Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Published: March 20, 2014 doi: 10.3791/51458
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3
1Graduate Program in Neuroscience, University of California Riverside, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California Riverside, 3Center for Glial-Neuronal Interactions, University of California Riverside

Summary

Her beskriver vi en tilpasning av protokoller som brukes til å indusere homeostatic plastisitet i nevroner for studiet av plastisitet av astrocytic G protein-koblede reseptorer. Nylig brukt til å undersøke endringer i astrocytic gruppe I mGluRs i juvenile mus, kan metoden brukes til å måle skalering av ulike astrocytic GPCRs, i vev fra voksne mus i situ og in vivo, og for å få en bedre forståelse av sensitiviteten astrocytic reseptorer endringer i neuronal aktivitet.

Abstract

Nær to tiår med forskning har slått fast at astrocytter i situ og in vivo uttrykke mange G protein-koblede reseptorer (GPCR) som kan bli stimulert av neuronally utgitt senderen. Imidlertid har evnen til astrocytic reseptorer for å oppvise plastisitet som reaksjon på endringer i neuronal aktivitet fått liten oppmerksomhet. Her beskriver vi et modellsystem som kan brukes til å globalt forminske astrocytic gruppe I metabotropiske glutamatreseptorer (mGluRs) i akutte hjerneskiver. Inkludert er metoder for hvordan å forberede parasagittal hippocampus skiver, konstruere kamre egnet for langsiktig skive inkubasjon, toveis manipulere neuronal aksjonspotensial frekvens, last astrocytter og astrocyte prosesser med fluorescerende Ca 2 +-indikatoren, og måle endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet ved opptak spontan og fremkalt astrocyte Ca 2 + hendelser ved hjelp konfokalmikroskopi. I hovedsak en "kalsium roadmap "er gitt for hvordan å måle plastisitet astrocytic GQ GPCR. Anvendelser av den teknikk for undersøkelse av astrocytter er omtalt. Å ha en forståelse av hvordan astrocytic reseptor signalisering er påvirket av endringer i neuronal aktivitet har viktige implikasjoner for både normal synaptisk funksjon samt prosesser underliggende nevrologiske lidelser og nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

Astrocytter svare innen sekunder til stimulering av nerveceller eller nerve axons med økninger i cytoplasma Ca 2 + som følge nesten utelukkende fra aktivering av astrocytic GQ GPCR. For eksempel, muskarine acetylkolinreseptorer 1, cannabinoidreseptorer 2, α 1A adrenerge reseptorer 3, 4, og gruppen jeg mGluRs (se nedenfor) er alle astrocytic Gq GPCR subtyper som akutt reagerer på neuronal aktivitet. Aktivering av astrocytic gruppe I mGluRs er vist i utstrakt grad, etter stimulering av neuronal glutamatergic afferenter in situ (for eksempel akutt hippokampale skiver) 5-7, så vel som i voksne mus cortex in vivo etter sansestimulerings 8.. Utfallet av aktivering av astrocytic Gq GPCR signaliserer på biologi og fysiologi av astrocytter, nevroner, eller astrocyte-neuron interaksjoner har vært en del debatt 9-12. Det vil være some tid før funksjonen av nevron-til-astrocyte reseptor signalisering er fullt verdsatt.

Mens det er klart at nerveceller kan aktivere astrocytic reseptorer ved hjelp av eksperimentelle protokoller, det er sider ved nevron-til-astrocyte reseptor kommunikasjon som fortsatt dårlig forstått. Først den faktiske mengden av neuronal aktivitet er nødvendig for å aktivere astrocytic Gq GPCRs er ikke godt definert, og andre, har evnen til astrocytic reseptorer å vise bruk avhengig plastisitet fått liten oppmerksomhet. For å begynne å ta opp disse spørsmålene, vi har nylig utviklet en protokoll for å indusere toveis skalering av astrocytic gruppe I mGluRs i akutte juvenile hippocampus skiver i respons til langsiktige endringer i nevronale aksjonspotensial (AP)-avhengige synaptiske aktivitet. I likhet med hva som har blitt oppdaget for toveis homeostatic plastisitet nevrale ionotrofiske glutamat reseptorer 13, 14, astrocytic gruppe jeg mGluRs skalerer opp following blokade av nerveaksjonspotensialer og skalere ned når nevronale aksjonspotensial frekvensen økes 15. Disse kompenserende endring i astrocytic reseptorer kan måles ved å ta opp spontant og fremkalt astrocyte Ca 2 +-transienter, og å sammenligne egenskapene til disse hendelsene til de fra astrocytter i kontrollforhold. I dette manuskriptet, beskriver vi komplett metodikk for bruk av denne protokollen, herunder utarbeidelse av akutte hippocampus skiver, inkuberingsforhold å indusere astrocyte reseptor skalering, astrocyte Ca 2 + indikator fargestoff lasting, Ca 2 + bildeteknikker som bruker konfokalmikroskopi, og forventede effekter på astrocyte Gq GPCR aktivitet. Forutsigbare virkninger på astrocyte Ca 2 + signal egenskaper - som tilsvarer de tidligere registrert i dyrkede celler transfektert med ulike uttrykk nivåer av GQ GPCRs - gi et "veikart" som kan brukes i fremtidige studier til analysen for endringer i såtrocytic GPCR uttrykk. Konsekvenser og mulige bruksområder for bruk av denne teknikken vil bidra til vår forståelse av astrocyte-nevronale interaksjoner i den friske og syke hjerne.

Protocol

Prosedyrene som følger har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California, Riverside.

En. Bygging av Inkubasjon Chamber og Slice Holder

  1. Konstruere inkubasjonstiden kammeret: Konstruer inkubasjonstiden kammeret fra materiale som er giftig. Kontroller at kammeret er styrt luftsirkulasjon, har en tilstrekkelig mengde av ACSF for et stykke holderen til å flyte, og er stor nok, slik at skive-holderen kan flyte i den ene ende av kammeret, mens gassen dispersjonen fra oksygen linjer skjer på andre ende. Skuffen parti av en pipette lagringsbeholderen med sin lufttett lokk (figur 1A) tilpasser disse kriteriene pent.
    1. Bores et lite hull på siden av beholderen omtrent 1 grader inn fra toppen, og grader inn fra siden. Monter et stykke fleksibelt rør gjennom hullet (figur 1B). Vær nøye med boringen lav nok slik at slangen ikke vil bli komprimert når lokket er lukket, men er høy nok slik at den befinner seg over oppløsningen.
    2. Påfør silikon søm tetningsmiddel ("akvarium søm sealer") for å skape en tetning vanntett mellom oksygenledningen, og kammeret.
    3. Kople til "utenfor" ende av slangen til en gasstank (95% oksygen og 5% karbondioksyd) ved hjelp av en hann Luer montering. Til å passe på, cut-to-fit en naturlig skrå 200 mL pipette spissen (figur 1C).
    4. Koble "innsiden" enden av slangen til en en-til-seks linje plast manifold. Cut-til-fit seks 20 mL Eppendorf microloader pipetter til hver manifold innløpet (figur 1D). Den fine åpningen av microloaders er ideelle for fremstilling av en jevn strøm av små bobler.
    5. For å gi rom for ventilasjon, bore to små hull på lokket av beholderen (figur 1E).
  2. Konstruere stykket heldre: Stykket Holderen er laget av en flytende Bubble Rack (figur 1F).
    1. Fjern de nederste "ben" av boblen rack, og kuttet toppen til ca 1 ¾ i.
    2. Lim et stykke nylonnettmateriale til bunnen av det runde stativet ved hjelp av cyanoakrylat-lim (for eksempel standard Krazy Glue) for å skape en åtte godt stykke holderen (fig. 1G). Hver brønn kan passe en enkelt mus hippocampus skive.
    3. Monter skive holderen i den ene ende av inkubering kammeret og microloader-manifold apparat i den andre enden. La de microloader tips til å hvile på kammeret gulvet (figur 1H). Dette oppsettet er utformet for å sikre en tilstrekkelig oksygentilførsel til både toppen og bunnen av den akutte hippokampale skiver, og for å unngå bobler som kommer ut direkte under stykkeholderen for å minimalisere skive omrøring og hindre direkte kontakt mellom boblene med hippocampus skiver.
    4. Skyll inkubasjonstiden kamre end skive holdere grundig med DDH 2 O etter hvert forsøk, og rense med 70% EtOH ukentlig. Ved inkubering av skiver i ulike løsninger, vil flere kamre / stykkeholdere være nødvendig.

2. Løsninger og narkotika

  1. Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF): Forbered 4 L av standard ACSF i DDH 2 O ved hjelp av følgende (i mm): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO 3, 15 glukose, og 0,1 Trolox. Måle osmolariteten av løsningen ved hjelp av et osmometer, den skal komme til ~ 310 mOsm. ACSF sammensetninger for eksperimentelle betingelser er beskrevet nedenfor (se protokoll 3). Filtrere alle løsninger ved hjelp av en 0,22 mikrometer flaske-top filteret inn autoklaveres glassflasker. Solutions er stabil i 4 ° C i opptil en måned.
  2. Kutting Buffer: Forbered skiver ved hjelp av en modifisert ACSF inneholder (i mm): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3,8 MgCll 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glukose, og 1,3 askorbinsyre. Måle osmolariteten av løsningen ved hjelp av et osmometer, den skal komme til ~ 310 mOsm. Utskifting av CaCl 2 med MgCl 2 i slicing buffer bedrer skive helse.
  3. Sulforhodamine 101 (SR-101, 1 mM) blir brukt til å identifisere astrocytter i akutte hippocampus skiver. Gjør en 1 mM lager av SR-101 ved å fortynne 60,67 mg SR-101 i 100 ml av en modifisert lavt kalsium ACSF fremstilt som følger (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26,0 NaHCO3, 15 glukose, og 1,3 askorbinsyre. Kontroller at osmolariteten for lavt kalsium ACSF er ~ 310 mOsm. Fortynne 1 mm SR-101 lager 1000 ganger i modifisert low Ca 2 + ACSF for lasting. Oppbevar den endelige SR-101 løsningen i 4 ° C og beskyttet mot lys inntil nødvendig for forsøket.

Tre. Manipulering av Long Term nevronal utløsning priser i Akutt Hippocampus Slices

Bruk én av to inkubator protokoller i egne eksperimenter for å manipulere langsiktige nevronale avfyring priser:

  1. Hemme nevronal utløsning: Inkuber i tetrodotoxin (TTX, 1 mikrometer): FORSIKTIG: Håndter TTX med forsiktighet da det kan være dødelig ved svelging i tilstrekkelige mengder. Hansker og vernebriller anbefales. TTX helt opphever AP-drevet nevronal utløsning i akutte skiver. Inkuber skiver i 3,5 mM K + ACSF, pluss en mikrometer TTX i den eksperimentelle tilstand. I kontrollgruppen tilstand, ruge skiver i 3,5 mM K + ACSF uten TTX. Sammenligningen mellom de to forholdene avslører oppskalering effekt i astrocytic Gq GPCR aktivitet. 3,5 mM K + ACSF tjener som styre tilstand (i motsetning til si, 2,5 mM K +) for å maksimere effekten av TTX behandling.

- ELLER -

  1. Øk nevronal utløsning ovenforbasal: Inkuber i høy kalium: Økende ekstracellulære K + konsentrasjon depolarizes nevroner og øker deres basal skuddtakt. Inkubasjon i 5,0 mM K + ACSF betydelig løfter nevronale aksjonspotensial frekvens i forhold til 2,5 mM K + ACSF 15. Inkuber skivene i 5,0 mM K + ACSF for den eksperimentelle tilstand, og for kontroll tilstand, inkuber i skiver på 2,5 mM K + ACSF. Sammenligningen mellom de to forholdene avslører nedskalering effekt i astrocytic Gq GPCR aktivitet.

4. Akutt Hippocampus Slice Forberedelse

  1. Sette opp den varme utvinning kammer:
    1. Varm vannbad til 35 ° C, deretter plassere de preparerte ruge kamre inne. Fyll vannbad med vann opp til høyden av ACSF innenfor inkubering kamre (fig. 1G).
    2. Oxygenate eksperimentelle og kontroll ACSF med 95% O2, 5% CO 2. Boblene slippes ut fra microloader-manifold apparat bør være liten og rikelig, men også mild, og det bør ikke være noen synlig bevegelse av ACSF i kammeret.
  2. Sette opp det iskalde disseksjon kammer:
    1. Ta to bøtter med is. Plasser en flaske med ca 300 ml slicing buffer i en bøtte med is og holde det oksygenrikt med 95% O 2, 5% CO 2 i 20 min. Senk en 100 mm petriskål inn i det andre is bøtte, like under overflaten av isen. Sikre siden av petriskål er i direkte kontakt med isen. Hell litt slicing buffer inn i petriskål og holde det oksygenrikt også.
    2. Chill i forkant av den single-edge barberblad ved å senke den i det iskalde slicing buffer i petriskål for mer enn 1 min.
  3. Vibratome oppsett:
    1. Slå på vibratome og sørge for drenering er stengt.
    2. Sikre klippekammeret i vibreringstome og pakkis rundt skjærekammeret. Precool det til 0-4 ° C.
    3. Fjern fabrikken fett fra den doble kanten barberblad ved å dyppe den i 70% EtOH for 5 min og deretter skylle med ddH2O. Skjær den i halvdeler nøye (ikke bøye bladet) og montere den ene halvdelen kniven på skjæreblokken.
  4. Fjerne musen hjernen:
    1. Anesthetize en 12-18 dager gamle C57BL/6J mus i et lite kammer forhåndslastet med 0,5 ml isofluran flommet inn en Kimwipe eller bomullsdott. Klyp dyrets tær for å sørge for at det er ingen smerte refleks.
    2. Halshogge musen med en skarp saks, deretter fjerne hodebunnen ved hjelp av små tang. Bruk små bein saks for å klippe skallen fra lillehjernen til olfactory pærer langs den langsgående sprekken. Fjern kranie flaps ved hjelp av små tang. Fjern forsiktig hjernen med en slikkepott, og senk den ned i iskald oksygenrikt slicing buffer i petriskål.
    3. Bisect musen hjernen med kjølt barberblad i petriskål for å tillate mer areal for kjøling og oksygenering. La de bisected halvkuler sitte i iskald slicing buffer i 2-3 min. Hjernen skal bli helt avkjølt og mer solid.
  5. Påfør et tynt lag med cyanoakrylat lim på plattformen av vibratome. Lim begge halvkuler til plattformen cut side-ned og laterale sidene opp, med luktelappen vendt fremover. Sikre plattformen i kappekammeret, og deretter fylle skjærekammeret med iskald, godt oksygenert kutting buffer.
  6. Fortsett oksygenskjærekammeret mens forbereder 300 mikrometer tykke parasagittal skiver ved hjelp av vibratome. Skjær skiver med en frekvens på 85 Hz, en fremdriftshastighet på 0,20 mm / sek, og en amplitude på 1,40 mm. MERK: Vi har funnet ut at den viktigste variabelen i å forberede sunne akutte hippocampus skiver er kvaliteten på vibratome. Vårt laboratorium benytter Leica VT 1200 S magnetic kjøre vibratome med vibrocheck å redusere "z" vibrasjon.
  7. Etter å ha klippet, dissekere hippocampus og tilstøtende entorhinal cortex ut av hver parasagittal stykke ved hjelp av skarpe tang. Utfør denne prosedyren i det iskalde, godt oksygenert slicing buffer i skjære kammer av vibratome. Skarpheten av tang er svært viktig for skive helse som det minimerer håndtering av sektorene.
  8. Foreta en overføring pipette ved å bryte ut den lange spissen av et glass Pasteur pipette og topping den ødelagte delen med en pipette pære. Dette muliggjør bruk av den store enden av pipetten for å overføre skiver. Sørg for å bestille pipetter uten bomull plugg i den store enden (se Materialer tabell). Som skivene fremstilles i ikke-sterile betingelser, er det ikke nødvendig å autoklavere pipetten før bruk, selv om en ny pipette skal fremstilles og brukes for hvert forsøk.
  9. Overfør hver hippocampus skive til inkubasjonstiden kamre i 35 ° C vannbadekaret, ved å dyppe overføringspipetten inn i ACSF inne i hver brønn av stykket holderen og aspire stykket. Minimer bevegelse av stykket i løpet av denne prosessen. Direkte overføring av skivene til de varme inkubasjon bade resulterer i bedre kvalitet skiver enn "ramping" temperaturen opp gradvis.
  10. La de hippocampus skiver å gjenopprette i varmt vannbad for totalt 45 minutter, fordelt slik: Inkuber skiver for 20 min i en mikrometer SR-101 fortynnet i lavt kalsium ACSF og deretter overføre dem til den lave kalsium ACSF (uten SR-101) i 10 min. Deretter overføre skivene for å kontrollere eller eksperimentell ACSF for de resterende 15 min av den varme inkubasjon.
  11. Etter 45 min varme gjenvinning, omhyggelig bevege inkubering kamre fra 35 ° C vannbad for å benketoppen, og så at skivene kan fortsette å inkubere ved romtemperatur i en total inkubasjonstid på 3 timer før begynnelsen av bolus-last protokollen (se nedenfor).
    12. 5. Bolus Lasting av Astrocytes med Ca 2 + Indikator

    1. Forbereder Ca 2 + indikator bolus-lasting fargestoff:
      1. For hvert hetteglass med fargestoff (50 mikrogram), tilsett 3,87 mL av fersk dimethylsulfoxyd (DMSO) og virvle grundig. Helsen av DMSO er viktig for god lasting og derfor, crack åpne en ny ampulle hver gang.
      2. Bland i 9 mL av 20% pluronic syre og virvle grundig. Bland fargestoffet med 100 pl av den hensiktsmessige eksperimentell eller kontroll ACSF og vortex også, for en endelig fargestoff konsentrasjon på 10 uM.
      3. Filtrer løsningen ved hjelp av en sentrifuge filter tube. Dette trinnet hindrer lasting pipette fra clogging under utskyting av fargestoffet.
      4. Forbered en pipette fra en borsilikatglass kapillær trukket til en motstand på ca 1,3 MΩ når de er fylt med fargeløsning.
    2. Plasser en hippocampus skive i et opptak kammer beregnet for bruk med mikroskopetog kontinuerlig perfuse med oksygenert ACSF av samme sammensetning som det ble inkubert i (1.5 ml / min). Veksle mellom kontroll og eksperimentelle forhold når de skal velge en hippocampus skive.
    3. Kast usunn leter hippocampus skiver. Kvaliteten av skiver vil variere selv innenfor et gitt forsøk. Det er ingen faste kriterier for å kvantifisere skive helse, og derfor er subjektiv og basert hovedsakelig på erfaring fastsettelse av skive helse.
      1. Generelt sett, holde skiver som har en glatt vises overflate og en høy andel av sunne CA1 pyramidale celler (Figur 2A). CA1 pyramidale celler er spesielt følsomme og sårbare for CNS fornærmelser, så har en stor andel (≥ 75%) av sunne CA1 pyramidale nevroner kan være et nyttig kriterier for å akseptere eller avvise en skive.
      2. Kast skiver som har ca> 25% døde nevroner. Døde neuroner har et stekt egg-lignende utseende (figur 2B). MERK: We Håhar observert at vinkelen på kutte spiller en viktig rolle i hvorvidt neuroner vises sunn eller ikke. Hvis neuronal dendritter som rager oppover (ut av skive), så neuronene vil være mest døde. Dette er antagelig fordi en så stor andel av volumet neuron er inneholdt i den dendrittiske treet, at kutte dendrittene er dødelig for cellene. På den annen side, hvis de dendritter som rager parallelt med eller i en vinkel nedover fra det skive overflaten, vil det være en høy andel av friske nerveceller. Noen ganger vil derfor neuroner være mest døde på den ene side av stykket, og sunt utseende på den andre siden.
    4. Finn en passende felt av sr astrocytter 40-70 mikrometer under skive overflaten basert på størrelse, morfologi, og plassering ved hjelp av kontrast differensial forstyrrelser (DIC) optikk.
    5. Laste glasset pipette med fargestoff-oppløsning og senke den til overflaten av skiven over dette felt ved hjelp av en standard patch-clamp microelectrode holr. Med pipetten ved overflaten av skiven, anvende mottrykk til pipetten for å begynne å mate fargestoff. Utstøting av fargestoff vil være synlig under begge DIC optikk og en passende laser for eksempel en 488 linje for et grønt fargestoff.
    6. Sakte senke pipetten til ca 40 mikrometer under skive overflaten ved hjelp av en mikromanipulator og tillate fargestoff å løse ut for ca 45-60 sek. Deretter senke pipetten ytterligere 35 mikrometer (75 mikrometer under skive overflaten) og mater ut fargestoff for ca 45-60 sek. Sakte trekke pipettespissen fra stykket. Kortere innsprøytningstid som sannsynligvis vil resultere i utilstrekkelig fargestoff lasting, mens lengre injeksjon tendens til å øke bakgrunns lasting, noe som reduserer signal-til-støy-forholdet av opptaket.
    7. For å sikre at et stort antall astrocytter ta opp fargestoff, er det vanligvis nyttig å injisere et andre fargestoff bolus kort avstand. Løft pipetten tilbake til overflaten av stykket, sørg for at pipetten ikke er tett, så move pipetten ca 80-100 mikrometer unna den første injeksjonsstedet, langs stratum radiatum. Gjenta bolusinjeksjon på dette nettstedet.
    8. Tillat 30-45 min før avbildning for astrocytter til å ta opp fargestoff og for bakgrunnssignalet til å avta. La skive i perfusjon kammeret i løpet av denne tiden. Kontroller at denne inkubasjonstiden er innebygget i alt 4 timers behandling av forsøket. Skaff neste skive og gjenta trinn 05.02 til 05.08.

    6. Opptak Spontan og Gq GPCR Agonist-fremkalt astrocytic Ca 2 + aktivitet i Hippocampus Slices

    1. Sette opp konfokalmikroskop for bildebehandling:
      1. Begrense skive eksponering for laserlys er av største betydning, som høy eksponering kan føre til fargestoff bleking og / eller fototoksisitet. Bruk av høyere optisk forstørrelse eller en økt innstilling zoom øker lyseksponering til det avbildede området. Derfor setter standardverdiene for hver laser til en høy fotomultiplikator setting, 1x gevinst og 0,5% laser utgangseffekt.
      2. Påfør en 1,5 x zoom for bedre visualisering av astrocyte prosesser.
      3. Sett feltet oppløsningen til 512 x 512 piksler.
      4. Sette skannehastigheten til den raskest mulig, noe som er ~ 1,2 sek per skanning ved hjelp av den ene måten skannemodus.
      5. Samle emisjonsspektra ved hjelp av båndpassfiltre i 503 til 548 nm for de 488 nm laser, og 624 til 724 nm for de 559 nm laser. Disse innstillingene lar avbildning av et felt av ~ 5-8 astrocytter på en relativt rask hastighet med en oppløsning nok til å observere astrocyte celle organer og hovedprosesser. Ideelt sett vil astrocytter i feltet være sterkt nok til å bli sett klart, men uten noen pixel metning.
      6. Bekrefte identiteten av celler ladet med Ca 2 + fargestoff som astrocytter ved å visualisere den SR-101 colabeling ved hjelp av 559 nm laser.
    2. Opptak astrocyte Ca 2 + aktivitet:
      1. Tegn bokser bruke bildet oppkjøpet programvare over regioner av interesse (ROEr) i cellen, i dette tilfelle i løpet astrocyte celle organer. Kassene må ikke inneholde bakgrunnsbildepunkter, for å oppnå det beste signal-til-støy-forhold er mulig. Tegn en boks over bakgrunnen som referanse.
      2. Slå perfusjon til eksperimentell ACSF pluss 1 mikroM TTX (Abcam) gjennom resten av forsøket. Dette eliminerer eventuelle nevronale AP-drevet astrocyte kalsium svar. Resterende økninger i astrocytic Ca 2 +-konsentrasjon vil da være på grunn av quantal vesikulært frigjøring, konstitutivt (basal) GPCR-aktivitet, eller en kombinasjon av begge mekanismer.
    3. Record fluorescens over tid fra alle Rois. Enhver økning i fluorescens enn grunnlinjen indikerer en økning i cytoplasmisk Ca2 +-konsentrasjon 16, og derfor GPCR aktivitet i astrocytter 10, 17, 18. For å unngå eventuelle tidlig skaleringseffekter på astrocytic reseptorer av TTX, komplett eksperimenter innenfor 40 min frOM den tiden da en mikrometer TTX perfusjon begynte.
      1. Etter innhenting 10 min av baseline opptak av spontan Ca 2 + aktivitet, gjelder en agonist av interesse (for eksempel DHPG) ved sekvensielt økende konsentrasjoner. Legg igjen en minimum 5 min mellom programmer for å redusere mulig reseptor desensitivisering.
      2. På slutten av innspillingen, bruke en cocktail av agonister for andre astrocytic GQ GPCRs som en positiv kontroll for intakt astrocytic Gq GPCR signalveier. Komponenter av agonist cocktail vil avhenge av reseptoren av interesse. 10 pM av hver av Gq GPCR agonister histamin, karbakol, og 2Na-ATP til å stimulere histamin H1-reseptorer [H1R], muskarine acetylcholin-reseptorer [mAchR] og purinergiske reseptorer [P2YR], henholdsvis, er en vanlig brukt agonist cocktail.
    4. Post-eksperiment image oppkjøpet:
      1. Ved ferdigstillelse av Ca 2 +-opptak, ta stillbilder med 488 nm og 559 nm lasere, feller senere bekreftelse på astrocyte identitet og ROI plassering. Laser kraft-og HV-innstillingene kan endres fritt på dette punktet for å få et optimalt bilde for colocalization, så det er ikke lenger en bekymring om laserlys intensitet påvirker dataene (Figur 2A).
    5. Gjenta trinn 06.01 til 06.03 for totalt ca 8 skiver og 40 astrocytter / gruppe. Skiver bør komme fra et minimum på tre forskjellige mus.

    7. Analyse av astrocyte Ca 2 + Aktivitet

    1. Definere en Ca 2 + høyde: Standardisering i å definere Ca 2 + transienter har ikke blitt godt etablert i det vitenskapelige samfunn. Det som følger er en typisk protokoll som maksimerer følsomhet samtidig som den begrenser deteksjon av falske positive hendelser ut av baseline støy.
      1. Har en annen lab medlem tildele hver skive en tallkode for å analysere dem blindt. Ved avslutningen av analysen, dekode hver skive.
      2. Analyser spontan og fremkalt astrocyte Ca 2 + forhøyninger offline ved bildeanalyse programvare. Tegne og / eller justere størrelsen, formen og plasseringen av de Rois som ønsket.
      3. Score økning i fluorescensintensiteten enn grunnlinjen som en Ca 2 + heving hvis topp amplitude er større enn to standardavvik (SD) ovenfor gjennomsnittet av 30 sek av gjennomsnittlig grunnlinje fluorescens i minst to påfølgende samplingspunkter. I særlig støyende opptak (lav signal-til-støy), kan denne kriterier må bli justert til 3 SD over den midlere utgangs fluorescens. Definer angrep av hver Ca 2 + høyde som den siste datapunktet før fluorescens-intensiteten overskrider ett standardavvik over gjennomsnittet.
      4. Skille mellom multipeak vs påfølgende single-peak hendelser. Score et arrangement som "multipeak" når fluorescens intensiteten ikke går tilbake til baseline (under gjennomsnittet grunnverdi 2 SD) for &# 8804; ni sammenhengende datapunkter (10,8 sek) mellom toppene. Dermed vil enkelt peak hendelsene har 10 eller flere påfølgende baseline datapunkter i mellom dem.
      5. Klassifisere hendelser som "platå"-type reaksjoner når fluorescens intensiteten opprettholder peak amplitude (± 10% av toppverdien) for minst 3,6 sek.
    2. Analyser amplitude, frekvens og kinetikk av spontane og agonist-fremkalt kalsium transienter.
      1. Definer maksimal amplitude av Ca 2 +-høyde som datapunkt med den høyeste intensitetsverdi (i tilfeller av "multipeak" svar bruke den første toppen, se figur 2B).
      2. Beregn økning tid som differansen mellom responsen utbruddet og den tid som svarer til den høyeste amplitude. MERK: 0 til 100% økning tid kan trenge å bli brukt for å få et tilstrekkelig antall datapunkter for å oppnå en tidsverdi, skann-hastighet er en viktig variabel her.
      3. Beregn ventetid som tidenmellom initiering av agonist perfusjon av respons utbruddet. Rise tid kan være en mer nyttig mål i hjernen skiver, så lenge vaske-in tider skape en forvirre ved beregning av responsventetider.
    3. Bestem om det er statistisk signifikante forskjeller mellom de to grupper for hver parameter under anvendelse av Students t-test uavhengige. Bruk antall astrocytter som 'n'. Bruk Pearsons chi-kvadrat-test for å sammenligne Ca 2 + aktivitetsmønstre mellom kontroll-og behandlingsgrupper. Bruk Fishers eksakte 2-hale test for å sammenligne prosenter av spesifikke Ca 2 + aktivitetsmønstre mellom kontroll-og behandlingsgrupper. Uttrykke forskjeller som * p <0,05, ** p <0,01, og *** p <0,001.

Representative Results

Representative resultater i Figur 3 viser effekten av inkubering av akutte muse hippokampale skiver i TTX i 4-6 timer på sr astrocyte Ca 2 +-aktivitet. Data omfatter både spontane Ca 2 + transienter og DHPG-fremkalt gruppe jeg mGluR Ca 2 + svar, fra skiver ruges i kontroll ACSF vs ACSF pluss TTX. Annet enn grunnleggende karakteristiske morfologiske funksjoner, stelprosessmontasje og små soma størrelse (~ 10 mikrometer), er astrocytter identifisert i sr av overlapping av Ca 2 + indikator OGB-1 AM med selektiv astrocyte markør SR-101 19, 20 ( Figur 3A). De nummererte bokser enn astrocyte celle organer tilsvarer de nummererte fluorescens over tid-spor som vist i figur 3B. Gruppen en mGluR agonist (RS)-3.5-DHPG brukes til å bestemme de spesifikke skaleringseffekter på konsern en mGluRs i astrocytter. Å diskriminere mellom Physiology i spesifisiteten av skaleringseffekten til å gruppere en mGluRs versus andre GQ GPCRs, er en cocktail av agonister brukt på slutten av hvert forsøk. Her har vi brukt 10 mikrometer hver av GQ GPCR agonister histamin, carbamylcholine klorid (carbachol) og adenosin 5'-ATP disodium (Na-ATP). Den agonist cocktail fungerer også som en positiv kontroll for å identifisere levedyktige og responsive astrocytter i tilfeller der cellene ikke reagerer på DHPG, antagelig fordi de bestemt astrocytter ikke uttrykke tilstrekkelige mengder av reseptoren for å lokke fram en reaksjon på DHPG.

Vi har brukt forskjellige konsentrasjoner av DHPG, deriblant 5 uM og 15 uM (figur 3B) samt 30 uM og 50 uM (figur 4A) for å bistå i å avdekke endringer i astrocytic gruppe I mGluRs. Forholdet mellom cellulære Ca 2 + svar og Gq GPCR uttrykk nivåer har blitt undersøkt tidligere in vitro 21-24. Først,terskelen til å reagere på et bestemt agonist konsentrasjonen er avhengig av tettheten av reseptorer uttrykt av hver celle. I en populasjon av celler, flere celler reagere med en Ca2 +-økning til en gitt konsentrasjon av agonist når cellene blir transfektert med høyere densitet av reseptorer. Etter inkubering av skivene i TTX, andelen av astrocytter i populasjon reagerer på en fast konsentrasjon av agonist øker (Figurene 3B og 3C). Vi har funnet at 5 uM og 15 uM DHPG viser klare forskjeller i prosentandelen av responsive astrocytter mellom kontroll og TTX behandlede celler, mens 30 og 50 uM DHPG er nødvendig for å sammenligne gruppe I mGluR responser på 5,0 mM K + behandlede vs kontroll celler (figur 4A).

Forholdet mellom astrocytic Ca 2 + responsmønstre og agonist konsentrasjonen er også blitt undersøkt in situ. Økning av agonistkonsentrasjon skifter mønster av Ca 2 + respons i astrocytter fra enkel topp Ca 2 + forhøyninger å multipeak og platå Ca 2 + forhøyninger 25-27. Basert på disse tidligere funnene, forutsa vi at reaksjonsmønsteret til en enkelt konsentrasjon av agonist vil skifte om det er endringer i nivået av reseptorekspresjon. Således, avhengig av hvilken av de to skalerings metoder blir utnyttet (inhibering av neuronal avfyring eller ved å øke den), vil konsentrasjonen av agonist nødvendig for å gi en bestemt responsmønster øke eller minske. For eksempel astrocytter ruges i TTX skifte sin DHPG-fremkalt Ca 2 + reaksjonsmønster til mer platå-type Ca 2 + forhøyninger og respondere på lavere agonist konsentrasjoner sammenlignet med kontroll astrocytter (Figur 3C). Tatt i betraktning de tidligere studier, disse observasjonene tyder på at gruppen jeg mGluR reseptor uttrykk nivåer i astrocytter har økt.

Rise tid og utbruddet (latency) av Ca 2 + forhøyninger har også vist seg å direkte relateres til endringer i GQ GPCR uttrykk nivåer i dyrkede celler 22-24. Høyere reseptor uttrykk nivåer føre til kortere responstid ventetider og raskere stige ganger mens reduksjonen i reseptortetthet produserer motsatt effekt. For astrocytter ruges i TTX, Ca 2 + transienter fremkalt ved anvendelse av DHPG har vesentlig raskere stige ganger i forhold til astrocytter ruges i kontroll ACSF (Figur 3D). Som tidligere nevnt, amplituder av agonist-fremkalt Ca 2 +-responser forblir uendret uavhengig av agonist-konsentrasjonen eller skalerings modell 15 (fig. 3D).

I tillegg til de observerte endringene ved direkte aktiverende gruppe mGluRs jeg med DHPG, er spontan astrocyte Ca 2 + aktivitet også betydelig påvirket av dette manipulasjon. Vi observererda 2,26 ganger økning i andelen spontant aktive astrocytter ruges i TTX versus kontroll. Dette er en økning fra bare 12,9% av kontroll astrocytter stiller spontan aktivitet i soma til 42,1% i TTX ruges astrocytter (Figur 3E). Fordi det er kjent at GPCR utstillings "indre" eller konstitutiv aktivitet i fravær av agonist 21, 26, 28, og at nivået av denne iboende aktivitet øker med økende reseptor ekspresjonsnivåer, antyder disse data at tettheten av astrocytic Gq GPCR øker etter langvarig reduksjon i nevronale aksjonspotensial avfyring. I likhet med agonist-fremkalt respons, blir stigningstider for de spontane Ca 2 + forhøyninger også økes (figur 3E).

Representative data ved hjelp av den andre protokoll, inkubering i høy ekstracellulær kalium (5,0 mM), er vist i Figure fire. En økning i ekstracellulære K + 2,5 til 5,0 mM resulterer i en betydelig økning i basal CA3 neuron aksjonspotensial frekvens 15. Høyere konsentrasjoner av DHPG (30 uM og 50 uM) som er nødvendige for å fremkalle gruppe I mGluR Ca 2 +-responser fra astrocytter inkubert i høyt kalium (figurene 4A og 4B). Dette er konsistent med et redusert nivå av gruppen jeg mGluR respons i astrocytter etter en langsiktig økning i nerveaksjonspotensialer. I tillegg er det fremkalt reaksjonsmønsteret til en fast konsentrasjon av DHPG skifter fra platålignende reaksjoner svakere single-peak responser (Figur 4B). Undersøkelse av prosentandelen av spontant aktive astrocytter i de to kaliumforholdene viser at færre astrocytter inkubert i høy K + er spontant aktive sammenlignet med kontrolltilstand (figur 4C). Denne effekten er i motsette retning av TTX tilstand der prosentandelen av astrocytter oppviser spontan Ca 2 + forhøyninger økes. Sist, både fremkalt og spontane Ca 2 + forhøyninger har lavere stigningstider i astrocytter ruges i høy K + versus kontroll tilstand (figur 4C og 4D). Samlet antyder disse dataene at astrocytic Gq GPCR uttrykk nivåer skalere toveis avhengig av nivået på nevronale aksjonspotensial aktivitet over en lengre tidsperiode.

Figur 1
Figur 1. Slice inkubering kammer fabrikasjon og sette opp. (A) Et skuffedelen av en Brinkmann pipette lagringsbeholderen sammen med sin lufttett lokk blir brukt til å konstruere skiven inkubering kammeret. (B) Drill et hull i siden av beholderen omtrent 1 grader i fra toppen og grader inn fra siden. Sett i et stykke fleksibel slange. (C) Kople microloader-manifold apparat til innersiden av det fleksible rør. Merk cut-to-fit naturlig 200 mL pipette (hvit pil). (D) Seks 20 mL Eppendorf microloaders er cut-to-fit til en en-til-seks linje manifold å skape en microloader-manifold apparat. (E) Bor to små hull på lokket. (F) En Floating Bubble Rack for å gjøre stykket holderen. (G) De nedre "ben" av den flytende boble stativet er fjernet, slik at et stykke av nylon mesh materiale kan limes til bunnen. (H) Fyll inkubasjon kammer med tilstrekkelig mengde ACSF slik at skive holder flyter. Juster slangelengde så tips av microloaders kan hvile på et hjørne av kammeret gulvet. Når du plasserer inkubasjonstiden kammeret ivann-bad, bør vann-nivået i badet være på samme nivå som den ACSF i kammeret. for å vise større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Estimering av skive helse. (A) Et sunt utseende hippocampus stykke ved hjelp av differensial interferens kontrast (DIC) optikk. Friske skiver har en glatt, fløyelsaktig utseende og en høy andel av sunne CA1 pyramidale nevroner. Legg merke til de apikale dendritter rager inn i stratum radiatum. Patch-clamp av nevroner som ser ut som de som er vist her avsløre en lav hvilemembranpotensialet (-61 til -62 mV) i standard 2,5 mM K + ACSF med noen spontane aksjonspotensialer. Membranpotensial og fyringsintensitet vil variere som en funksjon av extracellular K + (Xie et al. 15). Pilene peker til antatte astrocytter. Forkortelser: sr, stratum radiatum; s.py., stratum Pyramide. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Usunne skiver vil ha en høy andel av døde CA1 pyramidale nevroner, som har utseendet av stekte egg (hvite piler peker til kjerner av døde nevroner - den "eggeplomme" av stekt egg). Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Opptak forsterket Gq GPCR aktivitet og fremkalt gruppe jeg mGluR Ca 2 + respons etter langvarig hemming av nevronale APs ved inkubasjon i TTX. (A) Representative bilder av celler i opptaket feltet inkuberes i control forhold (øvre paneler) eller i TTX (nedre paneler) som har tatt opp Oregon Grønn BAPTA-en AM Ca 2 + indikatorfargestoff (venstre panel) og SR-101 (midterste paneler). Scale bar er 10 mikrometer. Overlegg av begge signalene ("flette") indikerer at astrocytter last med Ca 2 + indikator. Bokser trekkes over individuelle astrocyte soma å registrere fluorescens intensitet over tid i den grønne kanalen å overvåke Ca 2 + aktivitet i astrocytter. (B) prøve spor fra innspillingen bokser i A) av Ca 2 + aktivitet i astrocytter. Astrocytter ruges i TTX viser økt spontan aktivitet og mer robust fremkalt gruppe jeg mGluR Ca 2 + svar som gjenspeiles av endringer i reaksjonsmønster. Eksempler på enkelt peak (sirkel), multipeak (rektangel), og platå (stiplet rektangel) Ca 2 + transienter vises. (C) endringer i reaksjonsmønstrene er spesielt tydelig ved hjelp av ulike concentrasjoner av gruppen jeg mGluR agonist DHPG. Flere multipeak og platå svar er tydelig etter inkubasjon i TTX forhold til kontroll på et gitt agonist konsentrasjon. (D) Rise tider av DHPG-fremkalt Ca 2 + svar er raskere i astrocytter ruges i TTX sammenlignet med kontroll (øvre panel), mens amplituder ikke endrer (nedre panel), en indikasjon på "alt-eller-ingen" svar amplitudes gang terskelen til å reagere er nådd. (E) Rise tider med spontan astrocyte Ca 2 + transienter er også raskere i TTX inkuberes vs kontroll ruges astrocytter (øvre panel), mens andelen av astrocytter i befolkningen viser spontane Gq GPCR Ca 2 + aktiviteten øker (nedre panel). Klikk her for å se større bilde.

Figur 4 Figur 4. Opptak redusert astrocytic Gq GPCR aktivitet og fremkalt gruppe jeg mGluR Ca 2 + svar følgende langsiktig økning i nervepunkter ved inkubasjon i forhøyet ekstracellulært kalium. (A) Representative spor av astrocyte Ca 2 + opptak fra skiver ruges i 5,0 mM K + ACSF å depolarize nevroner og øke sin basale skuddtakt i forhold til å kontrollere ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocytter inkubert med 5,0 mM K + ACSF utstillings færre spontane somatiske Ca 2 + transienter og svakere DHPG fremkalt respons sammenlignet med astrocytter ruges i kontroll ACSF. (B) En sammenligning av mønstrene av fremkalt respons til flere konsentrasjoner av DHPG avslører svakere svartyper etter lang tids økning i nervepunkter. (C) En reduksjon i andelen av astrocytter i poStyre-oppviser spontan Ca 2 +-aktivitet er observert etter langvarig inkubering i høy K + i forhold til styre ACSF (øvre panel), mens stigningstider på spontan aktivitet blir langsommere (nedre panel). (D) Rise tider av fremkalt astrocyte Ca 2 + svar på ulike konsentrasjoner av DHPG blir tregere etter 5,0 mM K + behandling sammenlignet med astrocytter ruges i kontroll ACSF. Klikk her for å se større bilde.

Discussion

De beskrevne skalering modellene representerer praktiske metoder for å forske langsiktig plastisitet astrocytic gruppe jeg mGluRs. Imaging spontane og fremkalt Ca 2 +-hendelser gir en følsom analyse for å måle endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet, som fast bevis har blitt etablert som astrocyte Ca 2 + høyder oppstå etter løslatelsen fra IP 3 R-sensitive butikker nedstrøms Gq GPCR aktivering 10, 12, 17, 18. Andelen av astrocytter i befolkningen svarer til gruppen jeg mGluR agonist og mønsteret av slike Ca 2 + responser rapportere endringer i gruppe I mGluRs av astrocytter.

Den spesifikke teknikken som brukes til å laste astrocytter med Ca 2 +-indikator er et viktig hensyn i utformingen av eksperimenter for å se etter endringer i astrocytic Gq GPCR aktivitet. Bolus-lasting eller bulk-lasting flere astrocytter, eller patch-klemme lasting av individuelle astrocytter kan brukes til bilde Ca 2 + transienter i astrocytter. Hver tilnærmingen gir visse fordeler og ulemper. Direkte fylling astrocytter med Ca 2 + indikator via patch clamp tillater entydig identifisering av cellen som en astrocyte uten behovet for en sekundær markør slik som SR-101. Patch-clamp levering av indikatoren gjør også opptak av Ca 2 + aktivitet fra små astrocytic avdelinger, inkludert de buskete fin prosesser, potensielt dypere i stykket der cellene er sunnere og med flere intakte interaksjoner med synapser (avhengig av laser strøm tilgjengelig). Imidlertid lider patch-clamp lasting fra lav gjennomstrømning som data blir samlet inn en celle om gangen. Bulk-lasting, derimot, kan et stort antall astrocytter være belastet med Ca 2 +-indikator og avbildes samtidig. Det er imidlertid bare astrocytter i nærheten av overflaten (<20 mikrometer) av skiven er lastet, med tilhørende bekymrings om celle helse og intakte synapser.

Mottrykket bolus-lasting protokoll som presenteres her tilbyr en middelvei, med relativt høy gjennomstrømning og muligheten til å overvåke Ca 2 + aktivitet dypere i stykket (40-75 mikrometer). En betydelig økning i andelen av spontant aktive astrocytter hjelp av bolus-lasting teknikken er observert i forhold til bulk-lasting, noe som tyder på at forbindelsene mellom nerve synapser og astrocytic prosesser er mer komplett 15. Med god lasting, kan man ofte overvåke Ca 2 +-aktivitet i hovedprosesser av astrocytter (data ikke vist) eller potensielt enda mindre rom ved hjelp av to-fotonmikroskopi. Men omsorg ville trenge å bli utøvd med å tildele de mindre prosesser til et bestemt astrocyte, som grensene gli inn i uspesifikke bakgrunnsfarging. En ekstra bekymring med bruk av bulk-lasting eller bolus-lasteprosedyrer er behovet for en sekundær marker for astrocyte identifikasjon. Mens det har vært kjent i mange år at astrocytter fortrinnsvis tar opp AM ester av Ca 2 +-indikatorer, er den sekundære markør SR-101 ofte brukt til å verifisere de lastede celler som astrocytter. SR-101 kan i seg selv endre den iboende oppstemthet av nevroner 29. Bruk av SR-101 bekrefter nødvendigheten av å utføre alle astrocyte Ca 2 +-målinger i TTX for å begrense mulige SR-101 effekter på neuronal eksitabilitet. Forutsatt at både kontroll og eksperimentelle gruppene omfatter SR-101, skal markøren i seg selv ikke gjøre rede for effektene som er observert i astrocyte Ca 2 + signale følgende langsiktige manipulering av nerveaksjonspotensialer. SR-101 kan være mer av et problem i høy K +-eksperimenter, men da det kan redusere forskjellen mellom 2,5 mM K + g. 5,0 mM K + hvis basal skuddtakt ikke endres proporsjonalt.

En svært lovende tilnærming til å levere Ca 2 + 2 +-fargestoffer. Betydelige fremskritt er gjort i løpet av de siste årene med genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) rettet mot astrocytter 30-32. GECIs kan leveres til astrocytter ved in vivo mikroinjeksjon av adeno-assosierte virale vektorer inn i en region av interesse i hjernen slik som hippocampus. Expression of GECIs oppnås etter ca to uker etter virusinfeksjon 32. Det er mange fordeler som presenteres ved bruken av GECIs i astrocytter. Først blir vektorer rettet til astrocytter ved hjelp av en astrocyte spesifikk promotor, slik at de merkede celler er astrocytter 32. For det andre virker signal-til-støy-nå sammenlignbare med hva som kan oppnås med patch-clamp levering av fargestoff, men uten invasivitet av å ha hatt en patch pipette på cellen 32.. Tredje, kan indikatorene være delivered og uttrykt i voksent vev, noe som er problematisk ved hjelp av bulk-lasting leveringsmåte. Videre er uttrykket mosaikk, og tilbyr muligheten til å skille mellom flere astrocytter. Således kan flere astrocytter potensielt avbildes samtidig, samtidig opptak i soma og fine branchlets samtidig. Derfor kan potensielt én enkelt teknikk kan brukes i stedet for tre separate teknikker (bulk-lasting, bolus-lasting, og patch-clamp lasting) for å spille inn skalering aktivitet av astrocytic GQ GPCRs, sterkt økende effektivitet.

En mulig ulempe med å bruke viral-mediert levering av Ca 2 +-indikatorer til astrocytter er det mulig effekt på skive helse 32. De adeno-assosierte virale vektorer som brukes til å levere de GECIs har vist tidligere å forårsake reaktive gliosis av astrocytter 33. Utarbeidelse av hjernen skiver generelt sannsynlig initierer tidlige stadier av patologi inkludert løslatelse av inflammatory molekyler 10. Derfor, kombinert med de lange inkubasjonstidene kreves for å indusere skalering av astrocytic reseptorer, bruk av GECIs levert ved hjelp av virale vektorer ville trenge for å motta tilleggsvederlag i forbindelse med skive helse i disse typer eksperimenter.

Ved ansettelse av denne protokollen, er det viktig å huske på at søknaden tid for agonist for å produsere et svar vil variere som en funksjon av reseptor tilgjengelighet. For en gitt konsentrasjon av agonist, vil påføringstiden må være lengre hvis reseptorer er skalert ned og kortere hvis reseptorer er skalert opp, for at stoffet skal komme frem til en tilfredsstillende konsentrasjon i vevet i tilstrekkelig grad til å aktivere reseptorene til å produsere en Ca 2 + respons. Det kan derfor hende medikament lukketider, og muligens deres konsentrasjoner, må bli justert, avhengig av den tilsiktede retning av skalering. For eksempel kan agonist-konsentrasjonen må senkes i case av TTX å unngå mette svar, og økte etter inkubasjon skiver i høy K + til og med se en reaksjon. Nærmere bestemt ble den DHPG konsentrasjon forskjøvet 5-15 uM etter TTX behandling til 30-50 uM etter 5,0 mM K + behandling for å studere Ca 2 +-responsmønstre, som 5-15 pM var ofte for lav til å produsere pålitelige responser i astrocytter etter å skalere ned av gruppen jeg mGluRs.

Innspillingen av astrocyte Ca 2 + aktivitet gir ingen direkte bevis for reseptor innsetting eller internalisering til eller fra plasma membranen. Men basert på den bemerkelsesverdige likheten av data med data fra tidligere studier in vitro som undersøkte den direkte sammenhengen mellom GQ GPCR uttrykk nivåer og spontan og fremkalt Ca 2 + transienter 21-24, den mest logiske tolkningen av endringene i Ca 2 + signalisering, er at de astrocyte overflate receptor expression nivåer harforandret. En utfyllende tilnærming kan være en viktig faktor hvis man ønsker å gi ytterligere bevis om locus av effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi vi brukte var å undersøke effekten av TTX inkubasjon på hippocampus skiver fra astrocytic MrgA1R mus. Disse transgene mus uttrykke en utenlandsk Gq GPCR (den MrgA1R) kun i astrocytter. Fordi denne reseptoren ikke er naturlig hjemmehørende i hjernen, er det ingen endogen neurotransmitter til stede for å endre dets aktivitet. Tidligere arbeid antydet at denne reseptoren i inngrep med samme intracellulære signaleringsmolekyler som endogent Gruppe I mGluRs i de samme 34 astrocytter. Etter langvarig inkubering av skiver fra MrgA1R mus i TTX, ingen forskjeller i agonist-fremkalt MrgA1R responser sammenliknet med kullsøster kontroll inkubert skiver vil gi bevis på at virkningen på astrocyte Ca 2 +-aktivitet skyldes endringer lokalisert til overflaten reseptoren, særlig hvis gruppen jeg mGluR svar er fortsatt betydicantly forbedret i de samme astrocytter. Et alternativ, om enn kanskje mer involvert strategi ville være å isolere astrocytter fra skivene for Western blot-analyse, så lenge som en membranfraksjon kan bli analysert for endringer i overflate-reseptor ekspresjonsnivåer. Fluorescens Aktivert Cell Sorting (FACS) eller flowcytometri kan være nyttig her.

De mulige anvendelser av denne teknikken til studiet av nerveceller, astrocytter og astrocyte-nevronale interaksjoner er mange. I våre forsøk, bare DHPG-fremkalt gruppe jeg mGluR astrocytic Ca 2 + Svarene ble studert, i isolerte akutte hippocampus skiver fra juvenile mus. Dette preparatet ikke bare har de intakte afferenter (Schaffer collaterals), men også de nervecellene som gir opphav til dem (CA3 pyramidale celler), noe som gjør det mulig å manipulere avfyring priser på disse glutamatergic nevroner på de postsynaptiske celler (CA1 pyramidale celler) og de astrocytter i stratum radiatum hvis prosesser associate med disse synapsene. Den akutte hippocampus skive er kanskje ikke den beste forberedelsen for å manipulere avfyring priser på andre typer nevroner, men er så mange afferenter avskåret fra de nervecellene som gir opphav til dem. Ikke desto mindre kan det være mulig i visse skive preparater for å observere plastisitet andre astrocytic Gq GPCR subtyper. For eksempel kan skiver være forberedt med basal forebrain kolinerge nevroner og deres anslag til hippocampus intakt. Inkubasjon av disse skiver i TTX eller forhøyet K + ville påvirke basal avfyringshastigheter på kolinerge nerveceller, som fører til skalering av mAchRs i astrocytter av stratum Oriens, som mottar en betydelig del av det kolinerge inngang 1. En alternativ metode er ennå ikke testet for å studere astrocytic reseptor skalering innenfor et bestemt område i hjernen, med alle de forbindelser intakte mens skalerings oppstår, kan være å bruke en in vivo-modell hvor en vedvarende frigjøring av TTX oppnås ved implantering av et plastic polymer Elvax 40W over regionen av interesse 35. Denne tilnærmingen har tidligere vært brukt i en studie av nevronale skalering, men bør også være aktuelt å astrocytic skalering. Til slutt, med riktig avlesning, kan fremtidige studier undersøker andre GPCR familier, inkludert endringer i G s eller g I GPCRs. Man kan forutsi astrocytic GABA B G jeg GPCRs å bli påvirket etter hemming av skyting i lokalt projisere GABA interneuroner innenfor noen skive forberedelse. Utvikling av nye indikatorer rettet mot andre signalmolekyler, som for eksempel en sanntids indikator på den andre messenger cAMP, ville åpne opp et helt nytt område av forskning på nevron-til-astrocyte reseptor kommunikasjon.

Toveis skalering av astrocytic mGluRs ved manipulering av basal neuron fyringsintensitet er et mål på følsomheten av astrocytter til AP-formidlet frigivelse av nevrotransmitter. Astrocytter kan tilsynelatende fornemme spontane APs og glutate utgivelsen på Schaffer sikkerhet-CA1 pyramide celle synapser selv når ekstracellulært K + er innenfor en fysiologisk rekkevidde. Mens akutt anvendelse av TTX ikke redusere hyppigheten av spontane astrocyte Ca 2 +-aktivitet 18, 36, 37, Ca 2 + aktivitet blant astrocytter i befolkningen blir bruk av delte 36, som gir bevis for at astrocytic reseptorer er AP detektorer. Dette tyder på at astrocytter forstand spontane nevronale APs uten innvirkning på deres samlede Ca 2 + aktivitet. Det er allment akseptert at intracellulære konsentrasjoner av IP tre trenger for å nå et terskelnivå for å stimulere IP 3 Rs tilstrekkelig til å føre til en påviselig Ca 2 + høyde. Kunne spontane nevronale APs aktivere astrocytic GPCRs uten å produsere målbare Ca 2 + høyder? Fremtidige studier kan utnytte fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) eller en lignende techn ik (slik som Bret) for å undersøke forholdet mellom G-proteinkobling til reseptoren (et mål på reseptor-aktivering) og Ca2 +-frigjøring fra interne lagre. Bret har vært brukt i stor utstrekning in vitro å påvise G protein-til-GPCR kopling 38, selv om det kan ta tid før denne teknologien blir tilgjengelig for anvendelse i intakte vevspreparater. Det er mulig at astrocytic GQ GPCRs blir aktivert mye oftere enn det som kan registreres ved hjelp av de tilgjengelige Ca 2 + bildebehandlingsverktøy. I tillegg til sensing aksjonspotensialer, kan astrocytic GQ GPCRs også være i stand til å oppdage miniatyr quantal frigjøring av nevrotransmitter som rapportert i en fersk undersøkelse 39. Det toveis skalering metoden beskrevet her kan anvendes i fremtidige studier for å gi et mål på i hvilken grad astrocytic GQ GPCR detektere quantal vesikulært frigjøring av nevrotransmitteren, ved å ta med bafilomycin A1 innenfor inkubasjonstiden protokollen.

ntent "> Så langt skalerings protokoller har bare blitt brukt i hippocampus skiver fra juvenile mus (p12-p18). Derfor er det foreløpig ukjent om astrocytic reseptor skalering kan også fremkalles i vev hentet fra voksne mus. Et overbevisende fersk studie tyder på at gruppen jeg mGluR uttrykk i astrocytter avtar betraktelig etter den første uken av alder og fortsetter å synke til voksen alder, med svært lave nivåer av reseptor uttrykk hos voksne astrocytter 40. Det vil derfor være interessant å finne ut om astrocytic mGluRs skalere opp etter lang Begrepet hemming av nevronal utløsning hos voksne mus hippocampus skiver til nivåer som nærmer seg de sett i astrocytter fra juvenile mus. Dette funnet tyder på at astrocytic reseptor uttrykk er ikke statisk ved en gitt alder, men kan endre seg raskt avhengig av nerve-aktivitet. I motsetning til redusert uttrykk av gruppen jeg mGluRs i voksne mus, er bevis dukker opp som adrenerge reseptorer, inkludert & #945, 1A, α 2A, og β en subtyper, er hovedsakelig uttrykt av astrocytter i den voksne hjernen tre, fire. Den α 1A adrenerge Gq GPCR kan være et attraktivt mål for fremtidige studier av nevron-til-astrocyte kommunikasjon, herunder om disse reseptorene er følsomme for endringer i adrenerge nevroner avfyring priser.

Disclosures

Forfatterne ønsker å avsløre at tetrodotoxin brukt i disse studiene ble kjøpt fra Abcam. Abcam hadde ingen involvering i de hypoteser, design, eller innsamling av data. All kommunikasjon vedrørende sponsing av arbeidet ved Abcam skjedde etter fagvurderingsprosessen var fullført.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke UC Riverside Center for Glial-Neuronal Interactions for verdifull diskusjon av skalerings protokoller og data. Forfatterne ønsker også å gi en oppriktig takk til Abcam for å sponse utgivelsen av sitt arbeid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamber Supplies
Brinkmann pipette storage container Fisher Scientific 03-491 Use the drawer portion as the incubation chamber
Electrical drill
Flexible tubing Tygon R-3603
Silicone seam sealant  Also called aquarium seam sealer
Gas tank 95% oxygen, 5% carbon dioxide
Natural beveled pipette tip USA Scientific 1111-1000 Cut-to-fit to connect oxygenate lines
One-to-six lines manifold Warner Instruments 64-0210 (MP-6) For the microloader-manifold apparatus
Microloader Eppendorf 5242 956.003 For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit
Floating Bubble Rack Bel Art Scienceware F18875-0400 For slice holder
600 µm Sefar Nitex Nylon mesh ELKO Filtering Co. 06-600/51 For slice holder
Krazy Glue For slice holder
Reagents
Isoflurane Baxter 1001936060
NaCl Fisher S271-3
KCl Fisher P333-500
CaCl2 Fisher C79-500
MgCl2 Fisher M33-500
NaH2PO4 Fisher S369-500
NaHCO3 Fisher S233-500
Glucose Fisher Fisher
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Acros Organics 53188-07-1
Ascorbic acid Acros Organics 401471000
Tetrodotoxin citrate (TTX) Abcam ab120055
Sulforhodamine 101 (SR-101) Sigma-Aldrich 284912
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)  Fisher Scientific D128-500
Pluronic Acid F-127 Invitrogen, Molecular Probes P6867
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) Invitrogen, Molecular Probes O6807
(RS)-3,5-DHPG Abcam ab120020
Histamine Sigma-Aldrich H7125
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) Sigma-Aldrich C4382
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) Sigma-Aldrich A7699
Dissection Tools
Single-edge razor blade  GEM 62-0161 For bisection 
Double edge razor blade TED PELLA, INC. 121-6 For cutting slices
Mayo Scissors, supercut WPI 14010-15 For decapitation
Fine iris scissors, straight Fine Science Tools 14094-11 For cutting the skull
Iris forceps, curved WPI 15915 To remove the skin and skull
Small spatula To remove/transfer the brain
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps Fine Science Tools 11295-10 For hippocampus dissection
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20B For transferring brain slices
Pasteur pipette rubber bulb Fisher 03-448-22 For transferring brain slices
Polystyrene 100 mm tissue culture dishes Corning 25020
Vibratome Leica VT 1200S
Water bath Fisher ISOTEMP 210 For warm incubation
Micropipette puller Narishige PC-10 For bolus-loading pipette
Confocal microscope Olympus Olympus Fluoview 1000
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform Warner Instruments RC-26GLP diamond bath with low profile
Borosilicate glass pipette World Precision Instruments TW150F-4 For bolus-loading pipette
Micromanipulator  Sutter Instrument ROE-200 For bolus-loading pipette
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate  Costar 8161

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices. J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).
  2. Navarrete, M., Araque, A. Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication. Neuron. 57, 883-893 (2008).
  3. Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo. Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).
  4. Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2. Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).
  5. Porter, J. T., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals. J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).
  6. Bernardinelli, Y., et al. Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus. J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).
  7. Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  8. Wang, X., et al. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  9. Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. Sorting out astrocyte physiology from pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).
  10. Agulhon, C., et al. Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes. Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).
  11. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  12. Nizar, K., et al. In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase. J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).
  13. Sutton, M. A., et al. Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis. Cell. 125, 785-799 (2006).
  14. Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57, 819-826 (2008).
  15. Xie, A. X., et al. Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates. PLoS ONE. 7, (2012).
  16. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  17. Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity. J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).
  18. Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).
  19. Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).
  20. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).
  21. Prezeau, L., et al. Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).
  22. Shao, Y., McCarthy, K. D. Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells. Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).
  23. Wang, S. S., Thompson, S. H. Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics. Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).
  24. Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization. Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).
  25. Shelton, M. K., McCarthy, K. D. Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ. J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).
  26. Hermans, E., Challiss, R. A. Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors. Biochem. J. 359, 465-484 (2001).
  27. Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ. Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).
  28. de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).
  29. Kang, J., et al. Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).
  30. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  31. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  32. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).
  33. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  34. Fiacco, T. A., et al. Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity. Neuron. 54, 611-626 (2007).
  35. Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence. PLoS One. 2, (2007).
  36. Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ. J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).
  37. Takata, N., Hirase, H. Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo. PLoS ONE. 3, e2525 (2008).
  38. Salahpour, A., et al. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction. Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).
  39. Di Castro, M. A., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).
  40. Sun, W., et al. Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult. Science. 339, 197-200 (2013).

Tags

Neuroscience astrocyte plastisitet mGluRs neuronal Firing elektrofysiologi GQ GPCRs Bolus-lasting kalsium microdomains akutte skiver Hippocampus mus
Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, A. X., Lauderdale, K., Murphy,… More

Xie, A. X., Lauderdale, K., Murphy, T., Myers, T. L., Fiacco, T. A. Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates. J. Vis. Exp. (85), e51458, doi:10.3791/51458 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter