Summary
Här beskriver vi en anpassning av protokoll som används för att inducera homeostatiska plasticitet i nervceller för studiet av plasticiteten hos astrocytiska G-proteinkopplade receptorer. Nyligen används för att undersöka förändringar i astrocytic grupp I mGluRs hos unga möss, kan metoden användas för att mäta skalning av olika astrocytiska GPCRs, i vävnad från vuxna möss i situ och in vivo, och att få en bättre uppfattning om hur känsliga astrocytiska receptorer på förändringar i neuronal aktivitet.
Abstract
Nära två decennier av forskning har visat att astrocyter i situ-och in vivo uttrycker många G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som kan stimuleras av neuronalt släppt sändare. Däremot har förmåga astrocytiska receptorer att ställa ut plasticitet som svar på förändringar i nervaktivitet fått lite uppmärksamhet. Här beskriver vi ett modellsystem som kan användas för att globalt skala upp eller ner astrocytic grupp I metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) i akut hjärnan skivor. Inkluderat är metoder för att förbereda parasagittal hippocampus skivor, konstruera kammare lämpliga för långsiktig skiva inkubation, dubbelriktat manipulera neuronal aktionspotential frekvens, last astrocyter och astrocyternas processer med fluorescerande Ca 2 + indikator, och mäta förändringar i astrocytic Gq GPCR aktivitet genom inspelning spontana och framkallade astrocyternas Ca 2 +-händelser med hjälp av konfokalmikroskopi. I huvudsak en "kalcium roadmap "är anges hur man mäter plasticitet av astrocytiska Gq GPCRs. Tillämpningar av tekniken för studium av astrocyter diskuteras. Att ha en förståelse för hur astrocytisk receptor signalering påverkas av förändringar i neuronal aktivitet har stor betydelse för både normal synaptisk funktion samt processer underliggande neurologiska sjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Astrocyter svarar inom sekunder för stimulering av nervceller eller neuronala axoner med ökningar i cytoplasma Ca2 + följer nästan uteslutande från aktivering av astrocytiska Gq GPCRs. Exempelvis muskarinacetylkolinreceptorer 1, cannabinoidreceptors 2, α 1A adrenerga receptorer 3, 4 och grupp I mGluR (se nedan) är alla astrocytiska Gq GPCR subtyper som akut svarar på nervaktivitet. Aktivering av astrocytisk grupp I mGluR har demonstrerats i störst omfattning, efter stimulering av neuronal glutamaterg afferenter in situ (såsom akut hippocampus skivor) 5-7, såväl som i vuxen mus cortex in vivo efter sensorisk stimulering 8. Resultatet av aktiveringen av astrocytic Gq GPCR signalering på biologi och fysiologi av astrocyter, neuroner, eller astrocyternas-neuron interaktioner har varit en fråga för debatt 9-12. Det kommer att bli sågra tid innan funktionen av neuron-till-astrocyternas receptor signalering är helt uppskattat.
Även om det står klart att nervceller kan aktivera astrocytiska receptorer använder experimentella protokoll, det finns aspekter av neuron-till-astrocyternas receptor kommunikation som förblir dåligt kända. För det första, den faktiska mängden nervaktivitet som krävs för att aktivera astrocytic Gq GPCRs är inte väldefinierad, och andra, har förmåga astrocytiska receptorer för att ställa ut användningen beroende plasticitet fått lite uppmärksamhet. Till att börja ta itu med dessa frågor, nyligen utvecklat vi ett protokoll för att framkalla dubbelriktad skalning av astrocytic grupp I mGluRs i akut juvenil hippocampus skivor som svar på långsiktiga förändringar i nervaktionspotential (AP) beroende synaptisk aktivitet. I likhet med vad som har upptäckts för dubbelriktad homeostatiska plasticitet av neuronala jonotropa glutamatreceptorer 13, 14, astrocytisk grupp I mGluR skala upp following blockad av neuronala aktionspotentialer och skala ner när neuronal aktionspotential frekvensen ökar 15. Dessa kompensatoriska förändringar i astrocytiska receptorer kan mätas genom att spela in spontana och framkallade astrocyternas Ca 2 + transienter och jämföra egenskaperna hos dessa händelser till dem från astrocyter i kontrollförhållanden. I detta manuskript, beskriver vi hela den metod för användning av detta protokoll, inklusive utarbetande av akut hippocampus skivor, inkubationsförhållanden att inducera astrocyternas receptor skalning, astrocyte Ca 2 + indikator färgämne lastning, Ca 2 +-bildteknik som använder konfokalmikroskopi och förväntade effekter på astrocyternas Gq GPCR-aktivitet. Förutsägbara effekter på astrocyternas Ca2 + signalering egenskaper - som matchar de som registrerats tidigare i odlade celler transfekterade med olika uttrycksnivåer av Gq GPCRs - ger en "färdplan" som kan användas i framtida studier för att analysera förändringar i såtrocytic GPCR uttryck. Förgreningar och potentiella tillämpningar för användning av denna teknik kommer att bidra till vår förståelse av astrocyternas-neuronala interaktioner i den friska och sjuka hjärnan.
Protocol
De förfaranden som följer har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California, Riverside.
1. Konstruktion av inkubationskammaren och Slice Holder
- Constructing inkubationskammaren: Construct inkubationskammaren av material som är icke-toxisk. Se till att kammaren har luftcirculationen innehar en tillräcklig mängd av ACSF för ett segment innehavaren att flyta, och är tillräckligt stor så att segmentet hållaren kan flyta vid en ände av kammaren medan gasen dispersion från vätelinjer uppträder vid andra änden. Lådan parti av en pipett lagringsbehållaren med dess lufttätt lock (Figur 1A) passar dessa kriterier fint.
- Borra ett litet hål på sidan av behållaren ungefär 1 ¼ in från toppen och ¼ in från sidan. Montera en bit böjlig slang genom hålet (Figur 1B). Var försiktig för att borra tillräckligt låg så att slangen inte kommer att komprimeras när locket är stängt, men ändå tillräckligt hög så att den är ovanför lösningen.
- Sätt silikon söm tätningsmedel ("akvarium söm sealer") för att skapa en vattentät tätning mellan syreledningen och kammaren.
- Anslut den "utanför" änden av slangen till en gastank (95% syre, 5% koldioxid) med en han-Luer-kopplingen. För en skräddarsydd passform, cut-to-passa en naturlig fasad 200 l pipettspetsen (Figur 1C).
- Anslut den "inne" änden av slangen till en en-till-sex linje plaströret. Cut-to-fit sex 20 pl Eppendorf microloader pipettspetsar för varje grenrör inlopp (figur 1D). Den fina öppning av microloaders är idealisk för framställning av en stadig ström av små bubblor.
- För att tillåta ventilation, borra två små hål på locket på behållaren (figur 1E).
- Konstruera slice häldre: Skivhållaren är tillverkad av en Flytande Bubble Rack (figur 1F).
- Ta bort de nedre "ben" bubblan rack, och skär av toppen till approximativt 1 ¾ i.
- Limma en bit nylonnät material till botten av den runda kuggstången med hjälp av cyanoakrylatlim (såsom standard Krazy Lim) för att skapa ett åtta-brunnars skiva hållare (figur 1G). Varje väl kan passa en enda mus hippocampus slice.
- Montera slice hållaren vid en ände av inkubationskammaren och micro-grenrörsanordningen vid den andra änden. Låt micro tips att vila på kammarens golv (figur 1H). Denna inställning är utformad för att säkerställa tillräcklig syresättning till både toppen och botten av akut hippocampus skivor, och för att undvika bubblor kommer ut direkt under slice hållaren för att minimera slice agitation och förhindra direkt kontakt av bubblor med hippocampus skivor.
- Skölj inkubation kammare end slice innehavare noggrant med DDH 2 O efter varje experiment, och sanera med 70% EtOH i veckan. I fallet med inkubation skivor i olika lösningar, kommer multipla kammare / slice hållare behövas.
2. Lösningar och droger
- Artificiell cerebrospinalvätska (ACSF): Förbered 4 L av standard ACSF i DDH 2 O med användning av följande (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCOs 3, 15 glukos och 0,1 Trolox. Mät osmolaritet av lösningen med en osmometer, det bör komma till ~ 310 mOsm. ACSF-kompositioner för experimentella förhållanden beskrivs nedan (se protokoll 3). Filtrera alla lösningar med en 0,22 um flaska-top filtret i autoklaveras glasflaskor. Lösningar är stabila i 4 ° C i upp till en månad.
- Skivning Buffer: Förbered skivor med hjälp av en modifierad ACSF innehållande (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3,8 MGCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO 3, 15 glukos och 1,3 askorbinsyra. Mät osmolaritet av lösningen med en osmometer, det bör komma till ~ 310 mOsm. Byte av CaCl2 med MgCl2 i skivbufferten förbättrar slice hälsa.
- Sulforhodamine 101 (SR-101, 1 M) används för att identifiera astrocyter i akut hippocampus skivor. Lägg till en 1 mM stamlösning av SR-101 genom utspädning av 60,67 mg SR-101 i 100 ml av en modifierad låg kalcium ACSF ställdes såsom följer (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO 3, 15 glukos och 1,3 askorbinsyra. Verifiera att osmolariteten av den låga kalcium ACSF är ~ 310 mOsm. Späd 1 mM SR-101 lager 1.000 gånger i modifierad låg Ca2 + ACSF för lastning. Förvara den slutliga SR-101 lösning i 4 ° C och skyddas från ljus tills det behövs för experimentet.
3. Manipulering av Long Term neuron priser i akut hippocampus Slices
Använd en av två inkubation protokoll i separata försök att manipulera långa neuron priser:
- Hämmar neuron: Inkubera i tetrodotoxin (TTX, 1 M): VARNING: Hantera TTX med omsorg eftersom det kan vara dödlig om den intas i tillräckliga mängder. Handskar och skyddsglasögon rekommenderas. TTX avskaffar helt AP driven neuron i akuta skivor. Inkubera skivor i 3,5 mM K + ACSF, plus 1 mikroM TTX i experimentgruppen. I kontrolltillstånd, inkubera skivor i 3,5 mM K + ACSF utan TTX. Jämförelsen mellan de två villkor avslöjar uppskalning effekt i astrocytic Gq GPCR-aktivitet. 3,5 mM K + ACSF tjänar som kontrollgrupp (i motsats till säga, 2,5 mM K +), för att maximera effekten av TTX behandling.
- ELLER -
- Öka neuron ovanbasaldoser: Inkubera i hög kalium: Ökad extracellulärt K + koncentrationen depolariserar neuroner och ökar deras basala eldhastighet. Inkubation i 5,0 mM K + ACSF höjer markant neuronal aktionspotential frekvens jämfört med 2,5 mM K + ACSF 15. Inkubera skivor i 5,0 mM K + ACSF för experimentgruppen, samt för kontroll skick, inkubera skivor i standard 2,5 mM K + ACSF. Jämförelsen mellan de två villkor avslöjar nedskalning effekt i astrocytic Gq GPCR-aktivitet.
4. Akut hippocampus Slice Förberedelser
- Ställa in den varma återvinningskammaren:
- Värm vattenbad till 35 ° C, sedan placera beredda inkubation kammare inuti. Fyll vattenbadet med vatten upp till höjden av ACSF inom inkubationstid kamrarna (figur 1G).
- Oxygenat den experimentella och kontroll ACSF med 95% O2, 5% CO 2. Bubblorna som avges från microloader-grenrör apparat bör vara liten och riklig men också mild, det ska inte finnas någon synlig rörelse ACSF i kammaren.
- Ställa in iskall dissektion kammare:
- Ta två hinkar av is. Placera en flaska ca 300 ml skivningsbuffert i en hink med is och hålla den syresatt med 95% O2, 5% CO2 under 20 min. Sänk en 100 mm petriskål i det andra ishink, strax under ytan av is. Se till sidan av petriskålen är i direkt kontakt med isen. Häll lite skiv buffert i petriskål och hålla den syresätts också.
- Chill i framkanten av den enda kant rakblad genom att sänka ned den i iskall skiv buffert i petriskålen i mer än 1 minut.
- Vibratome setup:
- Slå på vibratome och se till att dräneringen är stängd.
- Fäst skärkammaren i vibralunta och packis runt skärkammaren. Förkyla den till 0-4 ° C.
- Ta fabriken fetter från dubbel kant rakblad genom att blötlägga den i 70% EtOH i 5 minuter och sedan skölja med ddH2O. Skär den i halvor försiktigt (inte böja bladet) och montera en halv bladet på klippblocket.
- Ta bort musen hjärnan:
- Söva en tolv till arton dagar gamla C57BL/6J mus i en liten kammare förladdad med 0,5 ml isofluran indränkt i en Kimwipe eller bomullstuss. Nyp försiktigt djurets tår att se till att det inte finns någon smärta reflex.
- Halshugga musen med hjälp av ett par vassa saxar, ta sedan bort hårbotten med små pincett. Använd små ben sax för att klippa skallen från lillhjärnan till lukt lökar längs den längsgående spricka. Ta bort de kraniala flikarna med hjälp av små pincett. Ta försiktigt bort hjärnan med en spatel, och dränka den i iskall syreskiv buffert i petriskålen.
- Bisect mushjärnan med kyld rakblad i petriskålen för att tillåta mer ytarea för kylning och syresättning. Låt den tudelade halvkloten sitta i iskall skiv buffert i 2-3 min. Hjärnan skulle bli helt cool och mer solid.
- Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat lim på plattformen av vibratome. Limma båda hjärnhalvorna till plattformen skurna sidan nedåt och laterala sidor upp, med luktbulben vänd framåt. Säkra plattformen i skärkammaren, fyll sedan skärkammaren med iskall, väl syresatt skiv buffert.
- Fortsätt att syresätta skärkammaren samtidigt förbereda 300 nm tjocka parasagittal skivor med hjälp vibratome. Skär skivorna vid en frekvens av 85 Hz, en framåtriktad hastighet av 0,20 mm / s, och en amplitud av 1,40 mm. OBS: Vi har funnit att den enskilt viktigaste variabeln för att förbereda friska akut hippocampus skivor är kvaliteten på vibratome. Vårt laboratorium använder Leica VT 1200 S magnetic kör vibratome med vibrocheck att minska "z" vibration.
- Efter skivning, dissekera hippocampus och intilliggande entorhinalcortexen ur varje parasagittal skiva med hjälp av vassa pincett. Utför den här proceduren i iskall, väl syreskiv buffert i skärkammaren i vibratome. Skärpan av tången är mycket viktigt att den skiva hälsa eftersom den minimerar hantering av skivorna.
- Gör en överföringspipett genom att bryta av den långa spetsen på en glas pasteurpipett och påfyllning den brutna delen med en pipett glödlampa. Detta möjliggör användning av den stora änden av pipetten för att överföra skivor. Se till att beställa pipetter utan bomullspropp i den stora änden (se Material tabell). Eftersom skivorna är upprättad i icke-sterila förhållanden, är det inte nödvändigt att autoklav pipetten före användning, även om en ny pipett bör förberedas och användas för varje experiment.
- Överför varje hippocampus skiva till inkubation kammare i 35 ° C vattenbad, genom doppning av överföringspipett i ACSF inuti varje brunn i slice hållaren och aspire segmentet. Minimera rörelse av skiva under denna process. Direkt överföring av skivorna till de varma inkubation bad ger bättre kvalitet skivor än "ramp" temperaturen upp gradvis.
- Låt hippocampus skivor för att återhämta sig i det varma vattenbadet för totalt 45 minuter, fördelade enligt följande: Inkubera skivor i 20 minuter i 1 ^ M SR-101 utspätt i låg kalcium ACSF, sedan överföra dem till den låga kalcium ACSF (utan SR-101) under 10 min. Därefter överför skivorna för att kontrollera eller experimentell ACSF för resterande 15 minuter av den varma inkubation.
- Efter 45 min varm återhämtning, försiktigt röra inkubationstidkamrarna från 35 ° C vattenbad för att bänkytan, och sedan tillåta skivorna att fortsätta att inkubera vid rumstemperatur under en total inkubationstid av 3 tim före början av bolus-lastning protokoll (se nedan). 5. Bolus Lastning av Astrocyter med Ca2 + Indikator
- Förbereda Ca 2 + indikator bolus-laddningsfärg:
- För varje flaska av färgämne (50 mikrogram), tillsätt 3.87 l av färska dimetylsulfoxid (DMSO) och skaka ordentligt. Den färskhet DMSO är viktigt för god lastning och därmed spricka öppna en ny ampull varje gång.
- Blanda i 9 | il av 20% pluronsyra och vortexa grundligt. Blanda färgen med 100 pl av den lämpliga experimentella eller kontroll ACSF och skaka väl, för en slutlig färgämneskoncentration på 10 pM.
- Filtrera lösningen genom att använda en centrifugfilterröret. Detta steg förhindrar att last pipetten från igensättning under utmatning av färgen.
- Förbered en pipett från en borosilikatglas kapillär dras till ett motstånd på ca 1,3 Mohm när den är fylld med färglösningen.
- Placera en hippocampus skiva i en inspelning kammare avsedd för användning med mikroskopoch kontinuerligt BEGJUTA med syresatt ACSF av samma sammansättning som den inkuberades i (1,5 ml / min). Växla mellan kontroll och experimentella förhållanden när man väljer en hippocampus slice.
- Kasta ohälsosamma letar hippocampus skivor. Kvaliteten på skivor kommer att variera även inom ett givet experiment. Det finns inga fastställda kriterier för kvantifiering slice hälsa, och därför är subjektiv och bygger främst på erfarenheter bestämning av slice hälsa.
- Generellt sett hålla skivor som har en slät uppträder yta och en hög andel av friska CA1 pyramidala celler (Figur 2A). CA1 pyramidala celler är särskilt känsliga och sårbara för CNS förolämpningar, så att ha en stor andel (≥ 75%) av den friska CA1 pyramidala nervceller kan vara ett användbart kriterier för att acceptera eller avvisa en slice.
- Släng skivor som har ungefär> 25% döda nervceller. Dead neuroner har ett stekt ägg-liknande utseende (figur 2B). NOTERA: Vi have observeras att vinkeln för snittet spelar en viktig roll i huruvida neuroner verkar friska eller inte. Om neuronala dendriter projicerar uppåt (av segmentet), då nervceller blir mestadels död. Detta beror förmodligen på att en så stor andel av neuron volymen är innesluten i den dendritiska trä, för att avskilja dendriterna är dödlig för cellerna. Å andra sidan, om dendriterna projicerar parallellt med eller i en nedåtriktad vinkel från skiva yta, kommer det att finnas en hög procentandel av friska nervceller. Ibland kommer därför neuroner vara mestadels döda på en sida av skivan och hälsosam se på den andra sidan.
- Leta upp en lämplig området sr astrocyter 40-70 um under skiva yta baserat på storlek, morfologi, och läge med hjälp av differential interferens kontrast (DIC) optik.
- Ladda glaspipett med färgämneslösning och sänk ner den på ytan av den del över detta område med en vanlig patch-clamp mikroelektrod holder. Med pipetten vid ytan av den del, applicera mottryck till pipetten till börjar utstötnings färgämne. Utmatning av färg kommer att vara synlig under både DIC optik och en lämplig laser såsom en 488 rad för ett grönt färgämne.
- Långsamt sänka pipetten till cirka 40 pm under slice ytan med en mikromanipulator och låta färgen att mata ut cirka 45-60 sekunder. Därefter, sänk pipetten ytterligare 35 nm (75 nm under slice yta) och mata färgämne för ca 45-60 sek. Sakta tillbaka pipettspetsen från skiva. Kortare insprutningstiden kommer troligen att resultera i otillräcklig dye loading, medan längre injektion tenderar att öka bakgrundsbelastning, vilket minskar signal-till-brus-förhållande av inspelningen.
- För att säkerställa att ett stort antal astrocyter tar upp färgen, är det oftast bra att injicera ett andra färgämne bolus en bit bort. Höj pipetten tillbaka till ytan på skiva, kontrollera att pipetten inte är igensatt, då move pipetten approximativt 80 till 100 ^ m bort från den första injektionsstället, tillsammans stratum radiatum. Upprepa bolusinjektion på den här webbplatsen.
- Tillåt 30-45 min före avbildning för astrocyterna att ta upp färgämnet och för bakgrundssignalen att minska. Låt skiva i perfusionskammaren under denna tid. Se till att denna inkubationstid är inbyggd i den totala 4 tim behandling av experimentet. Skaffa nästa skiva och upprepa steg från 5,2 till 5,8.
- Ställa in konfokalmikroskop för avbildning:
- Begränsning slice exponering för laserljus är av yttersta vikt, eftersom hög exponering kan leda till färgning blekning och / eller fototoxicitet. Använda högre optisk förstoring eller höjda zoom ökar ljusexponering till det avbildade området. Därför, ange standardvärden för varje laser till en hög fotomultipli setting, 1x vinst och 0,5% laser uteffekt.
- Applicera en 1,5 x zoom för bättre visualisering av astrocyternas processer.
- Ställ in fältet upplösningen till 512 x 512 bildpunkter.
- Ställ in skanningshastighet på snabbast möjliga, vilket är ~ 1,2 sekunder per skanning med hjälp av ett sätt läget scan.
- Samla emissionsspektra med hjälp av bandpassfilter av 503-548 nm för 488 nm laser, och 624-724 nm för 559 nm laser. Dessa inställningar tillåter avbildning av ett fält av ~ 5-8 astrocyter i relativt snabb hastighet med en upplösning tillräckligt att konstatera astrocyternas cellkroppar och huvudprocesser. Helst ska astrocyter inom området vara stark nog att ses tydligt, men utan någon pixel mättnad.
- Bekräfta identiteten av celler laddade med Ca2 + färgämne som astrocyter genom att visualisera den SR-101 colabeling med hjälp av 559 nm laser.
- Inspelning astrocyte Ca2 + aktivitet:
- Rita rutor med hjälp av bilden förvärvet programvara över områden av intresse (ROÄr) i cellen, i detta fall över astrocyternas cellkroppar. Lådorna får inte innehålla bakgrundspixlar, för att uppnå bästa signal-till-brus-förhållande möjlig. Rita en ruta över bakgrund som referens.
- Växla perfusionen experimentell ACSF plus 1 mikroM TTX (Abcam) genom återstoden av experimentet. Detta eliminerar eventuella neuronala AP-drivna astrocyternas kalcium svar. Kvar ökningar astrocytisk Ca2 +-koncentrationen kommer då att vara på grund av quantal vesikulär frisättning, konstitutiv (basal) GPCR-aktivitet, eller en kombination av båda mekanismerna.
- Rekord fluorescens över tiden från alla ROI. Eventuella ökningar i fluorescens över baslinjen indikerar ökningar i cytoplasma Ca2 +-koncentrationen 16, och därför GPCR aktivitet i astrocyter 10, 17, 18. För att undvika eventuella tidiga skaleffekter på astrocytiska receptorer av TTX, kompletta experiment inom 40 min frOM den tidpunkt då 1 ^ M TTX perfusion började.
- Efter att ha fått 10 min av baslinje inspelning av spontana Ca2 + aktivitet, tillämpa en agonist av intresse (t.ex. DHPG) vid sekventiellt ökande koncentrationer. Lämna minst 5 minuter mellan program för att minska eventuell receptor hyposensibilisering.
- I slutet av inspelningen, tillämpa en cocktail av agonister för andra astrocytiska Gq GPCRs som en positiv kontroll för intakt astrocytic Gq GPCR signalvägar. Komponenter av agonisten cocktail kommer att bero på receptorn av intresse. 10 | iM av vardera av Gq GPCR-agonister histamin, karbakol och 2Na-ATP för att stimulera histamin-H1-receptorer [H1R], muskarina acetylkolinreceptorer [mAChR] och purinerga receptorer [P2YR], respektive, är ett vanligt använt agonist cocktail.
- Post-experiment bildtagning:
- Vid slutförandet av Ca2 + inspelning, ta stillbilder med 488 nm och 559 nm lasrar, feller senare bekräftelse av astrocyternas identitet och ROI placering. Laser kraft-och HV-inställningar kan ändras fritt på denna punkt för att uppnå en optimal bild för colocalization, eftersom det inte längre finns en oro för laserljusintensitet påverkar data (Figur 2A).
- Upprepa steg från 6,1 till 6,3 för en total av ca 8 segment och 40 astrocyter / grupp. Skivor ska komma från minst 3 olika möss.
- Definiera en Ca2 + höjd: Standardisering definiera Ca 2 + transienter har inte fast etablerad inom den vetenskapliga världen. Vad som följer är en typisk protokoll som maximerar känsligheten samtidigt begränsa upptäckt av falska positiva händelser ur baslinjen buller.
- Har en annan labbmedlem tilldela varje skiva en numerisk kod för att analysera dem blint. Vid slutet av analysen, avkoda varje skiva.
- Analysera spontana och framkallade astrocyternas Ca 2 + höjder offline med hjälp av bildanalys programvara. Rita och / eller justera storleken, formen och placeringen av ROI som önskas.
- Resultat ökningar i fluorescensintensiteten över baslinjen som en Ca2 + höjd om topp amplituden är större än två standardavvikelser (SD) över medelvärdet på 30 sekunder av genomsnittlig baslinje fluorescens i minst två provpunkter i följd. I särskilt brusiga inspelningar (lågt signal-till-brus), kan detta villkor behöva justeras till 3 SD över medelvärdet för fluorescens. Definiera starten av varje Ca 2 + höjd som den sista datapunkten innan fluorescensintensiteten är större än en standardavvikelse över medelvärdet.
- Skilja mellan multipeak vs successiva enda toppevenemang. Betyg en händelse som "multipeak" när fluorescensintensiteten inte återgår till baslinjen (under genomsnittet utgångsvärdet +2 SD) för &# 8804, nio på varandra följande datapunkter (10,8 sek) mellan topparna. Således kommer enda topp händelser har 10 eller fler på varandra följande grundlinjedatapunkter i-mellan dem.
- Klassificera händelser som "platå"-typ-reaktioner när fluorescensintensiteten bibehåller toppamplituden (± 10% av toppvärdet) under minst 3,6 sek.
- Analysera amplitud, frekvens och kinetik för spontana och agonist-framkallade kalcium transienter.
- Definiera toppamplitud av Ca 2 + höjd som datapunkten med den högsta intensitetsvärdet (i fall av "multipeak" svar använder den första toppen, se figur 2B).
- Beräkna stigtid som skillnaden mellan responsen debut och den tid som motsvarar toppamplituden. ANMÄRKNING: 0 till 100% stigtid kan behöva användas för att få ett tillräckligt antal datapunkter för att erhålla en tidsvärde, skanna hastighet är en viktig variabel här.
- Beräkna latens som tidenmellan påbörjandet av agonist perfusion till svars debut. Rise tid kan vara ett mer användbart mått i hjärnan skivor, så länge tvätta tiderna skapar en förväxla vid beräkning av svars latenser.
- Avgör om det finns statistiskt signifikanta skillnader mellan de två grupperna för varje parameter med användning av Students oberoende t-test. Använd antal astrocyter som "n". Använd Pearsons chi-två test för att jämföra Ca2 + aktivitetsmönster mellan kontroll-och behandlingsgrupperna. Använd Fishers exakta 2 hypotesprövning för att jämföra procentandelar av specifika Ca2 + aktivitetsmönster mellan kontroll-och behandlingsgrupperna. Uttryck olikheter som * p <0,05, ** p <0,01 och *** p <0,001.
6. Inspelning Spontan och Gq GPCR Agonist-framkallade astrocytiska Ca2 + aktivitet i hippocampus Slices
7. Analys av Astrocyte Ca2 + Aktivitet
Representative Results
Representativa resultat i Figur 3 visar effekten av inkubering av akuta mus hippocampus skivor i TTX för 4-6 tim på sr astrocyt Ca 2 +-aktivitet. Uppgifterna inkluderar både spontana Ca 2 + transienter och DHPG-framkallade grupp I mGluR Ca 2 + svar, från skivor inkuberade kontroll ACSF vs ACSF plus TTX. Annat än grundläggande karakteristiska morfologiska drag, stelprocess montering och små soma storlek (~ 10 mikrometer), är astrocyter identifieras i sr genom överlagring av Ca 2 + indikator OGB-1:00 med den selektiva astrocyte markören SR-101 19 20 ( Figur 3A). De numrerade rutorna över astrocyternas cellkroppar motsvarar den numrerade fluorescens över tid spår som visas i figur 3B. I grupp 1 mGluR agonist (RS)-3.5-DHPG tillämpas för att fastställa de specifika skaleffekter grupp 1 mGluRs i astrocyter. För att skilja mellan fysiology i specificitet skalningseffekten att gruppera ett mGluRs kontra andra Gq GPCRs, är en cocktail av agonister appliceras vid slutet av varje experiment. Här har vi använt 10 mikroM vardera av GQ GPCR agonister histamin, karbamylkolin klorid (karbakol) och adenosin-5'-ATP dinatrium (Na-ATP). Agonist cocktail tjänar också som en positiv kontroll för att identifiera livskraftiga, responsiva astrocyter i fall där celler inte svarar på DHPG, förmodligen därför att dessa särskilda astrocyter uttrycker inte tillräckliga mängder av receptor för att framkalla ett svar på DHPG.
Vi använde olika koncentrationer av DHPG, inklusive 5 ^ M och 15 ^ M (Figur 3B) samt 30 ^ M och 50 ^ M (Figur 4A) för att hjälpa till att avslöja förändringar i astrocytic grupp I mGluR. Förhållandet mellan cellulära Ca 2 + svar och Gq GPCR expressionsnivåer har undersökts tidigare in vitro 21-24. Först,tröskelvärde för att svara på en särskild agonist koncentration beror på tätheten av receptorer som uttrycks av varje cell. I en population av celler, flera celler svarar med en Ca 2 + höjd till en given koncentration av agonist när cellerna transfekteras med en högre täthet av receptorer. Efter inkubering skivor i TTX, procentsatsen av astrocyter i befolkningen reagerar till en fixerad koncentration av agonist ökar (fig. 3B och 3C). Vi har funnit att 5 pM och 15 pM DHPG visar tydliga skillnader i den procentuella andelen av responsiva astrocyter mellan manöverorganet och TTX behandlade celler, medan 30 och 50 pM DHPG krävs för att jämföra grupp I mGluR-responser i 5,0 mM K + behandlade jämfört med kontroll celler (Figur 4A).
Förhållandet mellan astrocytiska Ca2 + svarsmönster och agonist koncentration har också undersökts på plats. Ökande agonistenkoncentration skiftar mönstret av Ca 2 + svar i astrocyter från enda topp Ca 2 + höjderna för multipeak och platå Ca 2 + förhöjningar 25-27. Baserat på dessa tidigare fynd, förutspådde vi att svarsmönstret på en enda koncentration av agonist kommer att ändras om det sker förändringar i nivån av receptoruttryck. Således, beroende på vilken av de två skal metoder utnyttjas (hämmande neuron eller öka det), kommer koncentrationen av agonist som krävs för att producera en viss svarsmönster öka eller minska. Till exempel astrocyter ruvade i TTX flytta sin DHPG-framkallad Ca2 + svarsmönster till mer platå-typ Ca2 +-höjder och svara på lägre agonist koncentrationer jämfört med kontroll astrocyter (Figur 3C). Med beaktande av tidigare studier, dessa observationer tyder på att grupp I mGluR receptor uttryck nivåer i astrocyter har ökat.
Stigtid och insättande (latens) av Ca 2 +-förhöjningar har också visats att direkt korrelerar till förändringar i Gq GPCR-expressionsnivåer i odlade celler 22-24. Högre receptor uttryck nivåer resulterar i kortare svars latenser och snabbare stigtider medan minskning av receptortäthet ger motsatt effekt. För astrocyter inkuberade i TTX, Ca 2 + transienter framkallade genom tillämpning av DHPG har betydligt snabbare stiger gånger jämfört med astrocyter inkuberade kontroll ACSF (Figur 3D). Som tidigare nämnts, amplituderna för agonist-framkallade Ca2 +-responser förblir oförändrade oberoende av agonistkoncentrationen eller skalningsmodellen 15 (figur 3D).
Utöver de förändringar som observerats genom direkt aktivering grupp I mGluR med DHPG, är spontan astrocyte Ca2 + aktivitet också signifikant av denna manipulation. Vi observerarda 2,26-faldig ökning av andelen spontant aktiva astrocyter inkuberas i TTX kontra kontroll. Det är en ökning från endast 12,9% av kontroll astrocyter som uppvisar spontan aktivitet i somat till 42,1% i TTX inkuberade astrocyter (Figur 3E). Eftersom det är känt att GPCRs utställningen "inneboende" eller konstitutiv aktivitet i frånvaro av agonist 21, 26, 28, och att nivån på denna inneboende aktivitet ökar med ökande receptor uttryck nivåer, dessa uppgifter tyder på att tätheten av astrocytiska Gq GPCRs ökar efter långsiktig minskning av neuronal aktionspotential bränning. Liknar agonist framkallade svar, är stigtider för de spontana Ca2 +-höjder också ökat (figur 3E).
Representativa data med hjälp av det andra protokollet, inkubation i förhöjda extracellulära kalium (5,0 mM), visas i Figur 4. En ökning av extracellulära K + 2,5-5,0 mM resulterar i en betydande ökning av basal CA3 neuron aktionspotential frekvens 15. Högre koncentrationer av DHPG (30 pM och 50 pM) är nödvändiga för att framkalla grupp I mGluR Ca 2 +-responser från astrocyter inkuberade i höga kalium (figurerna 4A och 4B). Detta stämmer överens med en reducerad nivå av grupp I mGluR lyhördhet i astrocyter efter en långsiktig ökning av neuronala aktionspotentialer. Dessutom framkallade svaret mönstret till en fixerad koncentration av DHPG skiftar från platåliknande svar på svagare enkeltoppsvar (figur 4B). Undersöka procentsatsen av spontant aktiva astrocyter i två kaliums betingelser avslöjar att färre astrocyter inkuberade i hög K + är spontant aktiva jämfört med kontrollen tillstånd (Figur 4C). Denna effekt är i oppositione riktningen av TTX tillstånd där den procentuella andelen av astrocyter som uppvisar spontana Ca2 + höjder ökas. Senaste, både framkallade och spontana Ca2 +-höjder har långsammare stigtider i astrocyter inkuberade i hög K + jämfört med kontrollgrupp (figur 4C och 4D). Sammantaget antyder dessa data att astrocytiska Gq GPCR uttryck nivåer skala dubbelriktat beroende på graden av neuronal aktionspotential aktivitet under en längre tidsperiod.
Figur 1. Slice inkubationskammare tillverkning och ställa in. (A) Lådan del av en Brinkmann pipett förvaringsbehållare tillsammans med sin lufttätt lock används för att konstruera slice inkubation kammaren. (B) Drill ett hål i sidan av behållaren ungefär 1 ¼ in från toppen och ¼ in från sidan. Sätt i ett stycke flexibel slang. (C) Anslut micro-grenrörsanordningen till inuti änden av den flexibla slangen. Observera cut-to-fit naturliga 200 l pipettspetsen (vit pil). (D) Sex 20 il Eppendorf microloaders skärs-to-fit till ett en-till-sex linje grenrör för att skapa en microloader-grenrör apparat. (E) Borra två små hål på locket. (F) En Flytande Bubble Rack för att göra segmentet hållaren. (G) De nedre "ben" flytande bubbla rack tas bort så att en bit av nylon mesh material kan limmas i botten. (H) Fyll inkubationskammaren med tillräcklig mängd ACSF så att slice innehavaren flyter. Justera slanglängden så spetsarna på microloaders kan vila på ett hörn av kammargolvet. Vid placering inkubationskammaren ivattenbadet, ska vattennivån i badet vara på samma nivå som den ACSF i kammaren. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Uppskattning av slice hälsa. (A) En fräschare hippocampus skiva med hjälp av differential interferens kontrast (DIC) optik. Friska skivor ha en slät, sammetsliknande utseende och en hög andel av friska CA1 pyramidal neurons. Notera de apikala dendriter som skjuter in i stratum radiatum. Patch-clamp av nervceller som ser ut som de som visas här avslöjar en låg vila membranpotential (-61 till -62 mV) i standard 2,5 mM K + ACSF med några spontana aktionspotentialer. Membranpotential och bränning priser kommer att variera som en funktion av extracellular K + (Xie et al. 15). Pilarna pekar på förmodade astrocyter. Förkortningar: sr, stratum radiatum, s.py., stratum pyramidale. Scale bar, 10 | im. (B) Ohälsosamma skivor kommer att ha en hög andel döda CA1 pyramidala nervceller, som ser ut som stekta ägg (vita pilar pekar på kärnor av döda nervceller - den "gula" av stekt ägg). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Inspelning förstärkt Gq GPCR aktivitet och framkallade grupp I mGluR Ca 2 + svar efter långvarig hämning av neuronala AP genom inkubation i TTX. (A) Representativa bilder av celler i inspelningsområdet inkuberas i cONTROL förhållanden (övre paneler) eller i TTX (lägre paneler) som har tagit upp Oregon Grön BAPTA-01:00 Ca 2 + indikator färgämne (vänster paneler) och SR-101 (mitten paneler). Skala bar är 10 mikrometer. Överlagring av båda signalerna ("slå ihop") indikerar att astrocyter last med Ca 2 + indikator. Lådor dras över enskilda astrocyternas soma att registrera fluorescensintensiteten över tiden i den gröna kanalen för att övervaka Ca2 + aktivitet i astrocyter. (B) Exempel på spår från inspelningsrutorna i A) av Ca2 + aktivitet i astrocyter. Astrocyter inkuberade i TTX visa ökade spontan aktivitet och mer robust evoked grupp I mGluR Ca 2 +-responser vilket bevisas av förändringar i mönstret för svar. Exempel på enkel topp (cirkel), multipeak (rektangel) och platå (streckad rektangel) Ca 2 + transienter visas. (C) Förändringar i svarsmönster är särskilt tydligt med hjälp av olika concentransoner i grupp I mGluR-agonist DHPG. Fler multipeak och platå svaren är uppenbara efter inkubation i TTX jämfört med kontroll vid en given agonist koncentration. (D) Rise tider av DHPG framkallade Ca 2 + svar snabbare i astrocyter inkuberade i TTX jämfört med kontroll (övre panelen), medan amplituder ändras inte (nedre panelen), ett tecken på "allt-eller-inget" svars amplituder gång tröskeln för att svara har uppnåtts. (E) Rise tider av spontan astrocyte Ca 2 + transienter är också snabbare i TTX inkuberas vs kontroll inkuberas astrocyter (övre panelen), medan andelen av astrocyter i befolkningen uppvisar spontana Gq GPCR Ca 2 +-aktiviteten ökar (nedre panelen). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Inspelning minskat astrocytic Gq GPCR aktivitet och framkallade grupp I mGluR Ca 2 + svar efter långvarig ökning av neuronala AP genom inkubation i förhöjda extracellulära kalium. (A) Representativa spår av astrocyternas Ca 2 +-inspelningar från skivor inkuberas i 5,0 mM K + ACSF att depolarisera nervceller och öka deras basala eldhastighet jämfört med kontroll ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocyter inkuberade med 5,0 mM K + ACSF uppvisar färre spontana somatiska Ca 2 + transienter och svagare DHPG evoked potential jämfört med astrocyter inkuberade kontroll ACSF. (B) En jämförelse av mönster av evoked potential till flera koncentrationer av DHPG avslöjar svagare typer svars efter långvarig ökning av neuronala AP. (C) En minskad procentandel av astrocyter i pofolkning som uppvisar spontan Ca2 + aktivitet observeras efter långvarig inkubering i förhöjd K + jämfört med kontroll ACSF (övre panel), medan stigtider för den spontana aktiviteten bli långsammare (lägre panelen). (D) Rise tider av frammanade astrocyte Ca 2 + svar på olika koncentrationer av DHPG blir långsammare efter 5,0 mM K + behandling jämfört med astrocyter inkuberade kontroll ACSF. Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
De beskrivna skalmodeller representerar praktiska metoder för att forska långsiktig plasticitet astrocytic grupp I mGluR. Imaging spontana och framkallade Ca 2 +-evenemang ger en känslig analys för att mäta förändringar i astrocytic Gq GPCR-aktivitet, som konkreta bevis har fastställts att astrocyternas Ca 2 + höjder inträffar efter utsläpp från IP 3 R känsliga butiker nedströms Gq GPCR aktivering 10, 12, 17, 18. Andelen astrocyter i befolkningen svarar på grupp I mGluR-agonist och mönstret av sådana Ca 2 + svar rapportera förändringar i grupp I mGluR av astrocyter.
Den specifika teknik som används för att ladda astrocyter med Ca 2 + indikator är en viktig faktor vid utformningen av experiment för att leta efter förändringar i astrocytic Gq GPCR-aktivitet. Bolus-lastning eller bulk-lastning flera astrocyter, eller patch-clamp lastning av individuella astrocyter kan användas för att bild Ca 2 +-transienter i astrocyter. Varje metod har vissa fördelar och nackdelar. Direkt fylla astrocyter med Ca 2 + indikator via patch clamp medger entydig identifiering av cellen som astrocyte utan behov av en sekundär markör såsom SR-101. Patch-clamp leverans av indikator möjliggör också inspelning av Ca2 + aktivitet från små astrocytiska fack inklusive buskiga fina processer, potentiellt djupare i segmentet där cellerna är friskare och med fler intakta interaktioner med synapser (beroende på lasereffekt som finns tillgänglig). Emellertid lider patch-clamp lastning från låg genomströmning eftersom data samlas in en cell i taget. Bulk-lastning, däremot, tillåter ett stort antal astrocyter vara belastad med Ca2 +-indikator och avbildas samtidigt. Det är dock bara astrocyter nära ytan (<20 ^ m) av den del lastas, med tillhörande oros om cell hälsa och intakta synapser.
Den mottrycks bolus-lastprotokoll presenteras här erbjuder en medelväg, med relativt hög kapacitet och förmåga att övervaka Ca2 + aktivitet djupare inom segmentet (40-75 mikrometer). En betydande ökning av andelen spontant aktiva astrocyter med hjälp av bolus-laddningsteknik observeras jämfört med bulk-belastning, vilket tyder på att sambanden mellan neuronala synapser och astrocytiska processer är mer komplett 15. Med god belastning, kan man ofta följa Ca2 + aktivitet i huvudprocesser för astrocyter (data visas ej) eller potentiellt ännu mindre fack med hjälp av 2-foton mikroskopi. Men skulle omsorg måste iakttas vid tilldelning de mindre processerna till en viss astrocyte, eftersom gränserna smälta in i icke-specifik bakgrundsfärgning. Ett ytterligare problem med hjälp av bulk-lastning eller bolus-lastningsförfaranden är behovet av en sekundär markker för astrocyternas identifiering. Även om det har varit känt i många år att astrocyter företrädesvis ta upp AM ester Ca2 +-indikatorer, är den sekundära markören SR-101 används ofta för att kontrollera de laddade cellerna som astrocyter. SR-101 kan i sig förändra den inneboende retbarhet av nervceller 29. Användning av SR-101 bekräftar behovet av att utföra alla astrocyternas Ca 2 +-mätningar i TTX för att begränsa eventuella SR-101 effekter på neuronala retbarhet. Om man antar att både kontroll-och experimentgrupper innefattar SR-101, bör markören i sig inte hänsyn till de effekter som observerats i astrocyternas Ca2 +-signalering efter långvarig manipulation av neuronala aktionspotentialer. SR-101 kan vara mer av ett problem i hög K +-experiment, men eftersom det kan minska skillnaden mellan 2,5 mM K + vs 5,0 mM K +, om de basala eldhastighet inte ändras proportionellt.
En mycket lovande metod för att leverera Ca2 + 2 + färgämnen. Betydande framsteg har gjorts under de senaste åren med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) riktade till astrocyter 30-32. GECIs kan levereras till astrocyter genom in vivo-mikroinjektion av adenoassocierade virala vektorer in i en hjärnregion av intresse, såsom hippocampus. Uttryck av GECIs uppnås efter cirka två veckor efter virusinfektion 32. Det finns många fördelar som presenteras med hjälp av GECIs i astrocyter. Först är de vektorer som riktas till astrocyter med användning av en astrocyt specifik promotor, så att de märkta cellerna är astrocyter 32. För det andra verkar den signal-till-brus nu jämföras med det som kan erhållas med användning av patch-clamp avgivning av färgämne, men utan invasivitet av att ha haft en patch-pipett på cellen 32. För det tredje kan indikatorerna vara delivered och uttrycks i vuxen vävnad, vilket är problematiskt att använda bulk-lastning leveransmetoder. Vidare är uttrycket mosaik, som erbjuder förmågan att särskilja mellan flera astrocyter. Sålunda kan flera astrocyter potentiellt avbildas samtidigt, medan också inspelning i soma och fina branch samtidigt. Därför kan eventuellt en enskild teknik kan användas i stället för tre olika tekniker (bulk-lastning, bolus-lastning, och patch-clamp lastning) för att spela in skalnings aktivitet astrocytiska Gq GPCRs, kraftigt ökar effektiviteten.
En potentiell nackdel med att använda viral-medierad leverans av Ca 2 +-indikatorer för astrocyter är den möjliga effekten på skiva hälsa 32. Det adenoassocierade virala vektorer som används för att leverera de GECIs har visats tidigare för att orsaka reaktiv glios av astrocyter 33. Beredning av hjärnan skivor i allmänhet sannolikt initierar tidiga stadier av patologi inklusive frisättning av inflammatory molekyler 10. Därför, i kombination med de långa inkubationstider som krävs för att framkalla skalning av astrocytiska receptorer, användning av GECIs levereras med hjälp av virala vektorer skulle behöva få ytterligare ersättning i samband med slice hälsa i dessa typer av experiment.
Vid användning av detta protokoll, är det viktigt att hålla i minnet att applikationstiden för agonist för att producera ett svar kommer att variera som en funktion av receptor tillgänglighet. För en given koncentration av agonist, kommer applikationstiden måste vara längre om receptorer har skalats ned och kortare om receptorer har skalas upp, för läkemedlet att nå en adekvat koncentration i vävnaden för att aktivera receptorer i tillräcklig utsträckning för att producera en Ca 2 + respons. Därför kan drogansökningstider och potentiellt deras koncentrationer, att behöva justeras beroende på den avsedda riktningen för skalning. Till exempel kan agonistkoncentrationen måste sänkas i Case av TTX för att undvika mätt svar, och ökade efter inkubation skivor i hög K + för att ens se ett svar. Närmare bestämt var det DHPG koncentrationen skiftat 5-15 mikroM efter TTX behandling till 30-50 mikroM efter 5,0 mM K + behandling för att studera Ca 2 + svarsmönster, som 5-15 mikroM var ofta för låg för att få fram tillförlitliga svar i astrocyter efter nedtrappning av grupp I mGluRs.
Inspelning av astrocyternas Ca2 + aktivitet ger något direkt bevis för receptor insättning eller internalisering till eller från plasmamembranet. Men baserat på den märkliga likheten av data med data från tidigare studier in vitro som granskade det direkta förhållandet mellan Gq GPCR uttrycksnivåer och spontana och framkallade Ca 2 + transienter 21-24, det mest logiska tolkningen av förändringarna i Ca2 + signalering är att astrocyternas ytreceptor expressionsnivåer harförändrats. En kompletterande strategi kan vara en viktig faktor om man vill ge ytterligare bevis om orten för effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi som vi använde var att undersöka effekten av TTX inkubation på hippocampus skivor från astrocytiska MrgA1R möss. Dessa transgena möss uttrycka en främmande Gq GPCR (det MrgA1R) endast i astrocyter. Därför att denna receptor är inte naturligt i hjärnan, finns det ingen endogen neurotransmittor närvarande för att ändra dess aktivitetsnivå. Tidigare arbete föreslog att denna receptor engagerar samma intracellulära signalmolekyler som endogen grupp I mGluRs i samma astrocyter 34. Efter långvarig inkubation av skivor från MrgA1R möss i TTX, inga skillnader i agonist-framkallade MrgA1R svar jämfört med kullkontroll inkuberas skivor skulle ge belägg för att effekten på astrocyternas Ca2 + aktivitet beror på förändringar lokaliserade till ytan receptorn, särskilt om grupp I mGluR svar är fortfarande betyär markant förbättrad i samma astrocyter. Ett alternativ, men kanske mer involverad strategi skulle vara att isolera astrocyter från skivorna för Western blot-analys, så länge som en membranfraktion skulle kunna analyseras förändringar i yt-receptorexpressionsnivåer. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) eller flödescytometri kan vara till hjälp här.
Möjliga tillämpningar av denna teknik för studiet av neuroner, astrocyter och astrocyternas-neuronala interaktioner är många. I våra experiment, bara DHPG-framkallade grupp I mGluR astrocytiska Ca 2 + svar studerades, i isolerade akut hippocampus skivor från unga möss. Detta preparat har inte bara de intakta afferenter (Schaffer säkerheter), men också de nervceller som ger upphov till dem (CA3 pyramidala celler), vilket gör det möjligt att manipulera tändsatser för dessa glutamaterg nervceller på de postsynaptiska celler (CA1 pyramidala celler) och astrocyterna i stratum radiatum vars processer intressebolage med dessa synapser. Den akuta hippocampus slice är kanske inte den bästa förberedelsen för att manipulera tändsatser för andra typer av nervceller, dock så många afferenter avskiljas från de nervceller som ger upphov till dem. Icke desto mindre kan det vara möjligt att i vissa slice beredningar att observera plasticitet andra astrocytiska Gq GPCR-subtyper. Exempelvis kan skivorna framställas med basala framhjärnan kolinerga neuroner och deras projektioner till hippocampus intakt. Inkubation av dessa skivor i TTX eller förhöjt K + skulle påverka basal bränning priser av kolinerga nervceller, vilket leder till skalning av mAchRs i astrocyter av stratum oriens, som får en betydande del av det kolinerga ingång 1. En alternativ ännu oprövad tillvägagångssätt att studera astrocytisk receptor skalning inom ett visst område i hjärnan, med alla anslutningar intakta medan skalning sker skulle kunna vara att använda en in vivo-modell, där en fördröjd frisättning av TTX uppnås genom implantation av en plastic polymeren Elvax 40W ovanför det intressanta området 35. Denna metod har tidigare använts i en studie av neuronal skalning men bör också vara tillämpliga på astrocytic skalning. Slutligen, med korrekt avläsning kan framtida studier undersöka andra GPCR familjer, inklusive förändring i G s eller G I GPCRs. Man kan förutsäga astrocytisk GABA B-G i GPCRs att påverkas efter hämning av bränning i lokalt utskjutande GABA interneuronen inom någon skiva beredning. Utveckling av nya indikatorer efter andra signalmolekyler, såsom en realtidsindikator för den andra budbäraren cAMP, skulle öppna upp ett helt nytt forskningsområde på neuron-till-astrocyternas receptor kommunikation.
Dubbelriktad skalning av astrocytiska mGluRs genom manipulation av basal neuron bränning priser ger ett mått på känsligheten för astrocyter till AP-medierad frisättning av signalsubstansen. Astrocyter kan tydligen känna spontana AP och glutamate utgåvan vid Schaffer säkerheter-CA1 pyramidal cell synapser även när extracellulärt K + är inom ett fysiologiskt intervall. Medan akut tillämpning av TTX inte minska frekvensen av spontana astrocyte Ca2 + aktivitet 18, 36, 37, Ca2 + aktivitet bland astrocyter i befolkningen blir avkorrelerade 36, som styrker att astrocytiska receptorer är AP-detektorer. Detta tyder på att astrocyterna känner av spontana neuronal APs utan inverkan på deras totala Ca2 + aktivitet. Det är allmänt accepterat att intracellulära koncentrationer av IP 3 behöver för att nå en tröskelnivå för att stimulera IP 3 Rs tillräckligt för att leda till en detekterbar Ca2 + höjd. Kan spontana neuronal AP aktiverar astrocytiska GPCRs utan att producera mätbara Ca 2 + höjder? Framtida studier kunde utnyttja fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) eller något liknande Techn ique (t.ex. BRET) för att undersöka förhållandet mellan G-proteinkoppling till receptorn (ett mått på receptoraktivering) och Ca 2 + frisättning från interna affärer. BRET har använts i stor utsträckning in vitro för att detektera G-protein-till-GPCR koppling 38, även om det kan dröja innan tekniken blir tillgänglig för användning i intakta vävnadspreparat. Det är möjligt att astrocytiska Gq GPCRs är aktiveras mycket oftare än vad som kan spelas in med hjälp av de tillgängliga Ca2 + bildframställning. Förutom att känna av aktionspotentialer, kan astrocytiska Gq GPCRs också kunna detektera miniatyr quantal frisättning av signalsubstansen som rapporterats i en nyligen genomförd studie 39. Den dubbelriktade skalning metod som beskrivs här kan användas i framtida studier för att ge ett mått på i vilken utsträckning astrocytic Gq GPCRs upptäcker quantal vesikulär frisättning av signalsubstansen, genom att inkludera bafilomycin A1 i inkubationstiden protokollet.
ntent "> Hittills skalnings protokollen har endast använts i hippocampus skivor från unga möss (p12-p18). Därför är det för närvarande okänt om astrocytic receptor skalning också skulle kunna induceras i vävnad erhålls från vuxna möss. En övertygande ny studie tyder på att grupp I mGluR uttryck i astrocyter minskar betydligt efter den första veckan i ålder och fortsätter att minska förrän i vuxen ålder, med mycket låga nivåer av receptoruttryck i vuxna astrocyter 40. Det skulle därför vara intressant att avgöra om astrocytiska mGluRs skala upp efter lång- sikt hämning av neuron i vuxna mus hippocampus skivor till nivåer som närmar sig de som ses i astrocyter från unga möss. Detta fynd tyder på att astrocytic receptoruttryck är inte statiskt vid en viss ålder, men kan ändras snabbt beroende på nivåer av nervaktivitet. I motsats till minskat uttryck av grupp I mGluRs i vuxna möss, är bevis fram som adrenerga receptorer, bland & #945; 1A, α 2A, och β 1-subtyper, är till övervägande del uttrycktes av astrocyter i den vuxna hjärnan 3, 4. Den α 1A adrenerga Gq GPCR kan vara ett attraktivt mål för framtida studier av neuron-till-astrocyternas kommunikation, även om dessa receptorer är känsliga för förändringar i adrenerga neuron bränning priser.Disclosures
Författarna vill avslöja att tetrodotoxin som används i dessa studier köptes från Abcam. Abcam hade någon inblandning i de hypoteser, design, eller insamling av data. All korrespondens beträffande sponsring av arbetet med Abcam inträffat efter peer review-processen var klar.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för UC Riverside Centrum för Gliaceller-neuronala interaktioner för värdefull diskussion om skal protokoll och data. Författarna vill också ge ett stort tack till Abcam för sponsring publiceringen av deras arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber Supplies | |||
| Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
| Electrical drill | |||
| Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
| Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
| Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
| Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
| One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
| Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
| 600 µm Sefar Nitex Nylon mesh | ELKO Filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
| Krazy Glue | For slice holder | ||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| KCl | Fisher | P333-500 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
| Glucose | Fisher | Fisher | |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
| Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
| Tetrodotoxin citrate (TTX) | Abcam | ab120055 | |
| Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Abcam | ab120020 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
| Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Dissection Tools | |||
| Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
| Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
| Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
| Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
| Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
| Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
| Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
| Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
| Polystyrene 100 mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
| Vibratome | Leica | VT 1200S | |
| Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
| Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
| Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
| Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |
References
- Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices. J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).
- Navarrete, M., Araque, A. Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication. Neuron. 57, 883-893 (2008).
- Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo. Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).
- Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2. Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).
- Porter, J. T., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals. J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).
- Bernardinelli, Y., et al. Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus. J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Wang, X., et al. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. Sorting out astrocyte physiology from pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).
- Agulhon, C., et al. Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes. Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).
- Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
- Nizar, K., et al. In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase. J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).
- Sutton, M. A., et al. Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis. Cell. 125, 785-799 (2006).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57, 819-826 (2008).
- Xie, A. X., et al. Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).
- Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity. J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).
- Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).
- Prezeau, L., et al. Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).
- Shao, Y., McCarthy, K. D. Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells. Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).
- Wang, S. S., Thompson, S. H. Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics. Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).
- Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization. Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).
- Shelton, M. K., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ. J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).
- Hermans, E., Challiss, R. A. Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors. Biochem. J. 359, 465-484 (2001).
- Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ. Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).
- de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).
- Kang, J., et al. Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Fiacco, T. A., et al. Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity. Neuron. 54, 611-626 (2007).
- Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence. PLoS One. 2, (2007).
- Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ. J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).
- Takata, N., Hirase, H. Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo. PLoS ONE. 3, e2525 (2008).
- Salahpour, A., et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).
- Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).
- Sun, W., et al. Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult. Science. 339, 197-200 (2013).
