluR'er optrappe following blokade af neuronale virkningspotentialer og skalere ned, når neuronal handling potentiale frekvensen øges 15. Disse kan måles kompenserende ændringer i astrocytiske receptorer ved at optage spontane og fremkaldte astrocyt Ca 2 + transienter og sammenligne egenskaberne for disse begivenheder til dem fra astrocytter i kontrol forhold. I dette manuskript, beskriver vi den fuldstændige metode til brug af denne protokol, herunder udarbejdelse af akutte hippocampusskiver, inkubationsbetingelser at fremkalde astrocyte receptor skalering, astrocyte Ca 2 + indikator farvestof lastning, Ca 2 + billeddiagnostiske teknikker, der anvender konfokal mikroskopi, og de ​​forventede virkninger på astrocyt Gq GPCR-aktivitet. Forudsigelige effekter på astrocyte Ca 2 + signalering egenskaber - der matcher dem, der tidligere er optaget i dyrkede celler transficeret med forskellige ekspressionsniveauer af GQ GPCRs - give en "køreplan", der kan bruges i fremtidige undersøgelser for at analysere for ændringer i såtrocytic GPCR udtryk. Forgreninger og potentielle anvendelsesmuligheder for brugen af ​​denne teknik vil bidrage til vores forståelse af astrocyt-neuronale interaktioner i sunde og syge hjerne.

Protocol

De procedurer, der følger er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of California, Riverside.

1.. Konstruktion af rugekammeret og Slice Holder

  1. Konstruktion rugekammeret: Konstruer rugekammeret fra materiale, der er ugiftige. Sørg for, at kammeret har kontrolleret luftcirkulation, har en tilstrækkelig mængde af ACSF for et udsnit indehaveren til at flyde, og er stor nok til, at den skive indehaveren kan flyde i den ene ende af kammeret, mens gassen spredning fra ilt linjer forekommer i anden ende. Skuffen del af en pipette lagerbeholder med lufttæt låg (figur 1A) passer disse kriterier pænt.
    1. Bore et lille hul på siden af ​​beholderen omkring 1 ¼ ovenfra og ¼ fra siden. Monter et stykke fleksibel slange gennem hullet (fig. 1B). Vær omhyggelig med at bore så lav, at slangen ikke skal komprimeres, når låget er lukket, men høj nok, så det er over løsningen.
    2. Påfør silikone søm fugemasse ("akvarium sømtætningsmiddel") for at skabe en vandtæt forsegling mellem ilt linje og kammeret.
    3. Forbind "udenfor" ende af slangen til en gasbeholder (95% oxygen, 5% carbondioxid) ved anvendelse af en han-Luer-fitting. For en custom fit, cut-til-passe en naturlig skrå 200 ul pipettespids (figur 1C).
    4. Forbind "inde i" ende af slangen til en én-til-seks linje plast manifold. Cut-to-fit seks 20 ul Eppendorf microloader pipettespidser til hver manifold ind (figur 1D). Den fine åbning af microloaders er ideel til fremstilling af en jævn strøm af små bobler.
    5. At give mulighed for ventilation, bore to små huller på låget af beholderen (figur 1E).
  2. Konstruktion skive hældre: skive holderen er lavet af en Floating Bubble Rack (fig. 1F).
    1. Fjern de nederste "ben" af boblen rack, og skære toppen til ca 1 ¾ i.
    2. Lim et stykke nylon mesh materiale til bunden af det runde rack hjælp cyanoacrylatlim (såsom standard Krazy lim) til at oprette en otte-brønds skive holderen (figur 1G). Hver brønd kan passe en enkelt mus hippocampus skive.
    3. Monter den skive holder i den ene ende af rugekammeret og microloader-manifold apparat i den anden ende. Lad microloader tips til at hvile på kammeret gulvet (figur 1 H). Denne opsætning er designet til at sikre tilstrækkelig iltning til både toppen og bunden af ​​akutte hippocampusskiver, og for at undgå bobler kommer ud direkte under den skive indehaveren for at minimere skive agitation og forhindre direkte kontakt af bobler med hippocampusskiver.
    4. Skyl inkubationstiderne kamre end slice indehavere grundigt med ddH2O efter hvert forsøg, og rense med 70% EtOH ugentligt. I tilfælde af at inkubere skiver i forskellige løsninger, vil være behov for flere kamre / slice holdere.

2. Løsninger og narkotika

  1. Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF): Forbered 4 L standard ACSF i ddH2O hjælp af følgende (i mm): 125 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose og 0,1 Trolox. Mål osmolaritet løsning med en osmometer, det skulle komme til ~ 310 mOsm. ACSF kompositioner for eksperimentelle betingelser er beskrevet nedenfor (se protokol 3). Alle opløsninger filtreres ved hjælp af et 0,22 um flaske-top filter i autoklaveres glasflasker. Opløsninger er stabile i 4 ° C i op til en måned.
  2. Udskæring Puffer: Forbered skiver anvendelse af en modificeret ACSF indeholdende (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 3,8 mgCl 2, 1,25 NaH 2PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose og 1,3 ascorbinsyre. Mål osmolaritet løsning med en osmometer, det skulle komme til ~ 310 mOsm. Udskiftning af CaCl2 med MgCl2 i udskæring buffer forbedrer skive sundhed.
  3. Sulforhodamin 101 (SR-101, 1 uM) bruges til at identificere astrocytter i akutte hippocampusskiver. Lav en 1 mM bestand af SR-101 ved at fortynde 60,67 mg SR-101 i 100 ml af en modificeret lavt calcium ACSF fremstilles som følger (i mm): 125 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO4, 26,0 NaHCO3, 15 glucose og 1,3 ascorbinsyre. Kontroller, at osmolaritet lavt calcium ACSF er ~ 310 mOsm. Fortynd 1 mM SR-101 lager 1.000 gange i modificeret lav Ca 2 + ACSF til ilægning. Opbevar den endelige SR-101-opløsning i 4 ° C og beskyttet mod lys, indtil nødvendig for forsøget.

3. Manipulation af Long Term neuronfyring priser i Akut hippocampusskiver

Brug en af ​​to inkubations protokoller i separate eksperimenter for at manipulere langsigtede neuronfyring satser:

  1. Spær neuronfyring: Inkubér i tetrodotoxin (TTX, 1 uM): ADVARSEL: Håndter TTX med forsigtighed, da det kan være fatalt, hvis det indtages i tilstrækkelige mængder. Handsker og beskyttelsesbriller anbefales. TTX helt afskaffer AP-drevet neuronfyring i akutte skiver. Inkuber skiver i 3,5 mM K + ACSF, plus 1 uM TTX i den eksperimentelle tilstand. I kontrolgruppen tilstand inkuberes skiver i 3,5 mM K + ACSF uden TTX. Sammenligningen mellem de to betingelser afslører opskalering effekt i astrocytisk Gq GPCR aktivitet. 3,5 mM K + ACSF tjener som kontrol tilstand (i modsætning til at sige, 2,5 mM K +) for at maksimere effekten af TTX behandling.

- ELLER -

  1. Forøg neuronfyring overbasalrater: Inkubér i høj kalium: Stigende ekstracellulær K + koncentration depolariserer neuroner og øger deres basale skudhastighed. Inkubation i 5,0 mM K + ACSF væsentligt hæver neuronal handling potentiale frekvens i forhold til 2,5 mM K + ACSF 15. Inkuber skiverne i 5,0 mM K + ACSF for den eksperimentelle betingelse, og til kontrol tilstand, inkuberes skiver i standard 2,5 mM K + ACSF. Sammenligningen mellem de to betingelser afslører ned-skalering effekt i astrocytisk Gq GPCR aktivitet.

