Summary
Questo video mostra due modelli di intimale sviluppo placca nelle arterie murini e sottolinea le differenze di iperplasia miointimale e aterosclerosi.
Abstract
Vari vivo modelli di roditori di laboratorio in per l'induzione di stenosi sono state stabilite per simulare malattie che comprendono la formazione di placca arteriosa e stenosi, come osservato ad esempio cardiopatia ischemica. Due modelli del mouse altamente riproducibili - sia conseguente stenosi ma ognuno alla base di un diverso percorso di sviluppo - vengono introdotti qui. I modelli rappresentano le due più comuni cause di stenosi dell'arteria; cioè sono mostrati uno per ogni modello di topo iperplasia miointimale e aterosclerosi. Causare iperplasia miointimale, viene eseguita una lesione catetere a palloncino dell'aorta addominale. Per lo sviluppo della placca aterosclerotica, l'ApoE - è utilizzata modello del mouse in combinazione con dieta grassa occidentale - /. Diverse opzioni di modelli adattati per la misurazione e la valutazione dei risultati sono nominati e descritti in questo manoscritto. L'introduzione e il confronto di questi due modelli fornisce information per gli scienziati di scegliere il modello di stenosi dell'arteria adeguato in conformità alla questione scientifica posta.
Introduction
Nei paesi industrializzati la cardiopatia ischemica rimane una delle principali cause di mortalità ad 1. Le cause di stenosi dell'arteria coronaria sono molteplici e includono iperplasia miointimale così come aterosclerosi, con rivascolarizzazione rimanendo la strategia di trattamento più comune 2. Modelli di ricerca che distinguono chiaramente tra le vie meccanicistiche di iperplasia intimale e aterosclerosi sono essenziali per indagare il patobiologico e processi fisiopatologici in arterioso sviluppo della placca. In questo video vengono introdotti due modelli murini diversi utilizzati per studiare sia lo sviluppo di iperplasia miointimale o aterosclerosi.
Iperplasia miointimale è postulata per formare tramite il paradigma "risposta a lesioni", originariamente descritta per l'aterosclerosi 3. La distruzione meccanica dello strato endoteliale porta ad un rimodellamento intenso arricchito da effetti paracrini. Ci sono diversi dimodelli animali fferent comunemente utilizzati per studiare iperplasia miointimale. Alcuni gruppi usano dispositivi metallici in aorta ascendente di ratti 4. Il modello denudazione aortica eseguita con un catetere a palloncino viene anche comunemente usato nei ratti di laboratorio 5,6. Il modello di iperplasia intimale eseguita nei topi di laboratorio 7 implementa legatura della carotide e induce lesioni miointimale 8. Nel nostro laboratorio, il modello denudamento aortico addominale - per studiare lo sviluppo di iperplasia miointimale - così come un modello umanizzato stent restenosi 9 sono comunemente usati. Questo video sottolinea che la scelta del corretto modello sperimentale animale è di fondamentale importanza per gli studi meccanicistici o fisiopatologiche di stenosi arteriosa.
Modelli iperplasia miointimale devono essere distinti dai modelli aterosclerosi. Per questi ultimi, apolipoproteina E-deficienti (ApoE - / -) topi in combinazione con dieta occidentale sono comunemente usati per indurre atheroscllesioni erotici 10,11,12,13. Esempi per l'induzione di entrambi questi tipi di malattie miointimale in topi sono mostrati qui, insieme con differenti opzioni del modello adattato per analizzare stenosi 14.
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Protocol
Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata secondo le pertinenti linee guida per la cura degli animali. Ottenere l'approvazione istituzionale per il lavoro animale prima dell'inizio del protocollo.
1. Miointimale Iperplasia Model (A)
Per il modello iperplasia intimale, acquistare C57BL/6J (numero Archivio 000.664, C57BL/6J) topi all'età di otto settimane del peso di circa 25 g. Topi Casa in questi esperimenti in condizioni convenzionali; nutrire topi chow mouse standard e fornire acqua ad libitum.
- Preparazione Mouse: Introdurre il mouse per uno stato anestetico con isoflurano (2%) utilizzando una camera di induzione.
- Rimuovere i capelli addominale utilizzando un trimmer capelli, gettare il mouse sulla sua schiena e coprire il naso e la bocca con la maschera facciale per assicurare la anestesia.
- Con Provo-Iodio, disinfettare la zona addominale universalmente, seguito dal 80% di etanolo, in due cicli.
- Garantire l'assenzadei riflessi pizzicando dell'arto posteriore per controllare la profondità sufficiente dell'anestesia.
- Separare la pelle ei muscoli lungo la linea alba in due fasi per esporre gli organi addominali.
- Posare l'intestino in un guanto salina idratata. Avvolgere il guanto intorno l'intestino per mantenerli umidi.
- Attentamente sgombrare il tessuto adiposo pezzo per pezzo l'aorta addominale. Esporre l'aorta sottorenale fino alla sua biforcazione, facendo attenzione a non danneggiare alcuna navi filiali.
- Innanzitutto, collocare un morsetto microchirurgico sul prossimale, sottorenale per arrestare il flusso di sangue. Ora, applicare un secondo morsetto distale vicino alla biforcazione aortica.
- Quando il flusso di sangue viene interrotto, fare una piccola incisione nell'aorta vicino al morsetto prossimale.
- Inserire il catetere a palloncino con punta, che è stata idratata con 0,9% di soluzione salina, e avanzare verso il morsetto distale dell'aorta.
- Per il danno endoteliale, denudare l'aorta gonfiando il Balloon lentamente e tirando il catetere nella direzione del morsetto prossimale.
- Ripetere la manovra denudazione due volte.
- Rimuovere il catetere e chiudere l'incisione aortica utilizzando 10-0 prolene suture in esecuzione.
- Aprire con cautela il morsetto distale. In caso di sanguinamento nel sito aortotomy, chiudere il morsetto di nuovo, individuare l'emorragia e mettere ulteriori punti interrotti, se necessario.
- Se nessun sanguinamento può essere osservato, aprire lentamente il morsetto prossimale.
- Un impulso aortico deve essere visibile distalmente dall'incisione. Ora gli intestini possono essere organizzati indietro in situ.
- Sciacquare la cavità addominale utilizzando soluzione fisiologica sterile pre-riscaldato.
- Chiudere la parete addominale che inizia con lo strato muscolare con 6-0 punti di sutura prolene esecuzione.
- Accanto adeguare la pelle sotto l'uso di 5-0 prolene eseguire suture in esecuzione.
- Durante il tempo il mouse è ancora anestetizzato, applicare 4-5 mg / kg Carprofene tramite un inje sottocutaneaction.
- Aggiungi Metamizol l'acqua potabile (50 mg Metamizol per 100 ml) per il controllo del dolore e proseguire per tre giorni dopo l'intervento chirurgico. Controllo degli animali durante il ricovero.
Nota: Il periodo di osservazione per questo modello è di 28 giorni.
2. Aterosclerosi Model (B)
Per il modello aterosclerosi, l'acquisto di apolipoproteina E-deficienti (ApoE - / -) topo (numero Archivio 002.052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) ad un'età di 4 settimane, e poi alimentato per 4-6 mesi. Topi Casa in questi esperimenti in condizioni convenzionali; nutrire topi dieta ad alto contenuto di lipidi occidentale all'arrivo (Harlan Laboratories TD.88137) e fornire acqua ad libitum per una durata di 4-6 mesi.
- Preparazione Mouse:
- Feed the ApoE - / - topi con dieta occidentale con inizio alle 4 settimane di età. Manipolazione alimentare deve iniziare direttamente all'arrivo.
