Summary
Denne video viser to modeller af intima plak udvikling i murine arterier og understreger forskellene i myointimal hyperplasi og åreforkalkning.
Abstract
Forskellige in vivo laboratorium gnavermodeller for induktion af arteriestenose er blevet etableret til at efterligne sygdomme, der indbefatter arteriel plaque-dannelse og stenose, som observeret for eksempel iskæmisk hjertesygdom. To meget reproducerbare musemodeller - både resulterer i arterie stenose men hver underliggende en anden vej for udvikling - er introduceret her. Modellerne repræsenterer de to mest almindelige årsager til arterie stenose; nemlig en musemodel for hver myointimal hyperplasi og aterosklerose bliver vist. At fremkalde myointimal hyperplasi er en ballonkateterlæsion af den abdominale aorta udføres. Til udvikling af aterosklerotisk plak, den ApoE - / - er musemodel i kombination med vestlig fed kost anvendes. Forskellige model-tilpassede muligheder for måling og evaluering af resultaterne er navngivet og beskrevet i dette manuskript. Indførelsen og sammenligning af disse to modeller giver information for forskerne at vælge den relevante arterie stenose model i overensstemmelse med den videnskabelige spørgsmål stillet.
Introduction
I de industrialiserede lande fortsat iskæmisk hjertesygdom en førende årsag til dødelighed 1.. Årsagerne til koronararteriestenose er mangfoldige og omfatter myointimal hyperplasi samt åreforkalkning, med revaskularisering resterende den mest almindelige behandling strategi 2. Forsknings-modeller, der klart skelner mellem de mekanistiske veje for intimahyperplasi og åreforkalkning er afgørende at undersøge patobiologiske og patofysiologiske processer i arteriel plaque udvikling. I denne video introduceres to forskellige musemodeller bruges til at studere enten udvikling af myointimal hyperplasi eller åreforkalkning.
Myointimal hyperplasi postuleres til dannelse via "svar-til-skade" paradigme oprindeligt beskrevet for atherosklerose 3. Den mekaniske afbrydelse af endothellaget fører til en intens remodeling forstærket af parakrine virkninger. Der er flere different dyremodeller almindeligt anvendt til at studere myointimal hyperplasi. Nogle grupper bruge metal-enheder i opstigende aorta af rotter 4. Aorta blotlægning model udført med et ballonkateter er også almindeligt anvendt i laboratorierotter 5,6. Den intimahyperplasi model udføres i laboratoriemus 7 gennemfører ligering af halspulsåren og inducerer myointimal læsioner 8. I vores laboratorium, den abdominale aorta blotlægning model - at undersøge udviklingen af myointimal hyperplasi - samt et humaniseret stent restenose model 9 er almindeligt anvendt. Denne video fremhæver, at vælge den rigtige eksperimentel dyremodel er afgørende for mekanistiske eller patofysiologiske undersøgelser af arteriel stenose.
Myointimal hyperplasi modeller skal adskilles fra åreforkalkning modeller. For sidstnævnte, apolipoprotein E-deficiente (ApoE - / -) mus i kombination med vestlige kost almindeligvis anvendes til at fremkalde atherosclerotiske læsioner 10,11,12,13. Eksempler på induktion af begge disse typer af myointimal sygdom i mus er vist her, sammen med forskellige model-tilpassede muligheder for at analysere fartøjets stenose 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde skal udføres i henhold til relevante retningslinjer dyrepleje. Opnå institutionel godkendelse til dyr arbejde forud for starten protokol.
1.. Myointimal Hyperplasi Model (A)
For intimahyperplasi model, købe C57BL/6J (Stock nummer 000.664, C57BL/6J) mus i en alder på 8 uger vejer cirka 25 gram. Husmus for disse eksperimenter under konventionelle betingelser; fodre mus standard musefoder og give vand ad libitum.
- Forberedelse mus: Indføre musen til et bedøvelsesmiddel tilstand med isofluran (2%) udnytte en induktion kammer.
- Tag den abdominale hår ved hjælp af en hår trimmer, lægge musen på ryggen og dækker sin næse og mund med ansigtsmasken at sikre anæstesi.
- Med Provo-Jod, desinficere maveregion universelt, efterfulgt af 80% ethanol, i to cyklusser.
- Sørg fraværetreflekser ved at knibe bagbenet at overvåge tilstrækkelig dybde af anæstesi.
- Adskil huden og musklen langs linea alba i to trin for at eksponere den abdominale organer.
- Læg tarmene i en saltvand fugtet handske. Wrap handsken omkring tarmene til at holde dem fugtige.
- Opmærksomt rydde fedtvævet tilskærer den abdominale aorta. Expose den infrarenale aorta ned til sin tvedeling, pas på ikke at såre nogen filial fartøjer.
