Summary
Denna video visar två modeller av intima plack utveckling i murina artärer och betonar skillnaderna i myointimal hyperplasi och åderförkalkning.
Abstract
Olika in vivo laboratorie gnagarmodeller för induktion av njurartärstenos har fastställts för att efterlikna sjukdomar som inkluderar arteriell plackbildning och stenos, som observerats i exempelvis ischemisk hjärtsjukdom. Två mycket reproducerbara musmodeller - både resulterar i artärstenosis men varje underliggande en annan väg av utveckling - införs här. Modellerna representerar de två vanligaste orsakerna till njurartärstenos; nämligen en musmodell för varje myointimal hyperplasi, och åderförkalkning visas. För att inducera myointimal hyperplasi, är en ballongkateter skada av bukaorta utförs. För utvecklingen av aterosklerotiska plack, ApoE - / - är musmodell i kombination med västerländsk fet diet som används. Olika modellanpassade alternativ för mätning och utvärdering av resultaten namn och beskrivningen i detta manuskript. Införandet och jämförelse av dessa två modeller ger information för forskare att välja lämplig artärstenosis modell i enlighet med den vetenskapliga fråga som ställs.
Introduction
I industriländerna ischemisk hjärtsjukdom är fortfarande en ledande orsak till dödlighet 1. Orsakerna till kranskärls stenos är många och inkluderar myointimal hyperplasi och åderförkalkning, med revaskularisering kvar den vanligaste behandlingsstrategi 2. Forskningsmodeller som tydligt skiljer mellan de mekanistiska vägar intimal hyperplasi och åderförkalkning är viktigt att undersöka pathobiological och patofysiologiska processer i arteriell plack utveckling. I den här filmen två olika musmodeller för att studera antingen utveckla myointimal hyperplasi eller ateroskleros införs.
Myointimal hyperplasi postuleras att bilda via "svar-på-skada" paradigm som ursprungligen beskrivits för åderförkalkning 3. Den mekaniska störningar av endotelskiktet leder till en intensiv remodeling förstärks av parakrina effekter. Det finns flera different djurmodeller som vanligen används för att studera myointimal hyperplasi. Vissa grupper använder metallanordningar i uppstigande aorta av råttor 4. Aorta denudation modell utfördes med en ballongkateter är också vanligt förekommande i laboratorieråttor 5,6. Den intimahyperplasi modellen utförts på laboratoriemöss 7 implementerar ligation av halspulsådern och inducerar myointimal lesioner 8. I vårt labb, den abdominal aortic denudation modell - att studera utvecklingen av myointimal hyperplasi - samt en humaniserad stent restenos modell 9 är vanliga. Denna video betonar att välja rätt experimentell djurmodell är avgörande för mekanistiska eller patofysiologiska studier av arteriell stenos.
Myointimal hyperplasi modeller måste skiljas från åderförkalkning modeller. För den senare, apolipoprotein E-brist (ApoE - / -) möss i kombination med västerländsk diet vanligen används för att framkalla atherosclerotiska lesioner 10,11,12,13. Exempel på induktion av båda dessa typer av myointimal sjukdom i möss visas här, tillsammans med olika modellanpassade alternativ för att analysera kärl stenos 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete bör utföras i enlighet med tillämpliga riktlinjer djurskötsel. Skaffa institutionellt godkännande för djurarbete före början protokoll.
1. Myointimal förstoring Model (A)
För intimahyperplasi modellen, köp C57BL/6J (Stock nummer 000.664, C57BL/6J) möss vid 8 veckors ålder väger ca 25 gram. Hus möss för dessa experiment under konventionella förhållanden; mata möss standard mus chow och ge vatten efter behag.
- Mus preparatet: Introducera musen till en anestetisk tillstånd med isofluran (2%) med användning av en induktionskammare.
- Ta buken håret med hjälp av en hår trimmer, lägg musen på rygg och täcka sin näsa och mun med ansiktsmasken för att försäkra anestesi.
- Med Provo-Jod, desinficera buken universellt, följt av 80% etanol, i två cykler.
- Att det inte föreav reflexer från klämmande bakbenet för att övervaka tillräcklig anestesidjupet.
- Separera den hud och muskler längs linea alba i två steg för att exponera den abdominala organ.
- Lägg tarmarna i en saltlösning återfuktad handske. Linda handsken runt tarmarna att hålla dem fuktiga.
- Uppmärksamt rensa bort fettvävnad sheeting bukaorta. Exponera infrarenala aorta ner till dess bifurkation, noga med att inte skada någon gren fartyg.
- Först, placera en mikrokirurgisk klämma på den proximala, infrarenala aorta för att stänga av blodflödet. Nu, tillämpa en andra distal klämma bredvid aortabifurkationen.
- Då blodflödet avbryts, gör ett litet snitt in i aorta nära den proximala klämman.
- Sätt i ballongspets kateter, som har fuktat med 0,9% saltlösning, och avancera mot den distala klämman i aorta.
- För endotelial skada, beröva aortan genom att blåsa upp balloon långsamt och försiktigt dra i katetern i riktning mot den proximala klämman.
- Upprepa denudation manövern två gånger.
- Ta bort katetern och stäng aorta snitt använder 10-0 Prolene kör suturer.
- Öppna försiktigt den distala klämman. Vid blödning vid aortotomy plats, stäng klämman igen, lokalisera blödningen och placera ytterligare avbrutna stygn, efter behov.
- Om kan observeras ingen blödning, långsamt öppna proximala klämman.
- En aorta puls ska vara synlig distalt från snittet. Nu tarmarna kan ordnas tillbaka in situ.
- Skölj bukhålan använder förvärmda steril koksaltlösning.
- Stäng bukväggen börjar med muskellagret med hjälp av 6-0 prolene kör suturer.
- Nästa anpassa huden under användning av 5-0 Prolene utför löpande suturer.
- Under den tid som musen är fortfarande bedövades, applicera 4-5 mg / kg Karprofen via en subkutan injeInsatser.
- Lägg Metamizol till dricksvattnet (50 mg Metamizol per 100 ml) för smärtkontroll och fortsätter under 3 dagar efter operation. Övervaka djur under återhämtning.
OBS: Observationstiden för denna modell är 28 dagar.
2. Åderförkalkning Modell (B)
För åderförkalkning modellen, köpa apolipoprotein E-brist (ApoE - / -)-möss (Stock nummer 002.052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) vid en ålder av 4 veckor, och därefter matas i 4-6 månader. Hus möss för dessa experiment under konventionella förhållanden; mata möss höga lipid västerländsk kost vid ankomst (Harlan Laboratories TD.88137) och ger fri tillgång till vatten under en period på 4 till 6 månader.
- Musen preparatet:
- Mata ApoE - / - möss med västerländsk kost med början vid 4 veckors ålder. Dietary manipulation bör inledas direkt vid ankomst.
- Upprätthålla västerländsk diet under hela varaktigheten av experiment. </ Li>
3. Analys
- Myointimal hyperplasi modell (A)
Regionen av intresse i denna modell är "lesionsområdet". Alternativ för analys inkluderar luminala obliteration, I / M-förhållandet (intima / media-kvot), maximal myointima tjocklek, myointimal område, Trichrome färgning för fibros, och H & E-färgning för mononukleära celler (såsom illustreras i fig. 1A-1C). Enligt den vetenskapliga frågan många andra färgningar som Picrosirius röd för kollagen, immunohistokemi, och konfokala metoder kan tillämpas. - Åderförkalkning modell (B)
De regioner av intresse i denna modell är aortaklaffen, aortabågen och den nedåtgående aorta. Alternativ för analys: Sudan röd färgning med avseende på lipider och trikromfläckning av aortaklaffen, aortabågen och nedåtgående aorta (såsom illustreras i figur 1D).
Denna modell ger också en mängd andra färgalternativ somtill exempel olja Red O för neutrala lipider, Picrosirius rött, immunohistokemi och konfokala metoder.- Sudan röd färgning: Utför Sudan röda fläckar på nyskördade aortavävnaden.
- Ta kosten 6h före skörd.
- Introducera musen till en anestetisk tillstånd med isofluran (2%) med användning av en induktionskammare. Försäkra avsaknad av reflexer genom att nypa ihop bakbenet att övervaka tillräckligt anestesidjup.
- Öppna kistan; skära av spetsen av hjärtat och perfundera via den vänstra ventrikeln, först med saltlösning (3 ml), följt av 4% PFA (3 ml) genom aortaroten för att fixera aorta.
- Befria aorta från roten till dess bifurkation. Försök att ta bort fettvävnad så mycket som möjligt.
- Skär av hjärta och aortaroten, och lagra dem i 4% PFA för histologi.
- För histologi aortaroten måste noggrant placeras i paraffin-block i en upprätt position för att tillåta skärning av aortic rot genere diabilder som visar alla tre klaffblad.
- Skär den ena änden av aorta trädet och fixa det på silikonskikt med fina stift. Öppna aorta längdled och fixa aortavävnaden.
- Skölj vävnaden med 50% etanol. Doppa vävnaden med Sudan III färgningslösning under ca 15 min.
- Skölj försiktigt med 50% etanol för att avlägsna överskottet Sudan III. (OBS: 50% etanol kan tvätta färgen bort.) Skölj med dH 2 O, och ta foton för vidare analys.
- Sudan röd färgning: Utför Sudan röda fläckar på nyskördade aortavävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar olika analysalternativ och den inducerade sjukdomstillstånd för båda modellerna. För intimahyperplasi modellen, är en analys av representativa tvärsnitt i trikromfläckning visas. Från dessa tvärsnitt, kan resultat som I / M-förhållanden, maximal placktjocklek, max intimagrovlek i lumen, luminala utplåning i procent, samt plack området mätas och beräknas.
För att utvärdera resultatet av ateroskleros-modell, kan alla metoder som nämns ovan användas. Dessutom den kvantitativa plackområde i bukaorta, omfattningen av plackbildning på aortaklaffen, aortabågen och det nedåtgående aorta kan mätas via trikromfläckning.
Figur 1. Utblottad mus artärer skördas, paraffininbäddade, och ett representativt urval visas i trikromfläckning (A). I / M-talen är beräknade utifrån trikrom färgade snitt genom mätning av intima och media tjocklek med hjälp av datoranalys följt av beräkning av förhållandet (B). Maximal placktjocklek mäts som den maximala intimagrovlek i lumen genom dator morfometri (B). Luminal utplåning (i procent) bestäms genom att subtrahera de nya inre lumen från de tidigare lumen, dividerat med de tidigare lumen, multiplicerat med 100% (C). På skylten Området bedöms genom att subtrahera de nya inre lumen från de tidigare lumen (C). Den nedåtgående aorta, öppnas longitudinellt med lipofila strukturer och färgades med Sudan röd visas (D). För att bestämma den kvantitativa plackområdet, Sudan Red färgade lesioner liksom den totala aortaområdet mäts och analyzed hjälp av bildanalys programvara. Tvärsnitt av paraffininbäddade prover av aortaklaffen, aortabågen och det nedåtgående aorta i trikrom avbildas (E). Luminal utplåning, plack område, och maximal placktjocklek beräknas enligt ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om båda sjukdomar resulterar i liknande symtom hos patienten, den bakomliggande mekanismen av plackutveckling och därför kan behandling tillvägagångssätt är mycket olika 2. I olika former av arteriell stenos de kliniska resultaten i patienterna samt tidsramen för plackutveckling beror på den bakomliggande mekanismen.
Beroende på de kliniska fynden i patienten, måste olika metoder för provanalys utföras 5,15. Det är nödvändigt att anpassa analysen till de karaktäristiska fynden i den sjukdom som håller på att imiteras av den valda modellen 14. Vice versa, beroende på vilken sjukdom som studeras, den mest genomförbara och lämpliga djurmodell bör väljas. Dessutom är det viktigt att nya läkemedel mekanistiskt ska matcha modellen.
Båda modellerna introduceras i denna publikation är snabbt och enkelt att utföra och mycket reproducerbar. Det finns några maJor skillnaderna mellan modellerna. Till exempel är observationstiden i myointimal hyperplasi modellen 28 dagar 16, medan aterosklerotiska plack utvecklingsbehov fyra till sex månader 17.
En annan stor skillnad är det tillämplighet på olika musstammar. Den åderförkalkning Modellen bygger på ApoE - / - eller LDL - / - möss och kan därför endast utföras på möss som bär denna specifika knockout. För att skapa möss som bär både ApoE - / - och en annan önskad knockout är mycket tidskrävande. Den myointimal hyperplasi framkallande ballongskada operation kan utföras i någon mus. De myointimal hyperplasi modellen ger fler potentiella ändra musen stam av intresse, medan den aterosklerotiska modellen står inför en strikt begränsning till möss som bär ApoE - / -.
Intensiteten i ballong denudation är avgörande för resultatet av de myointimal hyperplasi lesioner. Om kateterskada utförs för aggressively kan aneurysmbildning uppstå; Om denudation utförs alltför försiktigt, kanske plackutveckling vara för svag för att se skillnader mellan grupper. I detta förfarande är det bra om alla operationer inom en studie utförs av samma person. Fördelen med ballongskada mot andra tekniker som kräver införande av stela eller vassa hinder som sladdar, är flexibiliteten och möjligheten att justera storleken och trycket på ballongen via inflation i ballongspets kateter. Vidare är ouppblåst ballongspets katetern är tunn och kan införas in i aorta via ett relativt litet snitt jämfört med tjockare, styvare denudation verktyg. För den aterosklerotiska plack modell det kan vara avgörande för att börja mata den västra dieten vid ung ålder av mössen, eftersom det kan ha en stor inverkan på hur allvarliga skadorna. Eftersom skadorna i de båda introducerade modellerna utvecklas i både kvinnliga och manliga möss, kan köns vara ADAPTEd till kraven i experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Christiane Pahrmann för tekniskt stöd. SS erhållit finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 och SCHR992/4-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
