Summary
Bu video kemirgen arterlerde intimal plak iki kalkınma modelleri gösterir ve miyointimal hiperplazi ve ateroskleroz farklılıkları vurgulamaktadır.
Abstract
Arter stenozu uyarılması için çeşitli in vivo laboratuvar kemirgen modelleri, iskemik kalp hastalığı, örneğin görüldüğü gibi, arter plak oluşumu ve stenoz hastalıkları taklit etmek için kurulmuştur. İki yüksek tekrarlanabilir fare modelleri - iki arter darlığı sonuçlanan ancak her gelişme farklı bir yol yatan - burada tanıtılmaktadır. Modeller arter darlığının en yaygın iki nedeni temsil eder; yani tek bir fare, her miyointimal hiperplazisi için model ve ateroskleroz gösterilmiştir. Miyointimal hiperplaziyi indükleme için, abdominal aortun balon kateter yaralanma gerçekleştirilir. Aterosklerotik plak gelişimi için, ApoE - / - Batı yağlı diyet ile birlikte fare modeli kullanılmaktadır. Sonuçlarının ölçülmesi ve değerlendirilmesi için farklı model seçenekleri adapte bu yazının adlandırılmış ve tanımlanmıştır. Bu iki modelin tanıtımı ve karşılaştırma informat sağlarBilim adamları sordu bilimsel soruya göre uygun arter darlığı modelini seçmek için iyon.
Introduction
Sanayileşmiş ülkelerde iskemik kalp hastalığı mortalite 1 önde gelen nedenidir. Koroner arter darlığı için nedenleri çeşitlidir ve en yaygın tedavi stratejisini kalan 2 revaskülarizasyon ile miyointimal hiperplazi yanı sıra ateroskleroz içerir. Açık intimal hiperplazi ve ateroskleroz mekanistik yollar arasında ayrım Research modelleri arter plak gelişimi patabiyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için gereklidir. Bu video miyointimal hiperplazi veya ateroskleroz gelişimi ya da çalışma için kullanılan iki farklı fare modelleri yerleştirilir.
Mıyoıntimal hiperplazının ilk ateroskleroz 3 için anlatılan "cevabı-to-zedelenmesi" paradigması ile oluşturulması için kabul edilmektedir. Endotel tabakasının mekanik bozulma parakrin etkisi ile gelişmiş yoğun bir yeniden yol açar. Birkaç di vardırfferent hayvan modelleri yaygın mıyoıntimal hiperplazının incelemek için kullanılmıştır. Bazı gruplar sıçanların 4 aortta metal cihazlar kullanın. Bir balon kateter aort soyulma modeli aynı zamanda yaygın laboratuar sıçanlarda 5,6 kullanılır. Laboratuvar fareleri 7 gerçekleştirilen intimal hiperplazi modeli karotis arter ligasyonu uygular ve miyointimal lezyonlar 8 uyarmaktadır. Laboratuvarda, abdominal aort denüdasyon modeli - yanı sıra bir insanlaşmış stent restenoz modeli 9 sık kullanılan - miyointimal hiperplazi gelişimini incelemek için. Bu video uygun deneysel hayvan modeli seçerek arter darlığının mekanik veya patofizyolojik çalışmalar için çok önemli olduğunu vurguluyor.
Miyointimal hiperplazi modelleri ateroskleroz modellerden ayırt edilmelidir. İkincisi, apolipoprotein E-eksikli (ApoE - / -) western diyet ile kombinasyon halinde farenin yaygın Atheroscl üretmek için kullanılırerotik lezyonlar 10,11,12,13. Farelerde miyointimal hastalığı bu tür her ikisinin de indüksiyonu için örnek olarak damar darlığı 14 analiz etmek için adapte edilmiş farklı model seçenekleri ile birlikte, burada gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları ilgili hayvan bakım kurallarına göre yapılmalıdır. Önce başlangıç protokole hayvan çalışmaları için kurumsal onay almak.
1.. Miyointimal Büyümesi Modeli (A)
Intimal hiperplazi modeli için, C57Bl/6J (Stok sayısı 000.664, C57BI/6J) yaklaşık 25 gr ağırlığındaki 8 haftalık yaşta fareler satın. , Alışılmış koşullar altında, bu deneyler için Ev farenin; fareler standart fare yemi yem ve su ad libitum sağlar.
- Fare hazırlanması: Bir indüksiyon odası kullanan izofluran (% 2) ile anestezi durumuna fare tanıtılması.
- Sırtında fare yattı ve anestezi sağlamak için yüz maskesi ile burun ve ağız kapağı, saç düzeltici kullanılarak karın saç çıkarın.
- Provo-İyot ile, iki döngüleri,% 80 etanol ile takip evrensel karın bölgesi, dezenfekte.
- Yokluğunun sağlayınanestezi yeterli derinliği izlemek için arka uzuv kısma reflekslerin.
- Karın organları ortaya çıkarmak için iki adımda linea alba boyunca deri ve kas ayırın.
- Bir tuzlu nemli eldiven bağırsakları yatıyordu. Nemli tutmak için bağırsakların etrafında eldiven sarın.
- Dikkatle abdominal aorta taneleştirici yağ dokusu kaldırmak. Herhangi bir şube damarları kesmemeye özen, aşağı onun çatallanma infrarenal aort Açığa.
- İlk olarak, kan akışını kapatmaya, proksimal üzerinde infrarenal aorta bir mikrocerrahi kelepçe yerleştirin. Şimdi, aort bifürkasyon yanında ikinci bir uzak kelepçe geçerlidir.
- Kan akışı kesildiğinde, proksimal kelepçe yakın aort içine küçük bir kesi yapar.
- % 0.9 serum fizyolojik ile nemlendirilmelidir olmuştur balon uçlu bir kateter, yerleştirin ve aort distal kelepçe doğru ilerlemek.
- Endotel hasarı için, Balloo şişirilerek aort soymakn dikkatlice ve yavaşça yakın kelepçenin yönde kateter çekerek.
- Iki denüdasyon manevrayı tekrarlayın.
- Kateteri çıkarın ve 10-0 prolen çalışan suturlerle aort kesi kapatın.
- Dikkatlice distal kelepçe açın. Aortotomy yerinde kanama durumunda, gerekli, tekrar kelepçeyi kapatmak kanamayı bulmak ve ek kesintiye dikiş yerleştirin.
- Kanama görülmedi edilebilir, yavaş yavaş proksimal kelepçe açın.
- Aort nabız kesiden distale görünür olmalıdır. Şimdi bağırsak yerinde geri düzenlenebilir.
- Önceden ısıtılmış steril tuzlu su kullanan karın boşluğuna durulayın.
- Karın duvarı 6-0 prolen çalışan suturlerle kas tabakası ile başlayan kapatın.
- Sonraki 5-0 prolen performans çalışan sütür kullanım altında cildi adapte.
- Süre boyunca fare hala uyuşturulduktan, bir deri altı inje yoluyla 4-5 mg / kg Carprofen uygulayınction.
- Ağrı kontrolü için içme suyu (100 ml başına 50 mg metamizol) için metamizolün ekleyin ve 3 gün sonrası ameliyat için devam ediyor. Kurtarma boyunca hayvan izleyin.
Not: Bu model için gözlem süresi 28 gündür.
2.. Ateroskleroz Modeli (B)
4 haftalık bir yaşta fareler (Stock sayısı 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J), ve daha sonra 4-6 ay boyunca beslenen ateroskleroz modeli için, apolipoprotein E-eksikli (- / - ApoE) satın. , Alışılmış koşullar altında, bu deneyler için Ev farenin; farelere girişte yüksek lipid batı diyet (Harlan Laboratories TD.88137) beslemek ve 4 ila 6 aylık bir süre için su ad libitum sağlar.
- Fare hazırlama:
- ApoE Yem - / - Batı diyet ile fareler 4 hafta başlayan. Diyet manipülasyon girişte doğrudan başlamalıdır.
- Deney süresi boyunca batı diyet sürdürmek. </ Li>
3. Analizi
- Miyointimal hiperplazi modeli (A)
Bu modelde ilgi bölgesi "lezyon alanı" dir. Analizi için seçenekler luminal obliterasyonu arasında, I / E oranı (intima / media oranı), maksimal myointima kalınlık, miyointimal bölge, fibrozit trikrom ve mononükleer hücreler için H & E boyama (Şekil 1A-1C 'de gösterildiği gibi). Bilimsel soruya göre Picrosirius kollajen için kırmızı, immünhistokimya ve konfokal yöntemleri gibi çok sayıda diğer boyamaları uygulanabilir. - Ateroskleroz modeli (B)
Bu modelde ilgi bölgeleri, aort kapak, aort hem de azalan aorta bulunmaktadır. Analiz için Seçenekler: Sudan kırmızı lipidler için boyama ve aort kapağı, aort kavsi ve inen aorta (Şekil 1D gösterildiği gibi) bir trichrome boyama.
Bu model aynı zamanda boyama gibi diğer çeşitli seçenekler elde edilirNötr lipidler, Picrosirius kırmızı, immünohistokimya ve konfokal yöntemleri için örneğin Yağlı Kırmızı O için.- Sudan kırmızı boyama: taze hasat aort dokusu üzerine Sudan kırmızı boyanma gerçekleştirin.
- Hasat öncesi diyet 6s çıkarın.
- Bir indüksiyon odası kullanan izofluran (% 2) ile anestezi durumuna fare tanıtılması. Anestezi derinliğinin izlenmesi için yeterli bir arka uzuv kısma refleksleri yokluğunu sağlayın.
- Göğüs açın; Kalbin tepe kesilmiş ve aort düzeltmek için aort kökü ile% 4 PFA (3 mi), ardından tuzlu su ilk (3 mi) ile sol ventrikil yoluyla serpmek.
- Onun çatallanma kökünden aort ücretsiz. Yağ dokusu mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın.
- Kalp ve aort kökü kesilmiş ve histoloji için% 4 PFA saklayın.
- Histoloji için aort kökü dikkatlice AOR kesilmesini sağlamak için bir dik konumda parafin blok içine yerleştirilebilir zorundadır3 kapak broşürler gösterilecek tik kök üreten slaytlar.
- Aort ağacın bir ucunu kesin ve ince iğneler ile silikon tabaka üzerine bunu düzeltmek. Uzunlamasına açın ve aort aort doku çözmek.
- % 50 etanol ile doku durulayın. Yaklaşık 15 dakika boyunca Sudan III boyama çözeltisi ile doku bırakın.
- Fazla Sudan III çıkarmak için% 50 etanol ile hafifçe durulayın. DH 2 O ile durulayın, ve daha fazla analiz için fotoğraf çekmek: (% 50 etanol uzak boyayı olabilir. Not).
- Sudan kırmızı boyama: taze hasat aort dokusu üzerine Sudan kırmızı boyanma gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, farklı analiz seçenekleri ve her iki model için uyarılan hastalık durumunu gösterir. Intimal hiperplazi modeli için, trikrom boyanması için temsili kesitlerin analizi gösterilmektedir. Bu kesitler, ben / M oranı, en plak kalınlığı, lümen maksimum intimal kalınlıkta yüzde olarak luminal yok edilmesi, hem de leke alanı gibi sonuçlar ölçülebilir ve hesaplanabilir.
Ateroskleroz modeli sonucunu değerlendirmek için, yukarıda adı geçen tüm yöntemler kullanılabilir. Buna ek olarak, abdominal aortta kantitatif plak bölge, aort kapağı, aortik ark ve inen aort plak oluşumunun ölçüde trichrome boyama ile ölçülebilir.
Şekil 1. Denuded fare aortlar parafin, hasat edilir, ve temsili kesit trichrome boyama (A) gösterilir. I / M oranı oranı (B) hesaplanması, ardından bilgisayar analizi ile intima ve media kalınlığı ölçülerek trichrome boyanan kesitler hesaplanır. En fazla plak kalınlığı bilgisayar morfometrisi (B) ile lümen maksimum intimal kalınlığı olarak ölçülür. (Yüzde olarak) Luminal obliterasyon, çarpı% 100 eski lümen, (C) ile eski bölünmüş lümen, gelen yeni bir iç lümen çıkarılarak belirlenir. Plak alan eski lümen (C) 'den yeni bir iç lümen çıkarılmasıyla değerlendirilir. Inen aort, lipofilik yapılarla boylama olarak açıldı ve Sudan Kırmızı (D) gösterilmiştir ile boyanmıştır. Nicel plak alanı belirlemek için, Sudan kırmızı lekeli lezyonlar gibi, toplam aort alanı ölçülmüş ve analy edilirGörüntü analiz yazılımı kullanılarak zed. Parafin aort kapak gömülü numuneleri, aort arkı ve trichrome yılında inen aorta kesitleri (E) tasvir edilmiştir. Yukarıda açıklandığı gibi luminal tıkanıklığa, plak alan ve maksimum plak kalınlığı hesaplanır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her iki hastalık, hastanın içindeki belirtileri neden olmakla birlikte, plak gelişimi altında yatan mekanizmaları ve bu nedenle tedavi yaklaşımları 2 çok farklıdır. Arteriyel darlık farklı şekillerde hastalarda klinik bulgular yanı sıra plak gelişim zaman dilimi yatan mekanizma bağlıdır.
Hastada klinik bulgulara bağlı olarak, numune farklı analiz yöntemleri 5,15 yapılmalıdır. Bu, seçilen model 14 tarafından taklit edilmektedir hastalığın karakteristik bulgular için analizi uyum için gereklidir. Tam tersi, çalışılan hastalığa bağlı olarak, en uygun ve uygun hayvan modeli seçilmelidir. Ayrıca, yeni ilaçlar mekanistik modeli eşleşmesi gerektiğini önemlidir.
Bu yayında tanıtılan iki model hızlı ve gerçekleştirmek için kolay ve son derece tekrarlanabilir. Bazı ma vardırmodeller arasında Jor farklılıklar. Aterosklerotik plak gelişimi 4-6 aylık 17 ihtiyacı Örneğin, miyointimal hiperplazi modelinde gözlem süresi, 28 gün 16'dır.
Bir diğer önemli farklılık, farklı fare suşları için uygulanabilmesidir. Ateroskleroz modeli ApoE dayanır - / - veya LDL - / - farelerde ve bu yüzden sadece bu özel nakavt taşıyan farelerde gerçekleştirilebilir. - / - ApoE hem taşıyan fareler oluşturmak ve istenilen başka nakavt çok zaman alıcıdır. Balon hasarı cerrahi uyaran miyointimal hiperplazisi bir fare yapılabilir. - / - Ateroskleroz modeli ApoE taşıyan farelere sıkı bir sınırlama yüzleri ise, ilgi konusu fare suşu değiştirmek için daha fazla potansiyel miyointimal hiperplazi modeli verim.
Balon soyulma yoğunluğu miyointimal hiperplazi lezyonların sonuç için önemlidir. Kateter yaralanma çok agg gerçekleştirilirseressively, anevrizma oluşumu meydana gelebilir; denüdasyon çok nazikçe yapılırsa, plak gelişimi gruplar arasındaki farkı görmek için çok zayıf olabilir. Bir çalışmada içindeki tüm ameliyatlar aynı kişi tarafından yapılması halinde bu prosedürde faydalı olacaktır. Telleri gibi sert veya sivri engellerin giriş gerektiren diğer teknikler karşı balon yaralanma avantajı, esneklik hem de balon uçlu kateter enflasyonu ile balonun boyutunu ve basınç ayarlamak için bir seçenektir. Ayrıca, şişirilmiş balon uçlu kateter ince ve daha kalın, daha sert çıplak hale getirme araçları ile karşılaştırıldığında nispeten küçük bir kesik yoluyla aort içine sokulabilir. Bu lezyonların şiddeti üzerinde büyük bir etkisi olabilir çünkü aterosklerotik plak oluşumu modeli için farelerin genç yaşta batı diyet beslenme başlatmak için çok önemli olabilir. Her iki tanıtılan modeller lezyonları hem de dişi ve erkek farelerde geliştirmek yana, cinsiyet adapte olabilirDeneyin ihtiyaçlarına d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik yardım için Christiane Pahrmann teşekkür ederim. SS Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 ve SCHR992/4-2) fon aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