- Placer først en microsurgical klemme på den nærmeste, infrarenal aorta at lukke blodgennemstrømningen. Nu gælder en anden distal klemme ved siden aortaforgreningen.
- Når blodtilførslen afbrydes, lave et lille snit i aorta tæt til den proximale klemme.
- Sæt ballon spids kateter, som er blevet fugtet med 0,9% saltvand og videre mod den distale klemme af aorta.
- For endotel skade, denude aorta ved at puste den balloon forsigtigt og langsomt trække kateteret i retning af den proximale klemme.
- Gentag denudering manøvre to gange.
- Fjern kateteret og luk aorta snit ved hjælp 10-0 PROLENE kører suturer.
- Åbn forsigtigt den distale klemme. I tilfælde af blødning på aortotomy site, lukke klemmen igen, finde blødning og placere yderligere afbrudte sting, som er nødvendigt.
- Hvis der ikke kan observeres ingen blødning, åbnes den proksimale klemme.
- En aorta puls skal være synlig distalt fra snittet. Nu tarmene kan arrangeres tilbage in situ.
- Skyl bughulen udnytte foropvarmet sterilt saltvand.
- Luk bugvæggen begynder med muskel lag ved hjælp 6-0 prolene kører suturer.
- Næste tilpasse huden under brug af 5-0 PROLENE udfører kører suturer.
- I den tid musen stadig bedøvet anvendes 4-5 mg / kg Carprofen via en subkutan injektion.
- Læg Metamizol til drikkevand (50 mg Metamizol per 100 ml) for smerter kontrol og fortsætte i 3 dage efter kirurgi. Overvåg dyr hele opsving.
Bemærk: Den observationsperioden for denne model er 28 dage.
2.. Atherosklerosemodel (B)
For åreforkalkning model, købe apolipoprotein E-mangel (ApoE - / -) mus (Stock nummer 002.052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) i en alder af 4 uger og derefter føres til 4-6 måneder. Husmus for disse eksperimenter under konventionelle betingelser; fodre mus høj lipid vestlige kost ved ankomst (Harlan Laboratories TD.88137) og giver vand ad libitum med en varighed på 4 til 6 måneder.
- Forberedelse Mus:
- Feed ApoE - / - mus med vestlige kost begyndende ved 4 ugers alderen. Diæt bør begynde direkte ved ankomsten.
- Oprethold vestlige kost hele varigheden af eksperimentet. </ Li>
3. Analyse
- Myointimal hyperplasi model (A)
Regionen af interesse i denne model er "læsion området". Muligheder for analysen indeholde luminale udslettelse, I / M-forhold (intima / media ratio), maksimal myointima tykkelse, myointimal område, Trichrome farvning for fibrose, og H & E farvning for mononukleære celler (som illustreret i figur 1A-1C). Ifølge den videnskabelige spørgsmål kan anvendes mange andre farvninger som PicroSirius rød for kollagen, immunhistokemi, og konfokal metoder. - Atherosclerosis model (B)
De regioner af interesse i denne model er aortaklappen, aortabuen samt aorta descendens. Muligheder for analyse: Sudan red farvning for lipider og trikrom farvning af aortaklappen, aortabuen og aorta descendens (som illustreret i figur 1D).
Denne model giver også en række andre farvnings muligheder somfor eksempel Oil Red O for neutrale lipider, PicroSirius rød, immunhistokemi og konfokal metoder.- Sudan red farvning: Udfør Sudan red farvning på frisk høstet aortavæv.
- Fjern kosten 6h før høst.
- Indføre musen til et bedøvelsesmiddel tilstand med isofluran (2%) udnytte en induktion kammer. Forsikre fravær af reflekser ved at knibe bagbenet at overvåge tilstrækkelig dybde af anæstesi.
- Åbn brystet; afskære toppunktet af hjertet og perfundere via den venstre ventrikel, først med saltvand (3 ml), efterfulgt af 4% PFA (3 ml) ved aortaroden at fastsætte aorta.
- Befri aorta fra roden til dens forgrening. Forsøge at fjerne fedtvæv så meget som muligt.
- Skær hjertet og aorta roden, og gemme dem i 4% PFA til histologi.
- For histologi aortaroden har omhyggeligt placeres i paraffin blok i en opretstående stilling for at tillade skæring af AORtic rod genererende dias, der viser alle 3 valvulær foldere.
- Skær den ene ende af aorta træet og ordne det på silicone lag med fine ben. Åben aorta på langs og løse aortavæv.
- Skyl vævet med 50% ethanol. Fordyb vævet med Sudan III farvning løsning for omkring 15 minutter.
- Skyl let med 50% ethanol for at fjerne overskydende Sudan III. (Bemærk: 50% ethanol kan vaske farven væk.) Skyl med dH2O og tage fotos til yderligere analyse.
- Sudan red farvning: Udfør Sudan red farvning på frisk høstet aortavæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser forskellige analysemuligheder og induceret sygdom tilstand for begge modeller. For intimahyperplasi model, er analysen af repræsentative tværsnit i trikrom farvning vist. Fra disse tværsnit, kan måles og beregnes resultater som I / M-forhold, maksimal plaque tykkelse, maksimal tykkelse af intima i lumen, luminale udslettelse i procent, samt plak område.
For at vurdere resultatet af atherosklerose-model kan anvendes alle fremgangsmåder nævnt ovenfor. Ud over den kvantitative plaqueareal i den abdominale aorta, kan måles via trikrom farvning omfanget af plakdannelse ved aortaklappen, aortabuen og aorta descendens.
Figur 1. Blottet mus aortaer høstes, paraffin indlejret, og et repræsentativt udsnit er vist i trikrom farvning (A). I / M nøgletal er beregnet på Trichrome farvede sektioner ved at måle intima og media tykkelse ved hjælp af computer-analyse efterfulgt af beregning af forholdet (B). Maksimal plaque tykkelse måles som den maksimale tykkelse af intima i lumen via computer morfometri (B). Luminale udslettelse (i procent) bestemmes ved at fratrække de nye indre lumen fra de tidligere lumen, divideret med de tidligere lumen, ganget med 100% (C). Plaque område vurderes ved at subtrahere de nye indre lumen fra de tidligere lumen (C). Den faldende aorta, åbnede på langs med lipofile strukturer og farves med Sudan red vises (D). For at bestemme den kvantitative plak område, Sudan rødfarvede læsioner samt det samlede aorta område, måles og analyserZed hjælp billede analyse software. Tværsnit af paraffin indlejrede prøver af aortaklappen, aortabuen og aorta descendens i trichrom er afbildet (E). Luminale udslettelse, plaque-området, og maksimal plaque tykkelse beregnes som beskrevet ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om begge sygdomme resulterer i lignende symptomer hos patienten, de underliggende mekanismer af plaque-udvikling og derfor de behandlingsmetoder er meget forskellige 2. I forskellige former for arteriel stenose de kliniske resultater hos patienter, samt tidsrammen for plak udvikling afhænger af den underliggende mekanisme.
Afhængigt af de kliniske resultater hos patienten, skal forskellige analysemetoder prøve udføres 5,15. Det er nødvendigt at tilpasse analysen til de karakteristiske fund i den sygdom, der bliver efterlignes af den valgte model 14.. Vice versa, afhængigt af den sygdom, der undersøges, skal vælges den mest muligt og passende dyremodel. Desuden er det afgørende, at nye lægemidler mekanistisk skal matche modellen.
Begge modeller introduceret i denne publikation er hurtige og nemme at udføre og meget reproducerbar. Der er nogle maede store forskelle mellem modellerne. For eksempel observationstid i myointimal hyperplasi model er 28 dage 16, mens aterosklerotisk plakudvikling behov fire til seks måneder 17.
En anden væsentlig forskel er anvendelsen på forskellige musestammer. Den åreforkalkning Modellen bygger på ApoE - / - eller LDL - / - i mus, og kan derfor kun udføres i mus, der bærer denne specifikke knockout. At skabe mus, der bærer både ApoE - / - og en anden ønsket knockout er meget tidskrævende. Den myointimal hyperplasi inducere ballonbeskadigelse kirurgi kan udføres i enhver mus. De myointimal hyperplasi model udbytter flere potentielle at ændre muse stamme af interesse, mens den aterosklerotisk model står over for en streng begrænsning for mus, der bærer den ApoE - / -.
Intensiteten af ballon blotlægning er afgørende for resultatet af de myointimal hyperplasi læsioner. Hvis kateteret skade udføres for aggressively, kan der opstå aneurismedannelse; hvis blotlægning udføres for blidt, kan udviklingen af plaque være for svag til at se forskelle mellem grupperne. I denne procedure er det nyttigt, hvis alle operationer inden for en undersøgelse er udført af den samme person. Fordelen af ballonen skade til andre teknikker, der kræver indførelse af stive eller skarpe forhindringer som ledninger, er den fleksibilitet, samt mulighed for at justere størrelsen og trykket i ballonen via oppustning af ballonen spids kateter. Endvidere uopblæste ballon spids kateter er tynd og kan indsættes i aorta via en relativt lille snit i forhold til tykkere, mere stive blottelse værktøjer. For det aterosklerotiske plaque dannelse model kan det være afgørende at begynde at fodre den vestlige kost i en ung alder af musene, fordi det kan have en stor indflydelse på sværhedsgraden af læsionerne. Da læsioner i begge introducerede modeller udvikle sig i både kvindelige og mandlige mus, kan køn være adapted kravene i eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Christiane Pahrmann for teknisk assistance. SS modtaget støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 og SCHR992/4-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