- Mantenere la dieta occidentale per tutta la durata dell'esperimento. </ Li>
3. Analisi
- Modello iperplasia miointimale (A)
La regione di interesse in questo modello è la "zona lesione". Opzioni per analisi comprendono obliterazione del lume, rapporto I / M (rapporto intima / media), spessore myointima massimo, zona miointimale, Colorazione tricromica di fibrosi e colorazione H & E per cellule mononucleari (come illustrato nelle Figure 1A-1C). Secondo la domanda scientifica numerose altre colorazioni come Picrosirius rosso per il collagene, immunoistochimica e metodi confocale possono essere applicati. - Modello di aterosclerosi (B)
Le regioni di interesse in questo modello sono la valvola aortica, arco aortico e l'aorta discendente. Opzioni per l'analisi: il Sudan colorazione rosso per i lipidi e la colorazione tricromica di valvola aortica, arco aortico e aorta discendente (come illustrato in Fig. 1D).
Questo modello produce anche una varietà di altre opzioni come colorazioneper esempio Oil Red O di lipidi neutri, Picrosirius rosso, immunoistochimica e metodi confocale.- Sudan colorazione rosso: Eseguire la colorazione rossa Sudan sul tessuto aortico appena raccolte.
- Rimuovere la 6h dieta prima della raccolta.
- Introdurre il mouse per uno stato anestetico con isoflurano (2%) utilizzando una camera di induzione. Garantire l'assenza di riflessi pizzicando dell'arto posteriore per controllare la profondità sufficiente dell'anestesia.
- Aprite la cassa; tagliare la punta del cuore e perfusione attraverso il ventricolo sinistro, prima con soluzione salina (3 ml), seguito da 4% PFA (3 ml) attraverso la radice aortica per fissare l'aorta.
- Liberare l'aorta dalla radice alla sua biforcazione. Prova per rimuovere il tessuto adiposo, per quanto possibile.
- Tagliare il cuore e la radice aortica, e memorizzarli nel 4% PFA per istologia.
- Per l'istologia della radice aortica deve essere attentamente collocato nel blocco di paraffina in posizione verticale per permettere il taglio della aortic diapositive di generazione radice che mostrano tutte e 3 lembi valvolari.
- Tagliare un'estremità dell'albero aortica e fissarlo sullo strato di silicone con perni sottili. Aprire l'aorta longitudinalmente e fissare il tessuto aortico.
- Lavare il tessuto con il 50% di etanolo. Immergere il tessuto con la soluzione colorante Sudan III per circa 15 min.
- Risciacquare leggermente con il 50% di etanolo per rimuovere l'eccesso Sudan III. (Nota: il 50% di etanolo può lavare via il colorante.) Sciacquare con dH 2 O, e scattare foto per ulteriori analisi.
- Sudan colorazione rosso: Eseguire la colorazione rossa Sudan sul tessuto aortico appena raccolte.
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Representative Results
La figura 1 mostra diverse opzioni di analisi e lo stato di malattia indotta per entrambi i modelli. Per il modello iperplasia intimale, viene mostrata l'analisi di sezioni rappresentative trasversali in colorazione tricromica. Da queste sezioni trasversali, risultati come rapporti I / M, spessore massimo placca, spessore intimale massimo nel lume, obliterazione del lume in percentuale, così come l'area della placca possono essere misurate e calcolate.
Per valutare i risultati del modello aterosclerosi, possono essere utilizzati tutti i metodi sopra indicati. Inoltre, l'area della placca quantitativa nell'aorta addominale, il grado di formazione di placca alla valvola aortica, l'arco aortico e l'aorta discendente può essere misurata tramite colorazione tricromica.
Figura 1. Aorte del mouse denudato vengono raccolte, paraffina, e uno spaccato rappresentativo è riportato nella colorazione tricromica (A). Rapporti I / M sono calcolate sulla tricromica sezioni colorate misurando intima e spessore multimediale utilizzando l'analisi del computer seguito dal calcolo del rapporto (B). Spessore massimo placca viene misurato lo spessore massimo intimale nel lume da morfometria computer (B). Obliterazione Luminal (in percentuale) è determinata sottraendo i nuovi lume interno degli ex lume, divisi dagli ex lume, moltiplicato per 100% (C). L'area della placca è valutata sottraendo i nuovi lume centrale dalla precedente lumen (C). L'aorta discendente, aperto longitudinalmente con le strutture lipofile e colorato con il colorante Sudan rosso è mostrato (D). Per determinare l'area della placca quantitativa, Sudan lesioni rosso macchiate così come l'area aortica totale, vengono misurate e analisized utilizzando il software di analisi di immagine. Sezioni trasversali di paraffina campioni incorporati della valvola aortica, l'arco aortico e l'aorta discendente in tricromica sono raffigurati (E). Obliterazione Luminal, area della placca e spessore massimo di placca sono calcolati come sopra descritto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene entrambe le malattie provocano sintomi simili nel paziente, i meccanismi alla base dello sviluppo della placca e quindi i metodi di trattamento sono molto diversi 2. In diverse forme di stenosi arteriosa risultati clinici nei pazienti nonché i tempi di sviluppo placca dipendono dal meccanismo sottostante.
A seconda dei risultati clinici nel paziente, diversi metodi di analisi dei campioni devono essere eseguite 5,15. È necessario adattare l'analisi ai rilievi caratteristici della malattia che viene imitato alla scelta del modello 14. Viceversa, a seconda della malattia in fase di studio, il modello animale più fattibile e deve essere scelto. Inoltre, è fondamentale che i nuovi farmaci dovrebbero meccanicamente corrispondere al modello.
Entrambi i modelli presentati in questa pubblicazione sono facili e veloci da eseguire e altamente riproducibile. Ci sono alcuni madifferenze jor tra i modelli. Ad esempio, il tempo di osservazione nel modello iperplasia miointimale è di 28 giorni 16, mentre lo sviluppo della placca aterosclerotica bisogno quattro a sei mesi 17.
Un'altra grande differenza è l'applicabilità a diversi ceppi di topi. Il modello aterosclerosi basa sulla ApoE - / - o LDL - / - in topi e può pertanto essere eseguita solo in topi portatori questa knockout specifico. Per creare topi portatori sia il ApoE - / - e un altro ko desiderato è molto tempo. L'iperplasia miointimale indurre lesioni chirurgia palloncino può essere eseguita in qualsiasi mouse. I miointimale rendimenti modello iperplasia più potenziali per modificare il ceppo murino di interesse, mentre il modello aterosclerotica affronta una rigorosa limitazione ai topi che portano il ApoE - / -.
L'intensità del palloncino denudamento è cruciale per l'esito delle lesioni iperplasia miointimale. Se la lesione catetere viene eseguita troppo aggressively, potrebbe verificarsi formazione di aneurismi; se la denudazione viene eseguita troppo gentilmente, lo sviluppo della placca potrebbe essere troppo debole per vedere le differenze tra i gruppi. In questa procedura è utile se tutti gli interventi chirurgici all'interno di uno studio vengono eseguite dalla stessa persona. Il vantaggio del balloon injury verso altre tecniche che richiedono l'introduzione di ostacoli rigidi o appuntiti come fili, è la flessibilità e la possibilità di regolare la dimensione e la pressione del palloncino attraverso il gonfiaggio del catetere a palloncino con punta. Inoltre, il catetere a palloncino con punta uninflated è sottile e può essere inserito in aorta attraverso una relativamente piccola incisione rispetto spesse e strumenti denudazione più rigidi. Per il modello di formazione della placca aterosclerotica può essere cruciale per attivare l'alimentazione dieta occidentale in giovane età dei topi perché che può avere un forte impatto sulla gravità delle lesioni. Dal momento che le lesioni in entrambi i modelli introdotti sviluppano nei topi maschi e femmine, il sesso può essere adapted alle esigenze dell'esperimento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christiane Pahrmann per l'assistenza tecnica. SS ha ricevuto finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 e SCHR992/4-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
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