Summary
Это видео показывает две модели развития бляшек интимы в мышиных артерий и подчеркивает различия в myointimal гиперплазии и атеросклероза.
Abstract
Различные IN VIVO модели лабораторных грызунов для индукции стеноза артерии были созданы, чтобы имитировать заболеваний, которые включают артериальную образование бляшек и стеноза, как это наблюдается, например при ишемической болезни сердца. Два очень воспроизводимые модели мыши - как в результате чего стеноза артерии, но каждый, лежащие в основе другой путь развития - вводятся здесь. Модели представляют собой две наиболее распространенные причины стеноза артерии; а именно одна модель мыши для каждого myointimal гиперплазии и атеросклероз показаны. Чтобы вызвать гиперплазию myointimal, баллонный катетер травма брюшной аорты выполняется. Для развития атеросклеротической бляшки, ApoE - / - модель мыши в сочетании с западной жирной диете используется. Различные варианты модели приспособлены для измерения и оценки результатов названы и описаны в этой рукописи. Введение и сравнение этих двух моделей обеспечивает информаион ученым выбрать подходящий артерии стеноз модель в соответствии с научной вопрос, заданный.
Introduction
В промышленно развитых странах ишемическая болезнь сердца остается основной причиной смертности 1. Причины стеноза коронарных артерий, весьма разнообразны и включают в себя myointimal гиперплазии, а также атеросклероза, с реваскуляризации оставшегося наиболее распространенные стратегии лечения 2. Исследовательских моделей, которые четко отличают между механистической путей гиперплазии интимы и атеросклероз имеют важное значение для расследования патобиологические и патофизиологические процессы в развитии артериальной бляшки. В этом видео две различные модели мыши используются для изучения либо развитие myointimal гиперплазии или атеросклероза вводятся.
Myointimal гиперплазия постулируется, чтобы сформировать с помощью "ответ-на-травмы" парадигмы первоначально описанной для атеросклероза 3. Механическое разрушение эндотелиальный слой приводит к интенсивному ремоделирования усиливается паракринных эффектов. Есть несколько диразличны х животных моделях обычно используется для изучения myointimal гиперплазии. Некоторые группы используют металлические устройства в восходящей аорты крыс 4. Аорты оголение модель выполнена с баллонного катетера также широко используется в лабораторных крыс 5,6. Гиперплазия интимы модель выполняется в лабораторных мышей 7 реализует лигирование сонной артерии и вызывает myointimal поражений 8. В нашей лаборатории, брюшной аорты модель оголение - изучить развитие myointimal гиперплазии, - а также модель гуманизированный рестеноза стента 9 обычно используются. Это видео подчеркивается, что выбор надлежащего экспериментальную животную модель имеет решающее значение для механистической или патофизиологических исследований стеноза артерии.
Myointimal модели гиперплазия следует отличать от моделей атеросклероза. Что касается последнего, аполипопротеина Е-дефицитных (ApoE - / -) мышей в сочетании с западной диеты, как правило, используется, чтобы вызвать atherosclэротические поражения 10,11,12,13. Примеры индукции оба из этих типов myointimal заболевания у мышей показано здесь, вместе с различных модельных адаптированных вариантов для анализа сосудов стеноз 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работа должна проводиться в соответствии с соответствующими руководящими принципами по уходу за животными. Получить институциональной разрешение на животных работе до протоколу начало.
1. Myointimal гиперплазия Модель (А)
Для гиперплазии модели интимы, приобрести C57Bl/6J (инвентарный номер 000664, C57BL/6J) мышей в возрасте 8 недель с массой тела около 25 г. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышей стандартное чау-чау мыши и предоставить воду по желанию.
- Подготовка Мышь: Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру.
- Снимите брюшной волосы с помощью волос триммер, лежал мышь на спину и покрыть его нос и рот маски для лица для обеспечения анестезии.
- С Прово-йод, дезинфекции области живота универсально, а затем 80%-ного этанола, в двух циклах.
- Убедите отсутствиерефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
- Отделите кожу и мышцы вдоль белой линии в два этапа по разоблачению органы брюшной полости.
- Положите кишечник в солевом увлажненной перчатки. Оберните перчатку вокруг кишечника, чтобы держать их влажными.
- Внимательно убрать жировую ткань листового материала брюшной аорты. Expose инфраренальной аорты вплоть до ее бифуркации, стараясь не травмировать любом отделении суда.
- Во-первых, разместить микрохирургической зажим на проксимальных, инфраренальной аорты закрыть кровоток. Теперь, нанесите второй дистальный зажим рядом с бифуркации аорты.