4.. Akut hippokampalskivekulturer Fremstilling

  1. Opsætning af varme opsving kammer:
    1. Varm vandbad til 35 ° C, og derefter placere de tilberedte inkubations kamre inde. Fyld vandbad med vand op til højden af ACSF inden inkubations kamre (figur 1G).
    2. Ilte eksperimenterende og kontrol ACSF med 95% O 2, 5% CO 2. Boblerne der udsendes fra microloader-manifold apparat skal være lille og rigelige men også blid, og der bør ikke være nogen synlig bevægelse af ACSF i kammeret.
  2. Opsætning af iskolde dissektion kammer:
    1. Tag to spande is. Placer en flaske på ca 300 ml udskæring buffer i en spand med is og holde det iltet med 95% O 2, 5% CO 2 for 20 min. Nedsænk en 100 mm petriskål i den anden isspand, lige under overfladen af ​​is. Sørg for den side af petriskålen er i direkte kontakt med isen. Hæld lidt udskæring buffer i petriskålen og holde det iltet så godt.
    2. Chill forkant med single-kant barberblad ved at nedsænke det i iskold udskæring buffer i petriskålen i mere end 1 min.
  3. Vibratome opsætning:
    1. Tænd vibratome og sørg for dræning er lukket.
    2. Fastgør skærekammeret i vibratorentome og pakisen omkring skærekammeret. Forkøling den til 0-4 ° C.
    3. Fjern fabrik fedt fra dobbelt barberblad ved opblødning i 70% EtOH i 5 minutter og derefter skylning med ddH2O. Skær den i to halvdele omhyggeligt (bøj ikke bladet), og montere den ene halvdel klinge på skæring blok.
  4. Fjernelse af mus hjerne:
    1. Bedøver en tolv til atten dage gammel C57BL/6J mus i et lille kammer, præinstalleret med 0,5 ml isofluran gennemblødt ind i en Kimwipe eller vat. Klem forsigtigt dyrets tæer at sørge for der er ingen smerter refleks.
    2. Halshugge musen ved hjælp af en skarp saks, og derefter fjerne hovedbunden ved hjælp af små pincet. Brug lille knogle saks til at klippe kraniet fra cerebellum til olfaktoriske pærer langs den langsgående revne. Fjern kranie flapper med den lille pincet. Fjern forsigtigt hjernen med en spatel, og oversvømme det i iskold iltet udskæring buffer i petriskål.
    3. Bisect musehjerne med kølet barberblad i petriskålen for at tillade mere overfladeareal til køling og iltning. Lad gennemskæres halvkugler sidde i iskold udskæring buffer for 2-3 min. Hjernen bør blive helt køligt og mere solid.
  5. Påfør et tyndt lag af cyanoacrylat lim på platformen af ​​vibratome. Lim begge halvkugler til platformen skære side-down og laterale sider op, med lugtekolben vender fremad. Fastgør platformen i skærekammeret, derefter udfylde skærekammeret med iskold, veliltet udskæring buffer.
  6. Fortsæt ilte skærekammeret mens forbereder 300 um tykke parasagittal skiver vha. vibratome. Skær skiverne ved en frekvens på 85 Hz, en kørehastighed på 0,20 mm / sek og en amplitude på 1,40 mm. BEMÆRK: Vi har fundet, at den allervigtigste variabel i forberede sunde akutte hippocampusskiver er kvaliteten af ​​vibratome. Vores laboratorieformål Leica VT 1200 S magnetic drev vibratome med VibroCheck at reducere "z" vibration.
  7. Efter skæring, dissekere hippocampus og den tilstødende entorhinal cortex fra hver parasagittal udsnit ved hjælp af skarpe pincet. Udfør denne procedure i det iskolde, godt iltet udskæring buffer i skærende kammer vibratome. Skarpheden af ​​tangen er meget vigtigt for den skive helbred, da det minimerer håndtering af skiver.
  8. Lav en overførsel pipette ved at brække den lange spids af et glas Pasteur pipette og topping den knækkede del med en pipette pære. Dette muliggør anvendelse af den store ende af pipetten for at overføre skiver. Sørg for at bestille pipetter uden bomuld stik i den store ende (se Materialer tabel). Da skiverne er udarbejdet i ikke-sterile forhold, er det ikke nødvendigt at autoklavering pipetten før brug, selv om en ny pipette bør udarbejdes og anvendes ved hvert forsøg.
  9. Overfør hver hippocampalt snit til inkubations kamre i 35 ° C vandbad, ved at dyppe overførselspipetten ind i ACSF inde hver brønd på skive holderen og aspirere udsnittet. Minimere bevægelse af skive under denne proces. Direkte overførsel af skiverne til de varme inkubation bad resulterer i bedre kvalitet skiver end "rampe" temperaturen op gradvist.
  10. Lad hippocampusskiver at inddrive i det varme vandbad i alt 45 minutter, fordelt som følger: Inkubér skiver i 20 min i 1 uM SR-101 fortyndet i lavt calcium ACSF og derefter overføre dem til den lave calcium ACSF (uden SR-101) i 10 min. Efterfølgende overføres skiverne til at styre eller eksperimentel ACSF for de resterende 15 minutter af den varme inkubation.
  11. Efter 45 min varm opsving, omhyggeligt flytte inkubations kamre fra 35 ° C vandbad til bænken toppen, og derefter lade skiverne at fortsætte med at inkubere ved stuetemperatur i en total inkubationstid på 3 timer, før du begynder bolus-loading protokollen (se nedenfor).
  12. 5.. Bolus Belastning af Astrocytes med Ca 2 + Indikator

