Summary
Este vídeo mostra dois modelos de desenvolvimento íntima placas nas artérias murino e enfatiza as diferenças de hiperplasia miointimal e aterosclerose.
Abstract
Vários modelos in vivo de roedores de laboratório para a indução de estenose da artéria foram estabelecidas para imitar as doenças que incluem a formação de placa arterial e estenose, como se observa, por exemplo, na doença cardíaca isquémica. Dois modelos do rato altamente reprodutíveis - ambos, resultando em estenose da artéria mas cada subjacentes um caminho diferente de desenvolvimento - são introduzidos aqui. Os modelos representam as duas causas mais comuns de estenose da artéria; ou seja, um modelo de mouse para cada hiperplasia miointimal e aterosclerose são mostrados. Para induzir hiperplasia miointimal, uma lesão por cateter balão da aorta abdominal é realizada. Para o desenvolvimento da placa aterosclerótica, a ApoE - / - modelo do rato, em combinação com dieta gordurosa ocidental é usado. Diferentes opções de adaptação do modelo para a medição e avaliação dos resultados são nomeados e descritos neste manuscrito. A introdução ea comparação destes dois modelos fornece informatíon para os cientistas a escolher o modelo de estenose da artéria apropriada de acordo com a questão científica perguntou.
Introduction
Em nações industrializadas doença isquêmica do coração continua a ser uma das principais causas de mortalidade 1. As causas para a estenose da artéria coronária são múltiplas e incluem hiperplasia miointimal bem como aterosclerose, com revascularização restante da estratégia de tratamento mais comum 2. Modelos de pesquisa que distinguem claramente entre os caminhos mecanicistas da hiperplasia da íntima e aterosclerose são essenciais para investigar o patobiológico e processos fisiopatológicos no desenvolvimento da placa arterial. Neste vídeo de dois diferentes modelos de ratinho utilizada para estudar o desenvolvimento quer de hiperplasia miointimal ou aterosclerose são introduzidos.
Hiperplasia miointimais é postulada para formar através do paradigma "resposta-a-lesão", originalmente descrito para a aterosclerose 3. A ruptura mecânica da camada endotelial leva a uma remodelação intensa reforçada por efeitos parácrinos. Existem vários dimodelos animais fferent comummente usados para estudar a hiperplasia miointimal. Alguns grupos de utilizar dispositivos de metal na aorta ascendente de 4 ratos. O modelo desnudamento aórtica realizada com um cateter de balão também é comumente usado em ratos de laboratório 5,6. O modelo de hiperplasia da íntima realizada em ratos de laboratório 7 implementa ligadura da artéria carótida e induz lesões miointimais 8. No nosso laboratório, o modelo de desnudação da aorta abdominal - para estudar o desenvolvimento de hiperplasia miointimal -, bem como um modelo humanizado stent 9 são vulgarmente utilizados. Este vídeo enfatiza que a escolha do modelo animal experimental adequado é crucial para estudos sobre os mecanismos fisiopatológicos ou de estenose arterial.
Modelos hiperplasia miointimais deve ser diferenciado de modelos aterosclerose. Para este último, a apolipoproteína E-deficiente (ApoE - / -) ratos em combinação com uma dieta ocidental são comumente usados para induzir atheroscllesões eróticos 10,11,12,13. Exemplos para a indução de ambos os tipos de doença miointimal em ratinhos são mostradas aqui, juntamente com diferentes opções de adaptação ao modelo para analisar estenose do vaso 14.
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Protocol
Todo o trabalho animal deve ser realizada de acordo com as orientações de cuidados de animais relevantes. Obter a aprovação institucional para o trabalho de animais antes do início do protocolo.
1. Miointimais Hiperplasia Modelo (A)
Para o modelo de hiperplasia da íntima, comprar C57BL/6J (da série 000.664, C57BL/6J) ratos com a idade de 8 semanas, pesando aproximadamente 25 g. Os ratos domésticos para estas experiências sob condições convencionais; alimentar de comida mouse padrão camundongos e fornecer água ad libitum.
- Rato preparação: Introduzir o mouse para um estado anestésico com isoflurano (2%), utilizando uma câmara de indução.
- Remova o cabelo abdominal usando um aparador de pêlos, coloque o rato em suas costas e cobrir o nariz ea boca com a máscara para garantir a anestesia.
- Com Provo-iodo, desinfectar a zona abdominal universalmente, seguido de etanol a 80%, em dois ciclos.
- Assegurar a ausênciade reflexos por beliscar o membro posterior para monitorizar a profundidade da anestesia suficiente.
- Separe a pele e músculo ao longo da linha alba em duas etapas para expor os órgãos abdominais.
- Coloque os intestinos em uma luva salina hidratada. Enrole a luva em torno dos intestinos para mantê-los úmidos.
- Atentamente limpar o tecido adiposo sheeting da aorta abdominal. Expor a aorta infra-renal até a sua bifurcação, tomando cuidado para não ferir quaisquer embarcações filiais.
- Primeiro, coloque uma braçadeira microcirúrgica no proximal, aorta infra-renal para desligar o fluxo de sangue. Agora, aplique uma segunda pinça distal próximo à bifurcação da aorta.
- Quando o fluxo de sangue é interrompido, fazer uma pequena incisão na aorta perto da braçadeira proximal.
- Inserção do cateter de balão, que foi hidratada com soro fisiológico 0,9%, e avançar para o grampo distal da aorta.
- Por lesão endotelial, desnudar a aorta por inflar o balloon cuidadosamente e lentamente deixando o cateter na direcção da pinça proximal.
- Repetir a manobra desnudação duas vezes.
- Remover o cateter e fechar a incisão aórtica com prolene 10-0 suturas em execução.
- Abra cuidadosamente o grampo distal. Em caso de sangramento no local da aortotomia, feche a braçadeira de novo, localizar o sangramento e colocar pontos interrompidos adicionais, conforme necessário.
- Se nenhum sangramento pode ser observado, abrir lentamente a braçadeira proximal.
- Um impulso da aorta deve ser visível distalmente a partir da incisão. Agora, os intestinos podem ser dispostas volta in situ.
- Lavar a cavidade abdominal, utilizando solução salina estéril pré-aquecido.
- Feche a parede abdominal começando com a camada muscular usando 6-0 prolene em execução.
- Próxima adaptar a pele sob o uso de 5-0 prolene realizar suturas em execução.
- Durante o tempo que o rato continua a ser anestesiado, aplicam-se 4-5 mg / kg através de uma inje Carprofeno subcutâneacção.
- Adicionar Metamizol à água potável (50 mg por 100 ml Metamizol) para o controle da dor e continuar para a cirurgia de 3 dias após. Monitorar animal ao longo da recuperação.
Nota: O período de observação para este modelo é de 28 dias.
2. Modelo de Aterosclerose (B)
Para o modelo de aterosclerose, comprar (ApoE - / -) E-deficiente apolipoproteína camundongos (Bolsa de número 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) em uma idade de 4 semanas, e depois alimentados por 4-6 meses. Os ratos domésticos para estas experiências sob condições convencionais; alimentar ratos dieta ocidental elevado teor de lípidos na chegada (Harlan Laboratories TD.88137) e fornecer água ad libitum durante um período de 4 a 6 meses.
- Rato preparação:
- Alimente o ApoE - / - ratos com dieta ocidental a partir das 4 semanas de idade. Manipulação dietética deve começar diretamente à chegada.
- Manter dieta ocidental ao longo tempo de experiência. </ Li>
3. Análise
- Modelo de hiperplasia miointimal (A)
A região de interesse neste modelo é a "área da lesão." Opções para análise incluem a obliteração luminal, rácio E / M (razão íntima / média), espessura myointima máxima, área miointimal, coloração Trichrome para fibrose, e H & E para a coloração de células mononucleares (tal como ilustrado nas Figuras 1A-1C). De acordo com a questão científica inúmeras outras colorações, como Picrosirius vermelho para colágeno, imunohistoquímica e métodos confocal pode ser aplicada. - Modelo de Aterosclerose (B)
As regiões de interesse no modelo são a válvula aórtica, do arco aórtico, bem como a aorta descendente. Opções para análise: coloração vermelho Sudão para lipídios e tricrômico de coloração da valva aórtica, arco aórtico e aorta descendente (como ilustrado na Figura 1E).
Este modelo também produz uma variedade de outras opções, como coloraçãopor exemplo Oil Red O para lipídios neutros, Picrosirius red, imunohistoquímica e métodos confocal.- Coloração vermelho Sudão: Realizar a coloração vermelha Sudão em tecido aórtico recém-colhida.
- Retire a dieta 6h antes da colheita.
- Introduzir o rato a um estado anestésico com isoflurano (2%) utilizando uma câmara de indução. Assegurar a ausência de reflexos por aperto do membro posterior para monitorizar a profundidade da anestesia suficiente.
- Abra o peito; cortar o vértice do coração e perfundir através do ventrículo esquerdo, primeiro com solução salina (3 mL), seguido por 4% de PFA (3 ml) através da raiz da aorta, para fixar a aorta.
- Livre a aorta da raiz até a sua bifurcação. Tentar remover o tecido adiposo, tanto quanto possível.
- Corte o coração e da raiz da aorta, e armazená-los em PFA 4% para histologia.
- Para a histologia da raiz da aorta tem de ser cuidadosamente colocado no bloco de parafina numa posição vertical para permitir que o corte da aortic lâminas geradoras de raiz que exibem todos os 3 folhetos valvares.
- Cortar uma extremidade da árvore da aorta e corrigi-lo para a camada de silicone com pinos finos. Abra a aorta longitudinalmente e fixar o tecido aórtico.
- Lavar o tecido com 50% de etanol. Mergulhe o tecido com solução corante Sudan III por cerca de 15 min.
- Lavar cuidadosamente com etanol a 50% para remover o excesso de Sudan III. (Nota: 50% de etanol pode lavar o corante de distância.) Lavar com dH 2 O, e tirar fotos para análise posterior.
- Coloração vermelho Sudão: Realizar a coloração vermelha Sudão em tecido aórtico recém-colhida.
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Representative Results
A Figura 1 mostra diferentes opções de análise e o estado da doença induzida por ambos os modelos. Para o modelo de hiperplasia da íntima, a análise de secções representativas em tricromo é mostrado. A partir destas secções transversais, como resultado índices I / M, a espessura máxima da placa, da espessura máxima da íntima no lúmen, obliteração luminal em por cento, bem como a área da placa pode ser medido e calculado.
Para avaliar os resultados do modelo de aterosclerose, todos os métodos acima referidos pode ser utilizado. Além disso, a área da placa quantitativa na aorta abdominal, a extensão da formação de placa na válvula aórtica, o arco aórtico e da aorta descendente pode ser medida através de tricromo.
Figura 1. Aortas desnudados mouse são colhidas, incluído em parafina, e uma amostra representativa é mostrado na coloração tricrômico (A). Rácios de I / M são calculados sobre tricrômicos cortes corados medindo íntima ea espessura da mídia por meio de análise de computador seguido de cálculo da relação (B). A espessura máxima da placa é medida como a espessura máxima da íntima no lúmen por morfometria computador (B). Obliteração luminal (em percentagem) é determinado subtraindo-se as novas lúmen interno das ex-lúmen, divididos pelos ex-lúmen, multiplicado por 100% (C). A área da placa é avaliada subtraindo os novos lúmen interno das ex-lúmen (C). A aorta descendente, aberta longitudinalmente com estruturas lipofílicos e coradas com vermelho do Sudão é mostrado (D). Para determinar a área da placa quantitativa, Sudão lesões manchado de vermelho, bem como a área total da aorta, são medidos e anázed usando o software de análise de imagem. Secções transversais de amostras de parafina embutidos da valva aórtica, o arco aórtico e aorta descendente em tricrômico são retratados (E). Obliteração luminal, área da placa, e espessura máxima de placa são calculados como descrito acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora ambas as doenças resultam em sintomas semelhantes no paciente, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da placa e, portanto, as abordagens de tratamento são muito diferentes 2. Em diferentes formas de estenose arterial os achados clínicos nos pacientes, bem como o cronograma de desenvolvimento da placa depende do mecanismo subjacente.
Dependendo do quadro clínico do paciente, diferentes métodos de análise da amostra devem ser realizadas 5,15. É necessária a adaptação da análise para os resultados característicos da doença que está a ser imitada por o modelo escolhido 14. Vice-versa, dependendo da doença a ser estudado, o modelo animal mais viável e adequado deve ser seleccionado. Além disso, é fundamental que os novos medicamentos deve corresponder mecanicamente o modelo.
Ambos os modelos apresentados nesta publicação são rápidos e fáceis de executar e altamente reprodutível. Há alguns major diferenças entre os modelos. Por exemplo, o tempo de observação, no modelo de hiperplasia miointimal é de 28 dias de 16, enquanto que o desenvolvimento da placa aterosclerótica precisa quatro a seis meses 17.
Outra grande diferença é a aplicabilidade de diferentes linhagens de camundongos. O modelo de aterosclerose depende da ApoE - / - ou LDL - / - em ratos e pode, portanto, só pode ser realizado em ratos portadores desta nocaute específico. Para criar camundongos portadores tanto da ApoE - / - e outro nocaute desejado é muito demorado. A hiperplasia miointimal induzir balão cirurgia lesão pode ser realizada em qualquer rato. Os miointimais rendimentos mais potencial para modificar a tensão do rato de interesse, enquanto o modelo aterosclerótica enfrenta uma limitação estrita de camundongos portadores do ApoE modelo hiperplasia - / -.
A intensidade da desnudação balão é crucial para o resultado das lesões de hiperplasia miointimais. Se a lesão por cateter é realizada demasiado aggressively, formação de aneurisma pode ocorrer; se a desnudação é realizada muito suavemente, o desenvolvimento da placa pode ser muito fraco para ver as diferenças entre grupos. Neste processo é útil, se todas as operações dentro de um estudo são realizados pela mesma pessoa. A vantagem da lesão por balão em relação a outras técnicas que requerem a introdução de obstáculos rígidos ou cortantes, como fios, é a flexibilidade, bem como a possibilidade de ajustar o tamanho e pressão do balão através da insuflação do cateter de balão. Além disso, o cateter de balão é esvaziada fina e pode ser inserida na aorta através de uma incisão relativamente pequena em comparação com as ferramentas mais espessas, mais rígidas desnudação. Para o modelo de formação de placa aterosclerótica pode ser crucial para iniciar a alimentação com a dieta ocidental em tenra idade dos ratos, porque isso pode ter um grande impacto sobre a gravidade das lesões. Desde lesões em ambos os modelos introduzidos desenvolver em ambos os ratos fêmeas e machos, o sexo pode ser adapted para as necessidades da experiência.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Christiane Pahrmann para assistência técnica. SS recebeu financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 e SCHR992/4-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
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