- Когда кровоток прерывается, сделать небольшой разрез в аорту, близкой к проксимального зажима.
- Вставьте воздушный шар наконечником катетера, который был увлажненной 0,9% солевой раствор, и продвигать по направлению к дистальному зажима аорты.
- Для повреждение эндотелия, оголять аорту, раздувая Ballooн осторожно и медленно вытягивать катетер в направлении проксимального зажима.
- Повторите денудации маневр дважды.
- Снимите катетер и закрыть аорты разрез с помощью 10-0 PROLENE эксплуатационные швов.
- Осторожно открывают дистальный зажим. В случае кровотечение в aortotomy сайта, закройте зажим снова обнаружить кровотечение и разместить дополнительные прерванные швы, по мере необходимости.
- Если нет кровотечения не наблюдается, медленно откройте ближний зажим.
- Аортальный импульс должен быть виден в дистальном направлении от разреза. Теперь кишечник могут быть организованы назад на месте.
- Промойте брюшной полости с использованием подогретого стерильного физиологического раствора.
- Закройте брюшная стенка начиная с мышечного слоя с использованием 6-0 проленовой эксплуатационные швов.
- Следующая адаптировать кожу под использование 5-0 PROLENE выполнения текущих швов.
- Во время мышь все еще под наркозом, применять 4-5 мг / кг Carprofen через подкожной Injeводств.
- Добавить метамизол к питьевой воде (50 мг метамизол на 100 мл) для контроля боли и продолжают в течение 3 дней после операции. Монитор животное в течение восстановления.
Примечание: Период наблюдения для этой модели составляет 28 дней.
2. Атеросклероз модели (B)
Для модели атеросклероза, приобрести недостатком алипопротеина (ApoE - / -) мышей (инвентарный номер 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) в возрасте 4 недель, а затем подается в течение 4-6 месяцев. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышам высокую липидный западную диету по прибытии (Харлан лаборатории TD.88137) и обеспечить воду без ограничений в течение от 4 до 6 месяцев.
- Подготовка Мышь:
- Поток ApoE - / - мыши с западной диеты, начиная с 4-недельного возраста. Диетические манипуляции следует начинать непосредственно по прибытии.
- Поддерживать западную диету в течение продолжительности эксперимента. </ Li>
3. Анализ
- Myointimal модель гиперплазия (А)
Область интереса к этой модели является "поражение площадь". Варианты анализа включают в себя просвета облитерации, отношение I / M (отношение интима / медиа), максимальная толщина myointima, myointimal область, Trichrome окрашивание фиброза и H & E окрашивание на мононуклеарных клеток (как показано на фиг.1А-1С). Согласно научным вопросом многие другие окрашивания как Picrosirius красный для коллагена, иммуногистохимии и конфокальной методов могут быть применены. - Атеросклероз модель (B)
Области интереса к этой модели аортальный клапан, дуги аорты, а также нисходящей аорты. Опции для анализа: Судан красный окрашивания для липидов и трехцветный окрашивания аортального клапана, дуги аорты и нисходящей аорты (как показано на рисунке 1D).
Эта модель также дает множество других вариантов окрашивания, какнапример нефтяной Red О нейтральных липидов, Picrosirius красный, иммуногистохимии и конфокальной методов.- Красный окрашивание Судан: Выполните красную окраску Судан на свеже собранного аорты ткани.
- Снимите диеты 6h до сбора урожая.
- Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру. Убедите отсутствие рефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
- Откройте сундук; отрезать верхушки сердца и заливать через левый желудочек, сначала насыщенным раствором соли (3 мл), а затем 4% PFA (3 мл) через корня аорты, чтобы зафиксировать аорты.
- Освободите аорту от корня к ее бифуркации. Попробуйте удалить жировой ткани как можно больше.
- Отрежьте сердце и корня аорты, и хранить их в 4% PFA для гистологии.
- Для гистологии корень аорты должен тщательно быть помещены в парафиновый блок в вертикальном положении, чтобы позволить вырубку ЗОтик корень генерирующие слайды, которые отображают все 3 клапанных листовки.
- Отрежьте один конец аорты дерева и исправить ее на силиконового слоя с мелкими контактов. Откройте аорты в продольном направлении и зафиксировать аорты ткани.
- Промыть ткань с 50%-ным этанолом. Погрузите ткань с Судан III красящим раствором в течение примерно 15 мин.
- Промойте слегка с 50% этанола, чтобы удалить избыток Судан III. (Примечание: 50% этанола может вымыть краску прочь.) Промыть дН 2 O, и сделать фотографии для дальнейшего анализа.
- Красный окрашивание Судан: Выполните красную окраску Судан на свеже собранного аорты ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны различные варианты анализа и индуцированное болезненное состояние для обеих моделей. Для модели гиперплазии интимы, анализ представительств сечений в трихромом окрашивания показана. Из этих сечений, результаты, как в / м нормативов, максимальной толщиной бляшек, максимальной толщиной интимы в просвете, просвета уничтожения в процентах, а также площади бляшки могут быть измерены и рассчитаны.
Чтобы оценить результаты модели атеросклероза, все методы, названные выше, можно использовать. Кроме того, количественное площадь бляшки в брюшной аорты, степень образования бляшек на аортального клапана, дуги аорты и нисходящей аорты может быть измерена с помощью трихромом окрашивания.
Рисунок 1. Оголенных аорты мыши собирают, парафин, а также представитель сечение показано на трихромом окрашивания (А). Я / M соотношения рассчитываются на TriChrome окрашенных срезов путем измерения интима и толщины материала с помощью компьютерного анализа с последующим расчете коэффициента (B). Максимальная толщина доска измеряется как максимальной толщины интимы в просвете по компьютерной морфометрии (B). Luminal уничтожение (в процентах) определяется путем вычитания новые внутренний просвет от бывших просвета, разделенных бывших просвета, умноженной на 100% (С). Площадь доска оценивается путем вычитания новых внутренний просвет от бывших просвет (С). Нисходящей аорты, открыл продольно липофильных структур и окрашивали Судан красный показано (D). Определить количественный площади бляшки, Судан красный окрашенных поражения, а также общее аорты область, измеряются и аназет с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Сечения парафином образцов аортального клапана, дуги аорты и нисходящей аорты в трихромом изображены (Е). Luminal уничтожение, доска область, и максимальная толщина доска рассчитываются как описано выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя оба заболевания приводят к похожими симптомами у пациента, основные механизмы развития бляшек и, следовательно, подходы к лечению очень разные 2. В различных формах стеноза артерии клинические результаты у больных, а также временные рамки развития бляшки зависит от базового механизма.
В зависимости от результатов клинического осмотра у пациента, различные методы анализа проб должны быть выполнены 5,15. Необходимо адаптировать анализ с характерными находками в болезни, которая в настоящее время имитируется выбранной модели 14. И наоборот, в зависимости от заболевания изучается, наиболее возможно и целесообразно животной модели должны быть выбраны. Кроме того, очень важно, чтобы новые препараты должны механистически соответствовать модели.
Обе модели, представленные в данной публикации, быстро и легко выполнять и высокую воспроизводимость. Есть некоторые маJOR различия между моделями. Например, время наблюдения в гиперплазии модели myointimal составляет 28 дней 16, в то время как развитие атеросклеротической бляшки нуждается четырех до шести месяцев 17.
Еще одним важным отличием является применимость к различным линий мышей. Атеросклероз модель основывается на ApoE - / - или LDL - / - мышей и, следовательно, может быть выполнена только у мышей, несущих эту конкретную нокаут. Для создания мышей, несущих как ApoE - / - и другого желаемого нокаут очень много времени. Myointimal гиперплазия индуцировать воздушного шара травмы операции могут быть выполнены в любом мыши. В myointimal гиперплазия модели дает больше потенциальных изменить напряжение мыши интересов, в то время как атеросклеротическая модель сталкивается строгого ограничения в мышей, несущих в ApoE - / -.
Интенсивность воздушного шара денудации имеет решающее значение для исхода myointimal поражений гиперплазии. Если травма катетер проводится слишком общ.ressively, образование аневризмы может произойти; если оголение выполняется слишком мягко, развитие доска может быть слишком слабым, чтобы увидеть различия между группами. В этой процедуре было бы полезно, если все операции в рамках одного исследования выполняются одним и тем же лицом. Преимущество баллонного повреждения по отношению к другим методам, которые требуют введения жестких или острых препятствий, как провода, является гибкость, а также возможность настроить размер и давления в баллоне с помощью инфляции баллонного наконечником катетера. Кроме того, неинфлированных баллон с наконечником катетера является тонким и может быть вставлен в аорту через относительно небольшой разрез по сравнению с более толстыми, более жестких инструментов денудации. Для атеросклеротической модели образования бляшек это может иметь решающее значение для начала подачи западную диету в молодом возрасте мышей потому что это может иметь большое влияние на тяжесть поражения. С поражения в обоих предложенных моделей развиваться в обоих женских и мужских мышей, гендерный может быть ADAPTEг требованиям эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Кристиана Pahrmann для оказания технической помощи. СС получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 и SCHR992/4-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