    1. Forberedelse Ca 2 + indikator bolus-loading dye:
      1. Til hvert hætteglas af farvestof (50 ug) tilsættes 3.87 pi frisk dimethylsulfoxid (DMSO) og vortex grundigt. Friskhed af DMSO er vigtig for en god læsning, og derfor crack åbne en frisk ampul hver gang.
      2. Bland i 9 pi 20% pluronsyre og vortex grundigt. Bland farvestoffet med 100 pi af det relevante eksperimentelle eller kontrol ACSF og vortex godt, for en endelig farvestof koncentration på 10 uM.
      3. Opløsningen filtreres under anvendelse af en centrifuge filterrør. Dette trin forhindrer lastning pipette fra tilstopning under udstødning af farvestoffet.
      4. Forbered en pipette fra en borsilikatglas kapillar trukket til en modstand på cirka 1,3 MOhm når den er fyldt med farveopløsning.
    2. Placer en hippocampale skive i en optagelse kammer designet til brug med mikroskopetog kontinuerligt perfuse med iltet ACSF af samme sammensætning som det blev inkuberet (1,5 ml / min.) Skift mellem kontrol og eksperimentelle vilkår når du vælger et hippocampalt skive.
    3. Kassér usunde søger hippocampusskiver. Kvaliteten af ​​skiver vil variere, selv inden for et givet forsøg. Der er ingen faste kriterier for kvantificering skive sundhed, og derfor bestemmelse af skive sundhed er subjektiv og hovedsageligt baseret på erfaring.
      1. Generelt holde udsnit, der har en glat optræder overflade og en høj procentdel af sunde CA1 pyramideformede celler (figur 2A). CA1 pyramideformede celler er særligt følsomme og sårbare over for CNS-fornærmelser, så har en stor procentdel (≥ 75%) af sunde CA1 pyramideneuroner kan være et nyttigt kriterier for at acceptere eller afvise en skive.
      2. Kassér skiver, der har cirka> 25% døde neuroner. Dead neuroner har et spejlæg-lignende udseende (figur 2B). BEMÆRK: Vi hahar observeret, at vinklen af ​​snittet spiller en vigtig rolle for, om neuroner synes sundt eller ej. Hvis neuronale dendritter rager opad (ud af den skive), så neuronerne vil hovedsageligt være døde. Dette er formentlig fordi en stor del af neuron volumen er indeholdt i dendritiske træet, at adskillelse dendritter er dødelig for cellerne. På den anden side, hvis dendritter rager parallelt med eller i en nedadgående vinkel fra den skive overflade, vil der være en høj procentdel af raske neuroner. Undertiden vil derfor neuroner hovedsageligt være døde på den ene side af skive og sundt udseende på den anden side.
    4. Find et egnet område sr astrocytter 40-70 um under skive overflade baseret på størrelse, morfologi og placering ved hjælp af kontrast differential interferens (DIC) optik.
    5. Indlæse glaspipette med farveopløsning og sænk den til overfladen af ​​den skive over dette område ved hjælp af en standard patch-clamp mikroelektrode keepr.. Med pipetten på overfladen af ​​den skive, anvendelse modtryk til pipetten at begynde skubbe farvestof. Udstødning af farvestoffet vil være synlige under både DIC optik og et passende laser, såsom en 488 linje for et grønt farvestof.
    6. Langsomt sænke pipetten til ca 40 um under skive overfladen med en mikromanipulator og tillade farvestoffet at skubbe ca 45-60 sek. Derefter sænkes pipetten yderligere 35 m (75 mM nedenfor skive overflade) og skubbe farvestof i ca 45-60 sek. Langsomt trække pipettespidsen fra den skive. Kortere injektion tid er sandsynligvis resultere i utilstrækkelig farvestof lastning, mens længere injektion tendens til at øge baggrund lastning, hvilket nedsætter signal-til-støj-forhold på optagelsen.
    7. For at sikre at et stort antal astrocytter optager farvestoffet, er det som regel nyttigt at injicere et andet farvestof bolus en kort afstand. Hæv pipetten tilbage til overfladen af ​​den skive, så sørg for at pipetten ikke er tilstoppet, så move pipetten cirka 80-100 um væk fra den første injektionssted, langs stratum radiatum. Gentag bolusinjektion på dette site.
    8. Tillad 30-45 min før billeddannelse til astrocytterne at tage op farvestoffet og til baggrunden signal at aftage. Lad skive i perfusionskammeret løbet af denne tid. Sørg for at denne inkubationstid er indbygget i alt 4 timers behandling af forsøget. Anskaf den næste skive og gentag trin 5,2-5,8.

    6.. Optagelse Spontan og Gq GPCR agonist-fremkaldt astrocytisk Ca 2 + aktivitet i hippocampusskiver

    1. Opsætning af konfokal mikroskop til billeddannelse:
      1. Begrænsning skive udsættelse for laserlys er af allerstørste betydning, da høj eksponering kan føre til farvning blegning og / eller fototoksicitet. Brug højere optisk forstørrelse eller en øget zoom indstilling øger lys eksponering for det afbildede område. Derfor indstille standardværdier for hver laser til en høj fotomultiplier setting, 1x forstærkning og 0,5% laser udgangseffekt.
      2. Påfør en 1.5x zoom til bedre visualisering af astrocyt processer.
      3. Indstil feltet opløsning til 512 x 512 pixels.
      4. Indstil scanningen hastighed til den hurtigst muligt, hvilket er ~ 1,2 sek pr scanning ved hjælp af én måde scanningsfunktion.
      5. Saml emissionsspektre hjælp båndpasfiltre af 503-548 nm for 488 nm-laser, og fra 624 til 724 nm til 559 nm laser. Disse indstillinger tillader billeddannelse af et felt på ~ 5-8 astrocytter ved en relativt hurtig hastighed ved en opløsning er tilstrækkelig til at observere astrocyte celle organer og de vigtigste processer. Ideelt set vil astrocytter i marken være lyse nok til at ses tydeligt, men uden nogen pixel mætning.
      6. Bekræfte identiteten af celler belastet med Ca2 + farvestof som astrocytter ved at visualisere SR-101 colabeling hjælp af 559 nm laser.
    2. Optagelse astrocyte Ca 2 + aktivitet:
      1. Tegn kasser ved hjælp af billedet erhvervelse software over regioner af interesse (ROEr) i cellen, i dette tilfælde i løbet astrocyt celle organer. Boksene bør ikke omfatte baggrunden pixels, for at opnå det bedste signal-til-støj-forhold muligt. Tegn en kasse i baggrunden som reference.
      2. Skift perfusionen til eksperimentel ACSF plus 1 uM TTX (Abcam) gennem resten af ​​forsøget. Dette eliminerer eventuelle neuronale AP-drevne astrocyte calcium svar. Resterende stigninger i astrocytisk Ca2 +-koncentration vil da være på grund kvantalt vesikulær frigivelse konstitutiv (basal) GPCR-aktivitet, eller en kombination af begge mekanismer.
    3. Optag fluorescens over tid fra alle ROI'er. Eventuelle stigninger i fluorescens i forhold til baseline indikerer stigninger i cytoplasmatiske Ca2 +-koncentration 16, og derfor GPCR-aktivitet i astrocytter 10, 17, 18. For at undgå eventuelle tidlig skalering effekter på astrocytiske receptorer ved TTX, komplet eksperimenter inden for 40 min frabout det tidspunkt, hvor 1 pM TTX perfusion begyndte.
      1. Efter opnåelse af 10 min af baseline optagelse af spontan Ca 2 + aktivitet, anvende en agonist af interesse (såsom DHPG) ved sekventielt stigende koncentrationer. Efterlad mindst 5 minutter mellem programmer for at reducere mulig receptor desensibilisering.
      2. Ved slutningen af ​​optagelsen, anvende en cocktail af agonister for andre astrocytic GQ GPCRs som en positiv kontrol for intakt astrocytisk Gq GPCR signalveje. Komponenter af agonist cocktail vil afhænge af receptoren af ​​interesse. 10 pM af hver af Gq GPCR agonister histamin, carbachol og 2Na-ATP for at stimulere histamin H1-receptorer [H1R] muskarine acetylcholin receptorer [mAChR] og purinergiske receptorer [P2YR] henholdsvis er et almindeligt anvendt agonist cocktail.
    4. Post-eksperiment billede erhvervelse:
      1. Ved afslutningen af Ca 2 + optagelse, tage stillbilleder med 488 nm og 559 nm lasere, feller senere bekræftelse af astrocyt identitet og placering ROI. Laser magt og HV-indstillinger kan frit ændres på dette punkt at opnå en optimal billede til colokalisering, da der ikke længere er en bekymring om laserlys intensitet påvirker data (figur 2A).
    5. Gentag trin 6.1-6.3 i alt cirka 8 skiver og 40 astrocytter / gruppe. Skiver bør komme fra mindst 3 forskellige mus.

    7.. Analyse af astrocyt Ca2 + Aktivitet

    1. Definition af en Ca 2 + højde: Standardisering definere Ca 2 + transienter er ikke blevet fast etableret inden for det videnskabelige samfund. Hvad der følger er en typisk protokol, der maksimerer følsomheden og samtidig begrænse afsløring af falske positive begivenheder ud af baseline støj.
      1. Har en anden lab medlem tildele hver skive en talkode for at analysere dem blindt. Ved afslutningen af ​​analysen, afkode hver skive.
      2. Analysere spontan og fremkaldte astrocyt Ca 2 + stigninger offline med billedbehandling analyse software. Tegn og / eller justere størrelse, form og som ønsket placering af ROIs.
      3. Score stigninger i fluorescens intensitet over baseline som en Ca 2 + elevation hvis spidsamplituden er større end to standardafvigelser (SD) over middelværdien af 30 sek af den gennemsnitlige baseline fluorescens i mindst to på hinanden følgende prøvepunkter. I særligt støjende optagelser (lavt signal-støj), kan dette krav behøver at blive justeret til 3 SD over den gennemsnitlige baseline fluorescens. Definer starten af hver Ca 2 + højde som det sidste datapunkt før fluorescensintensitet end én standardafvigelse over gennemsnittet.
      4. Skelne mellem multipeak vs successive single-peak begivenheder. Score en begivenhed som "multipeak", når Fluorescensintensiteten ikke vender tilbage til baseline (under gennemsnittet basisværdien +2 SD) for &# 8804; 9 på hinanden følgende datapunkter (10,8 sek) mellem toppe. Således vil enkelt top begivenheder har 10 eller flere på hinanden følgende baseline datapunkter i-mellem dem.
      5. Klassificere begivenheder som "plateau"-typen reaktioner når fluorescensintensitet fastholder spidsamplituden (± 10% af peak-værdi) for mindst 3,6 sek.
    2. Analyser amplitude, frekvens og kinetik af spontane og agonist-fremkaldte calcium transienter.
      1. Definer peak amplitude af Ca 2 + højde som datapunkt med den højeste intensitet værdi (i tilfælde af "multipeak" svar bruger den første top, se figur 2B).
      2. Beregn stigetid som forskellen mellem reaktionen indtræden og den tid, der svarer til den maksimale amplitude. BEMÆRK: 0 til 100% stigetid kan være nødvendigt at anvende for at få et tilstrækkeligt antal datapunkter til opnåelse af en tidsværdi, scanningshastigheden er en vigtig variabel her.
      3. Beregn latenstid som tidenmellem indledningen af ​​agonist perfusion til svaret debut. Rise tid kan være en mere nyttig foranstaltning i hjernen skiver, så længe vaske-in-tider skabe et forvirre ved beregningen respons ventetid.
    3. Afgøre, om der er statistisk signifikante forskelle mellem de to grupper for hver parameter anvendelse af Student uafhængige t-test. Brug antal astrocytter som 'n'. Brug Pearsons chi-square test for at sammenligne de Ca 2 + aktivitet mønstre mellem kontrol-og behandlingsgruppen. Brug Fishers eksakte 2-sidet test til at sammenligne procenter af specifikke Ca 2 + aktivitet mønstre mellem kontrol-og behandlingsgruppen. Express forskelle som * p <0,05, ** p <0,01, og *** p <0,001.

Representative Results

Repræsentative resultater i figur 3 viser virkningen af inkubation af akutte mus hippocampale skiver i TTX 4-6 timer på sr astrocyt Ca2 +-aktivitet. Data omfatter både spontane Ca 2 + transienter og DHPG-fremkaldte gruppe I mGIuR Ca 2 + svar, fra skiver inkuberet i kontrol ACSF vs ACSF plus TTX. Andre end basale karakteristiske morfologiske egenskaber, stellate proces samling og lille soma størrelse (~ 10 um), er astrocytter identificeret i sr ved overlejring af Ca 2 + indikator OGB-01:00 med den selektive astrocyte markør SR-101 19, 20 ( Figur 3A). De nummererede kasser flere astrocyt cellelegemer svarer til den nummererede fluorescens med tiden spor er vist i figur 3B. Den gruppe 1 mGluR agonist (RS)-3.5-DHPG anvendes til at bestemme de konkrete skalering effekter på gruppe 1 mGluR'er i astrocytter. At skelne mellem fysiskiology i specificiteten af ​​skalering effekt til gruppe 1 mGluR'er versus andre GQ GPCRs, er en cocktail af agonister anvendt ved slutningen af ​​hvert forsøg. Her brugte vi 10 pM hver af GQ GPCR agonister histamin, carbamylcholin chlorid (carbachol) og adenosin 5'-ATP dinatrium (Na-ATP). Agonist cocktail fungerer også som en positiv kontrol til at identificere levedygtige responsive astrocytter i tilfælde, hvor cellerne ikke reagerer på DHPG, formentlig fordi disse særlige astrocytter ikke udtrykker tilstrækkelige mængder af receptoren til at fremkalde en reaktion DHPG.

Vi brugte forskellige koncentrationer af DHPG, heraf 5 uM og 15 uM (figur 3B) samt 30 uM og 50 uM (figur 4A) for at bistå i at afsløre ændringer i astrocytisk gruppe I mGluR'er. Forholdet mellem cellulære Ca 2 + svar og Gq GPCR udtryk niveauer er tidligere blevet undersøgt in vitro 21-24. For det førstetærskel til at reagere på en bestemt agonist koncentration afhænger af tætheden af ​​receptorer udtrykt af hver celle. I en population af celler, flere celler reagere med en Ca2 + højde til en given koncentration af agonist, når cellerne transficeres med højere tætheder af receptorer. Efter inkubering skiverne i TTX den procentdel af astrocytter i befolkningen reagerer på en fast koncentration af agonist stiger (figur 3B og 3C). Vi har fundet, at 5 uM og 15 uM DHPG afslører tydelige forskelle i andelen af responderende astrocytter mellem kontrol og TTX behandlede celler, mens 30 og 50 uM DHPG er forpligtet til at sammenligne gruppe I mGIuR reaktioner i 5,0 mM K + behandlet versus kontrol celler (figur 4A).

Forholdet mellem astrocytic Ca 2 + reaktionsmønstre og agonist koncentration er også blevet undersøgt in situ. Forøgelse agonistenkoncentration forskyder mønster af Ca 2 + svar i astrocytter fra enkelt top Ca 2 + stigninger til multipeak og plateau Ca 2 + forhøjninger 25-27. Baseret på disse tidligere resultater, vi forudså, at reaktionsmønster til en enkelt koncentration af agonist vil flytte hvis der er ændringer i niveauet af receptorekspression. Således afhængigt af, hvilken af ​​de to skaleringsmetoder bliver udnyttet (hæmme neuronfyring eller øge den), vil koncentrationen af ​​agonist nødvendig for at fremstille et bestemt reaktionsmønster stige eller falde. For eksempel astrocytter inkuberet i TTX flytte deres DHPG-fremkaldte Ca2 + reaktionsmønster mere plateau type Ca2 + stigninger og svare sænke agonist koncentrationer sammenlignet for at kontrollere astrocytter (figur 3C). Under hensyntagen til de tidligere undersøgelser, disse observationer tyder på, at den gruppe, jeg mGIuR receptor udtryk niveauer i astrocytter er steget.

Stigetid og indtræden (latens) af Ca 2 + forhøjninger har også vist sig at korrelere direkte til ændringer i Gq GPCR ekspressionsniveauer i dyrkede celler 22-24. Højere receptor udtryk niveauer resulterer i kortere respons latenstider og hurtigere stigetider mens reduktion i receptor tæthed frembringer den modsatte virkning. For astrocytter inkuberet i TTX, Ca 2 + transienter fremkaldes ved anvendelse af DHPG har betydeligt hurtigere stigning gange i forhold til astrocytter inkuberet i kontrol ACSF (figur 3D). Som tidligere nævnt, amplituder af agonist-fremkaldte Ca2 +-reaktioner forbliver uændret, uanset koncentrationen agonisten eller skalering model 15 (figur 3D).

Ud over de observerede ændringer ved direkte aktivering gruppe mGluR'er jeg med DHPG er spontan astrocyte Ca 2 + aktivitet også væsentligt påvirket af denne manipulation. Vi observererda 2,26 gange stigning i andelen af ​​spontant aktive astrocytter inkuberes i TTX versus kontrol. Det er en stigning fra kun 12,9% af kontrol astrocytter udviser spontan aktivitet i soma til 42,1% i TTX inkuberes astrocytter (figur 3e). Fordi det er kendt, at GPCR udviser "iboende" eller konstitutiv aktivitet i fravær af agonist 21, 26, 28, og at niveauet for denne iboende aktivitet stiger med stigende receptor ekspressionsniveauer, antyder disse data, at tætheden af astrocytic Gq GPCR stigninger efter langsigtet reduktion i neuronal virkningspotentiale fyring. Svarende til agonist-fremkaldte reaktioner, er stigetider af spontane Ca 2 + stigninger også steget (figur 3E).

Repræsentative data ved hjælp af den anden protokol, inkubation i forhøjet ekstracellulær kalium (5,0 mM), er afbildet i FiGure 4.. En stigning i ekstracellulær K + 2,5-5,0 mM resulterer i en betydelig stigning i basal CA3 neuron aktionspotentialets frekvens 15. Højere koncentrationer af DHPG (30 uM og 50 uM) er nødvendige for at fremkalde gruppe I mGluR Ca 2 +-reaktioner fra astrocytter inkuberet i høj kalium (figur 4A og 4B). Dette er i overensstemmelse med et reduceret niveau af gruppe I mGluR lydhørhed i astrocytter efter en langsigtet stigning i neuronale virkningspotentialer. Desuden fremkaldte reaktionsmønster til en fast koncentration af DHPG forskydes fra plateau-lignende reaktioner på svagere enkelt peak responser (Figur 4B). Undersøgelse af procentdelen af spontant aktive astrocytter i de to kalium betingelser viser, at færre astrocytter inkuberet i høj K + spontant aktive i forhold til kontrolgruppen tilstand (figur 4C). Denne effekt er i Opposite retning af TTX tilstand, hvor andelen af astrocytter udviser spontane Ca 2 + stigninger øges. Sidst, både fremkaldte og spontane Ca 2 + stigninger har langsommere stigetider i astrocytter inkuberet i høj K + i forhold til kontrollen tilstand (figur 4C og 4D). Samlet tyder disse data på, at astrocytic Gq GPCR ekspressionsniveauer skala bidirektionelt afhængigt af omfanget af neuronal virkningspotentiale aktivitet over en længere tidsperiode.

Figur 1
Figur 1. Slice rugekammeret fabrikation og sat op. (A) Skuffen del af en Brinkmann pipette opbevaringsbeholder sammen med sin lufttæt låg bruges til at konstruere den skive rugekammeret. (B) Drill et hul i siden af ​​beholderen omkring 1 ¼ ovenfra og ¼ fra siden. Passe ind i et stykke af fleksibel slange. (C) Tilslut microloader-manifold apparat til den indvendige ende af den fleksible slange. Bemærk cut-til-fit naturlige 200 ul pipettespids (hvid pil). (D) Seks 20 ul Eppendorf microloaders skæres til at passe til en én-til-seks line manifold til at skabe en microloader-manifold apparat. (E) Bor to små huller på låget. (F) en variabel Bubble Rack for at gøre skive holderen. (G) Den nederste "ben" af flydende boble rack fjernes, så at et stykke nylon netmateriale kan limes til bunden. (H) Fyld rugekammeret med tilstrækkelig mængde ACSF så skive indehaveren flåd. Juster slangelængde så spidserne af microloaders kan hvile på et hjørne af kammeret gulvet. Ved placering af rugekammeret ivandbadet skal vandstanden i badet være på samme niveau som ACSF i kammeret. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Estimering af skive sundhed. (A) Et sundt udseende hippocampus udsnit ved hjælp af differential interferens kontrast (DIC) optik. Sunde skiver have en glat, fløjlsagtig udseende og en høj procentdel af sunde CA1 pyramidale neuroner. Bemærk den apikale dendritter rager ind i stratum radiatum. Patch-clamp af neuroner, der ligner dem, der vises her afslører en lav hvile membran potentiale (-61 til -62 mV) i standard 2,5 mM K + ACSF med få spontan handling potentialer. Membran potentiale og fyring satser vil variere som en funktion af extracellular K + (Xie et al. 15). Pile peger på formodede astrocytter. Forkortelser: SR, stratum radiatum, s.py., stratum pyramidale. Scale bar, 10 um. (B) Usunde skiver vil have en høj procentdel af døde CA1 pyramideneuroner, som har udseende af stegte æg (hvide pile peger på kerner af døde neuroner - den "blomme" af stegte æg). Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Optagelse amplificeret Gq GPCR-aktivitet og fremkaldte gruppe I mGluR Ca 2 +-reaktioner efter langvarig inhibering af neuronale APs ved inkubering i TTX. (A) Repræsentative billeder af celler i feltet optagelse inkuberet i Control betingelser (øverste paneler) eller i TTX (nederste paneler), der har taget op Oregon Green BAPTA-01:00 Ca 2 + indikator (venstre paneler) og SR-101 (midterste paneler). Målestokken er 10 um. Overlay af begge signaler ("fusionere") angiver, at astrocytter belastning med Ca 2 + indikator. Kasser er trukket frem for individuelle astrocyte soma at optage fluorescens intensitet over tid i den grønne kanal til at overvåge Ca 2 + aktivitet i astrocytter. (B) Prøve spor fra optagelsen bokse i A) af Ca 2 + aktivitet i astrocytter. Astrocytter inkuberet i TTX viser øget spontan aktivitet og en mere robust fremkaldt gruppe I mGluR Ca 2 +-reaktioner som vist ved ændringer i mønsteret for respons. Eksempler på enkelt top (cirkel), multipeak (rektangel), og plateau (stiplet rektangel) Ca 2 + transienter bliver vist. (C) ændringer i reaktionsmønstre er især tydeligt ved hjælp af forskellige concentrationer af gruppen I mGluR-agonist DHPG. Flere multipeak og plateau reaktioner er tydelig efter inkubation i TTX sammenlignet med kontrol på en given agonist koncentration. (D) Rise tider DHPG fremkaldte Ca2 + svar er hurtigere i astrocytter inkuberet i TTX sammenlignet med kontrol (øverste panel), mens amplituder ikke ændrer (nederste panel), tegn på "alt-eller-none" respons amplituder gang er nået tærsklen til at reagere. (E) Rise tidspunkter af spontan astrocyt Ca 2 +-transienter er også hurtigere i TTX inkuberet versus kontrol inkuberet astrocytter (øverste panel), mens andelen af astrocytter i populationen udviser spontane Gq GPCR Ca 2 + aktivitet stiger (nederste panel). Klik her for at se større billede.

Figur 4 Figur 4.. Optagelse formindsket astrocytisk Gq GPCR aktivitet og fremkaldte gruppe I mGIuR Ca 2 + responser efter langsigtet stigning i neuronale APs ved inkubation i forhøjet ekstracellulær kalium. (A) Repræsentative spor af astrocyt Ca 2 + optagelser fra skiver inkuberet i 5,0 mM K + ACSF at depolarisere neuroner og øge deres basale skudhastighed forhold til at styre ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocytter inkuberet med 5,0 mM K + ACSF udstille færre spontane somatiske Ca 2 + transienter og svagere DHPG fremkaldte reaktioner i forhold til astrocytter inkuberet i kontrol ACSF. (B) En sammenligning af mønstre af fremkaldte reaktioner til flere koncentrationer af DHPG afslører svagere respons typer efter langvarig stigning i neuronale ApS. (C) En reduktion i andelen af astrocytter i poBefolkningstæt udviser spontan Ca2 +-aktivitet observeres efter langvarig inkubering i forhøjede K + i forhold til at styre ACSF (øverste panel), mens stigetider af den spontane aktivitet bliver langsommere (nederste panel). (D) Rise tider fremkaldt astrocyte Ca 2 +-reaktioner på forskellige koncentrationer af DHPG bliver langsommere efter 5,0 mM K + behandling i forhold til astrocytter inkuberet i kontrol ACSF. Klik her for at se større billede.

Discussion

De beskrevne skalering modeller repræsenterer praktiske metoder til at forske langsigtede plasticitet astrocytisk gruppe I mGluR'er. Imaging spontane og fremkaldte Ca2 + hændelser tilvejebringer et følsomt assay til måling af ændringer i astrocytisk Gq GPCR-aktivitet, som er blevet etableret klare beviser, at astrocyt Ca 2 + stigninger forekommer efter frigivelse fra IP 3 R-sensitive butikker nedstrøms for Gq GPCR-aktivering 10, 12, 17, 18 år. Andelen af astrocytter i befolkningen reagerer på gruppe I mGluR-agonist og mønstret af sådanne Ca 2 + responser indberette ændringer i gruppe I mGluR'er af astrocytter.

Den specifikke teknik, der anvendes til at indlæse astrocytter med Ca 2 + indikator er en vigtig overvejelse i udformningen af eksperimenter til at kigge efter ændringer i astrocytisk Gq GPCR aktivitet. Bolus-loading eller bulk-loading flere astrocytter, eller patch-clamp loading enkelte astrocytter kan anvendes til at afbilde Ca 2 +-transienter i astrocytter. Hver tilgang giver visse fordele og ulemper. Direkte påfyldning astrocytter med Ca 2 + indikator via patch clamp tillader utvetydig identifikation af cellen som en astrocyt uden behov for en sekundær markør, såsom SR-101. Patch-clamp levering af indikator muliggør også optagelsen af Ca2 +-aktivitet fra små astrocytiske rum herunder busket fine processer, potentielt dybere i udsnit, hvor cellerne er sundere og med flere intakte interaktioner med synapser (afhængigt af lasereffekt findes). Men patch-clamp loading lider under lav overførselshastighed som data indsamles én celle ad gangen. Bulk-loading derimod giver et stort antal astrocytter til at blive lastet med Ca 2 + indikator og afbildes samtidigt. Men kun astrocytter nær overfladen (<20 um) af udsnittet er fyldt med tilhørende bekymrings om celle sundhed og intakte synapser.

Modtrykket bolus-loading-protokol, der præsenteres her giver en mellemvej med relativt høj kapacitet og mulighed for at overvåge Ca 2 + aktivitet dybere i den skive (40-75 um). En betydelig stigning i andelen af spontant aktive astrocytter ved hjælp af bolus-loading teknik er observeret i forhold til bulk-loading, hvilket tyder på, at de forbindelser mellem neuronale synapser og astrocytiske processer er mere komplet 15. Med god læsning, kan man ofte overvåge Ca 2 + aktivitet i de vigtigste processer i astrocytter (data ikke vist) eller potentielt endnu mindre rum ved hjælp af 2-foton mikroskopi. Imidlertid skulle, pleje skal udøves i at tildele de mindre processer til en bestemt astrocyte, da grænserne falde ind i uspecifik baggrundsfarvning. Et yderligere problem med brug af bulk-loading eller bolus-loading procedurer er behovet for en sekundær markedsker for astrocyte identifikation. Selv om det har været kendt i mange år, at astrocytter fortrinsvis tage op AM ester Ca 2 + indikatorer, er det sekundære markør SR-101 bruges ofte til at kontrollere de indlæste celler som astrocytter. SR-101 kan i sig selv ændre den iboende ophidselse af neuroner 29. Brug af SR-101 bestyrker behovet for at udføre alle astrocyt Ca 2 + målinger i TTX at begrænse eventuelle SR-101 effekter på neuronal uro. Antages det, at både kontrol og eksperimentelle grupper omfatter SR-101, skal markøren i sig selv ikke højde for de observerede virkninger i astrocyte Ca 2 + signalering efter langvarig manipulation af neuronale virkningspotentialer. SR-101 kan dog være mere af en bekymring i høj K + eksperimenter, da det kan reducere forskellen mellem 2,5 mM K + vs 5,0 mM K +, hvis den basale skudhastighed ikke ændres proportionalt.

En meget lovende tilgang til at levere Ca 2 + 2 + farvestoffer. Betydelige fremskridt er sket i løbet af de sidste par år med genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) målrettet til astrocytter 30-32. GECIs kan leveres til astrocytter ved in vivo mikroinjektion af adenoassocierede virale vektorer i et område af hjernen af interesse, såsom hippocampus. Ekspression af GECIs opnås efter cirka to uger efter virusinfektion 32. Der er mange fordele præsenteres ved anvendelse af GECIs i astrocytter. Først bliver vektorer målrettet til astrocytter ved hjælp af en astrocyt-specifikke promotor, så de mærkede celler er astrocytter 32. For det andet signal-støj forekommer nu sammenlignes med, hvad der kan opnås ved anvendelse af patch-clamp levering af farvestof, men uden invasiv have haft en patch-pipetten på cellen 32. For det tredje kan indikatorerne være delivered og udtrykt i voksent væv, hvilket er problematisk at bruge løs-loading levering metoder. Desuden udtrykket er mosaik, giver mulighed for at skelne mellem flere astrocytter. Således kan flere astrocytter potentielt afbildet samtidig, men også optager i soma og fine branchlets samtidig. Derfor kunne potentielt en enkelt teknik kan anvendes i stedet for tre adskilte teknikker (løs-loading, bolus-loading, og patch-clamp belastning) for at optage skalering aktivitet astrocytic GQ GPCRs, i høj grad øge effektiviteten.

En potentiel ulempe ved at bruge viral-medieret levering af Ca 2 + indikatorer til astrocytter er den mulige indvirkning på skive sundhed 32.. Den adenoassocierede virale vektorer, der anvendes til at levere de GECIs er tidligere blevet vist at forårsage reaktiv gliose af astrocytter 33. Udarbejdelse af hjernen skiver i almindelighed sandsynligvis indleder tidlige stadier af patologi, herunder frigivelse af inflammatory molekyler 10. Derfor, kombineret med de lange inkubationstider kræves for at fremkalde skalering af astrocytiske receptorer, brug af GECIs leveres ved hjælp af virale vektorer vil være nødvendigt at modtage yderligere vederlag i forbindelse med skive sundhed i disse typer af eksperimenter.

Ved anvendelse af denne protokol, er det vigtigt at huske på, at ansøgningen tid for agonist til at producere et svar vil variere som en funktion af receptor tilgængelighed. For en given koncentration af agonist, vil ansøgningen tid nødt til at være længere, hvis receptorer er skaleret ned, og kortere, hvis receptorer er skaleret op, for lægemidlet til at nå frem til en passende koncentration i vævet til at aktivere receptorer i tilstrækkelig grad til at producere en Ca 2 + respons. Derfor kan lægemidlet påføringstider, og potentielt deres koncentration, skal justeres afhængigt af den tilsigtede retning af skalering. For eksempel kan agonistkoncentrationen skal sænkes i Case af TTX at undgå at mætte reaktioner og øget efter inkubation skiver i høj K + til endda se en reaktion. Konkret blev DHPG koncentration flyttet 5-15 pM efter TTX behandling til 30-50 uM efter 5,0 mM K + behandling for at studere Ca 2 + reaktionsmønstre, som 5-15 uM ofte var for lav til at producere pålidelige reaktioner i astrocytter efter aftrapning af gruppe I mGluR'er.

Registrering af astrocyt Ca 2 + aktivitet giver ingen direkte beviser for receptor indsættelse eller internalisering til eller fra plasmamembranen. Men baseret på den bemærkelsesværdige lighed af data med data fra tidligere undersøgelser in vitro, der undersøgte det direkte forhold mellem Gq GPCR udtryk niveauer og spontane og fremkaldte Ca 2 + transienter 21-24, den mest logiske fortolkning af de ændringer i Ca 2 + signalering er at astrocyt overflade receptor ekspressionsniveauer harændret. En supplerende strategi kan være en vigtig overvejelse, hvis man ønsker at give yderligere beviser på locus af effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi, vi brugte, var at undersøge effekten af ​​TTX inkubation på hippocampusskiver fra astrocytic MrgA1R mus. Disse transgene mus udtrykker en udenlandsk Gq GPCR (den MrgA1R) kun i astrocytter. Fordi denne receptor ikke er nativ til hjernen, er der ingen endogen neurotransmitter til stede til at ændre sine aktivitetsniveau. Tidligere arbejde antydede, at denne receptor i indgreb med den samme intracellulære signalmolekyler såsom endogen gruppe I-mGluR'er i de samme astrocytter 34. Efter langvarig inkubation af skiver fra MrgA1R mus i TTX, ingen forskelle i agonist-fremkaldte MrgA1R respons sammenlignet med kuldsøster kontrol inkuberes skiver ville give dokumentation for, at effekten på astrocyte Ca 2 + aktivitet skyldes ændringer lokaliseret til overfladen receptor, især hvis gruppe I mGIuR svar er stadig betydeligt forbedret i de samme astrocytter. En alternativ, men måske mere involveret strategi ville være at isolere astrocytter fra udsnit til Western blot-analyse, så længe en membranfraktion kunne analyseres for ændringer i overfladen receptor ekspressionsniveauer. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) eller flowcytometri kan være nyttige her.

De mulige anvendelser af denne teknik til studiet af neuroner, astrocytter og astrocyt-neuronale interaktioner er mange. I vores eksperimenter, kun DHPG-fremkaldte gruppe I mGIuR astrocytic Ca 2 + responser blev undersøgt, i isolerede akutte hippocampusskiver fra unge mus. Dette præparat ikke kun har de intakte afferenter (Schaffer sikkerhedsstillelsen), men også de neuroner, der giver anledning til dem (CA3 pyramideformede celler), som gør det muligt at manipulere fyring satser af disse glutamaterge neuroner på de postsynaptiske celler (CA1 pyramideformede celler) og astrocytterne i stratum radiatum hvis processer er forbune med disse synapser. Den akutte hippocampus skive kan ikke være den bedste forberedelse til at manipulere fyring satser af andre typer af neuroner, er imidlertid så mange afferenter udsondres fra de neuroner, der giver anledning til dem. Ikke desto mindre kan det være muligt i visse slice præparater at observere plasticitet andre astrocytic Gq GPCR undertyper. For eksempel kan skiver fremstilles med basale cholinerge forhjerneneuroner og deres projektioner til Hippocampus intakt. Inkubation af disse skiver i TTX eller forhøjet K + vil påvirke basal fyring satser af cholinerge neuroner, hvilket fører til skalering af mAchRs i astrocytter fra stratum Oriens, som modtager en betydelig del af den cholinerge indgang 1. En alternativ endnu uprøvet tilgang til at studere astrocytisk receptor skalering inden for et bestemt område af hjernen, med alle de forbindelser intakte mens skalering sker, kunne være at anvende en in vivo-model, hvor en vedvarende frigivelse af TTX opnås ved implantation af en plastic polymer Elvax 40W over området af interesse 35. Denne fremgangsmåde har været anvendt tidligere i en undersøgelse af neuronal skalering, men bør også gælde for astrocytisk skalering. Endelig med den rette udlæsning, kan fremtidige studier undersøge andre GPCR familier, herunder ændringer i G s eller g I GPCRs. Man kunne forudsige astrocytisk GABA B Gi GPCRs at blive påvirket efter hæmning af fyring i lokalt fremspringende GABA interneuroner inden for en skive forberedelse. Udvikling af nye indikatorer rettet mod andre signalmolekyler, såsom en real-time indikator for anden messenger cAMP, ville åbne op for et helt nyt forskningsområde på neuron-til-astrocyt receptor kommunikation.

Tovejs skalering af astrocytiske mGluR'er ved manipulation af basale neuron fyring satser giver et mål for følsomheden af ​​astrocytter til AP-medieret frigivelse af neurotransmitter. Astrocytter kan tilsyneladende fornemme spontane ApS og glutamate frigivelse Schaffer sikkerhedsstillelse-CA1 pyramideformet celle synapser, selv når ekstracellulær K + er inden for et fysiologisk område. Mens akut anvendelse af TTX ikke reducerer hyppigheden af spontane astrocyte Ca 2 + aktivitet 18, 36, 37, Ca 2 + aktivitet blandt astrocytter i befolkningen bliver decorrelated 36, som godtgør, astrocytiske receptorer er AP detektorer. Dette antyder, at astrocytter fornemmer spontane neuronale ApS med ingen indflydelse på deres samlede Ca 2 + aktivitet. Det er almindeligt accepteret, at intracellulære koncentrationer af IP 3 brug for at nå en tærskelværdi for at stimulere IP 3 R'er tilstrækkeligt til at føre til en påviselig Ca 2 + elevation. Kunne spontane neuronale APs aktivere astrocytiske GPCRs uden at producere målbare Ca 2 + stigninger? Fremtidige studier kunne benytte Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) eller en lignende techn ique (såsom BRET) for at undersøge forholdet mellem G-protein kobling til receptoren (et mål for receptor-aktivering), og Ca 2 + frigivelse fra interne butikker. BRET har været anvendt i udstrakt grad in vitro til påvisning af G-protein-til-GPCR kobling 38, selv om det kan være en vis tid, før denne teknologi bliver tilgængelig til brug i intakte vævspræparater. Det er muligt, astrocytic GQ GPCRs bliver aktiveret langt hyppigere, end der kan optages ved hjælp af de tilgængelige Ca 2 + billeddiagnostiske værktøjer. Ud over at sensing virkningspotentialer kan astrocytic GQ GPCRs også være i stand til at opdage miniature kvantemekaniske frigivelse af neurotransmitter som rapporteret i en nylig undersøgelse 39. Det tovejs skalering her beskrevne metode kan anvendes i fremtidige undersøgelser for at give et mål for, i hvilket omfang astrocytisk GQ GPCRs opdage kvantalt vesikulær frigivelse af neurotransmitter, ved at inkludere bafilomycin A1 i inkubationstiden protokollen.

ntent "> Hidtil skalering protokoller er kun blevet anvendt i hippocampusskiver fra unge mus (P12-P18). Derfor er det på nuværende tidspunkt ukendt, hvis astrocytisk receptor skalering også kunne fremkaldes i væv fremstillet af voksne mus. En overbevisende nylig undersøgelse tyder på, at gruppe I mGluR udtryk i astrocytter mindskes betydeligt efter den første uge af alder og fortsætter med at falde indtil voksenalderen, med meget lave niveauer af receptor-ekspression i voksne astrocytter 40. Det ville derfor være interessant at afgøre, om astrocytiske mGluR'er skalere op efter lang sigt hæmning af neuronfyring hos voksne mus hippocampus skiver til et niveau, der nærmer sig dem, der ses i astrocytter fra unge mus. Dette fund tyder på, at astrocytisk receptor udtryk er ikke statisk ved en given alder, men kan hurtigt ændre sig afhængigt af niveauet af neuronal aktivitet. I modsætning til reduceret ekspression af gruppe I mGluR'er i voksne mus, der beviser, at opstå, at adrenerge receptorer, herunder & #945, 1A, α 2A, og β 1-subtyper, overvejende udtrykt af astrocytter i den voksne hjerne 3, 4. Den α 1A adrenerge Gq GPCR kan være et attraktivt mål for fremtidige undersøgelser af neuron-til-astrocyte kommunikation, herunder om disse receptorer er følsomme over for ændringer i adrenerge neuron fyring satser.

Disclosures

Forfatterne ønsker at oplyse, at den tetrodotoxin anvendt i disse undersøgelser blev købt fra Abcam. Abcam havde ingen involvering i de hypoteser, design, eller indsamling af data. Al henvendelse vedrørende ved Abcam sponsorat af arbejde skete efter peer review-processen var afsluttet.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende UC Riverside Center for Glial-neuronale interaktioner for værdifuld diskussion af skalering protokoller og data. Forfatterne vil også gerne give en oprigtig tak til Abcam for at sponsorere udgivelsen af ​​deres arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamber Supplies
Brinkmann pipette storage container Fisher Scientific 03-491 Use the drawer portion as the incubation chamber
Electrical drill
Flexible tubing Tygon R-3603
Silicone seam sealant  Also called aquarium seam sealer
Gas tank 95% oxygen, 5% carbon dioxide
Natural beveled pipette tip USA Scientific 1111-1000 Cut-to-fit to connect oxygenate lines
One-to-six lines manifold Warner Instruments 64-0210 (MP-6) For the microloader-manifold apparatus
Microloader Eppendorf 5242 956.003 For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit
Floating Bubble Rack Bel Art Scienceware F18875-0400 For slice holder
600 µm Sefar Nitex Nylon mesh ELKO Filtering Co. 06-600/51 For slice holder
Krazy Glue For slice holder
Reagents
Isoflurane Baxter 1001936060
NaCl Fisher S271-3
KCl Fisher P333-500
CaCl2 Fisher C79-500
MgCl2 Fisher M33-500
NaH2PO4 Fisher S369-500
NaHCO3 Fisher S233-500
Glucose Fisher Fisher
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Acros Organics 53188-07-1
Ascorbic acid Acros Organics 401471000
Tetrodotoxin citrate (TTX) Abcam ab120055
Sulforhodamine 101 (SR-101) Sigma-Aldrich 284912
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)  Fisher Scientific D128-500
Pluronic Acid F-127 Invitrogen, Molecular Probes P6867
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) Invitrogen, Molecular Probes O6807
(RS)-3,5-DHPG Abcam ab120020
Histamine Sigma-Aldrich H7125
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) Sigma-Aldrich C4382
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) Sigma-Aldrich A7699
Dissection Tools
Single-edge razor blade  GEM 62-0161 For bisection 
Double edge razor blade TED PELLA, INC. 121-6 For cutting slices
Mayo Scissors, supercut WPI 14010-15 For decapitation
Fine iris scissors, straight Fine Science Tools 14094-11 For cutting the skull
Iris forceps, curved WPI 15915 To remove the skin and skull
Small spatula To remove/transfer the brain
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps Fine Science Tools 11295-10 For hippocampus dissection
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20B For transferring brain slices
Pasteur pipette rubber bulb Fisher 03-448-22 For transferring brain slices
Polystyrene 100 mm tissue culture dishes Corning 25020
Vibratome Leica VT 1200S
Water bath Fisher ISOTEMP 210 For warm incubation
Micropipette puller Narishige PC-10 For bolus-loading pipette
Confocal microscope Olympus Olympus Fluoview 1000
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform Warner Instruments RC-26GLP diamond bath with low profile
Borosilicate glass pipette World Precision Instruments TW150F-4 For bolus-loading pipette
Micromanipulator  Sutter Instrument ROE-200 For bolus-loading pipette
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate  Costar 8161

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices. J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).
  2. Navarrete, M., Araque, A. Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication. Neuron. 57, 883-893 (2008).
  3. Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo. Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).
  4. Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2. Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).
  5. Porter, J. T., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals. J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).
  6. Bernardinelli, Y., et al. Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus. J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).
  7. Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  8. Wang, X., et al. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  9. Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. Sorting out astrocyte physiology from pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).
  10. Agulhon, C., et al. Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes. Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).
  11. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  12. Nizar, K., et al. In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase. J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).
  13. Sutton, M. A., et al. Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis. Cell. 125, 785-799 (2006).
  14. Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57, 819-826 (2008).
  15. Xie, A. X., et al. Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates. PLoS ONE. 7, (2012).
  16. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  17. Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity. J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).
  18. Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).
  19. Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).
  20. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).
  21. Prezeau, L., et al. Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).
  22. Shao, Y., McCarthy, K. D. Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells. Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).
  23. Wang, S. S., Thompson, S. H. Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics. Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).
  24. Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization. Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).
  25. Shelton, M. K., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ. J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).
  26. Hermans, E., Challiss, R. A. Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors. Biochem. J. 359, 465-484 (2001).
  27. Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ. Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).
  28. de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).
  29. Kang, J., et al. Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).
  30. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  31. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  32. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).
  33. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  34. Fiacco, T. A., et al. Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity. Neuron. 54, 611-626 (2007).
  35. Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence. PLoS One. 2, (2007).
  36. Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ. J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).
  37. Takata, N., Hirase, H. Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo. PLoS ONE. 3, e2525 (2008).
  38. Salahpour, A., et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).
  39. Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).
  40. Sun, W., et al. Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult. Science. 339, 197-200 (2013).

Tags

Neuroscience astrocyt plasticitet mGluR'er neuronfyring elektrofysiologi GQ GPCRs Bolus-loading calcium mikrodomæner akutte skiver Hippocampus mus
Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, A. X., Lauderdale, K., Murphy,More

Xie, A. X., Lauderdale, K., Murphy, T., Myers, T. L., Fiacco, T. A. Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates. J. Vis. Exp. (85), e51458, doi:10.3791/51458 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter