Summary
一种协议，用于定量，高通量表达筛选，从小规模的大肠杆菌文化融合蛋白的纯化分析说明，并应用到的二硫键丰富的动物毒液蛋白靶点的表达。
Abstract
大肠杆菌（E.coli）是用于生产重组蛋白质的结构和功能研究最广泛使用的表达系统。然而，纯化的蛋白质有时是具有挑战性的，因为许多蛋白质被表达的不溶性形式。当有困难或多个目标的工作。因此，建议使用高通量（HTP）在一个小规模的蛋白表达筛选（1-4毫升培养），以快速识别的可溶性表达条件。为配合实验室的各种结构基因组学计划，定量（范围为0.1〜100 mg / L的重组蛋白的文化内）和HTP蛋白表达筛查方案实施和验证上千种蛋白质。该协议是自动的使用液体处理机器人的，但也可以不用专门的设备手动执行。
二硫键丰富的蛇毒蛋白的获得日益认识到他们的潜力作为治疗药物的线索。他们可以是非常有力和有选择性，但其复杂的二硫键的网络使他们具有挑战性的生产。由于欧盟FP7项目Venomics（成员www.venomics.eu ），我们的挑战是开发成功的生产策略与生产成千上万的小说蛇毒蛋白质功能特性的目的。通过二硫键异构酶的及DsbC氧化还原性能的帮助下，我们调整了我们生产的HTP管线被氧化，功能毒液肽在大肠杆菌中的表达大肠杆菌细胞质中。该协议也适用于生产多种二硫化物丰富的蛋白质。在这里，我们展示了我们的管道用于生产动物毒液蛋白质。与本文所描述的方案很可能是可溶的二硫键丰富的蛋白质会在短至一周来获得。即使从一个小规模的，还有就是用个潜在的Ë纯化蛋白质通过质谱确认的氧化状态，为表征的试点研究，或敏感微观分析。
Introduction
通过基因组学的进步和发现新蛋白质的速度加快推动下，高吞吐量的管道已发展到并行的筛选和鉴定的最佳蛋白生产策略传统方法。潜在变量来进行优化，包括但不限于，不同的表达菌株1,2，3,4的温度，介质2,3，目标变体5，融合伴侣6-13，共表达与蛋白伴侣14,15，细胞质或周质表达16-18，纯化缓冲部件3。通过实现高的吞吐量的方法，许多变量，或者可以在用效率的一个高层次的并行测试多个目标，同时限制批与批之间的变化。根据我们的经验，该战略还给出了在规模化，重复性好使用相同的文化（温度，介质，通风等）和纯化条件（相同的住宅建设N，缓冲器等）。一些高通量平台已被用于在过去十年中，以确定条件为可溶性蛋白表达，即通过改变参数，诸如融合伴侣，表达株或温度19-23。
我们最近使用我们的高通量筛选方法对可溶性二硫化物富含蛋白11的表达。所选择的蛋白质不仅从有毒的来源，而且还包括从各种物种，包括植物，猪，牛和人的二硫化物富酶抑制剂。本实验比较了12个不同的融合配偶体和对28二硫键网状蛋白的溶解度和折叠三种不同的表达菌株的影响。我们证明，使用及DsbC作为生产的菌株BL21融合伙伴（DE3）pLysS中大大outproduced（中获得的水溶性蛋白质的产量和数量）应变和融合的任何其他组合测试11。该该实验的结果所形成的基础为适应我们原来一般高通量管道（其已被用于范围广泛的蛋白质的表达筛选）22,24成一个更适合的二硫键富含目标的表达。从动物毒液二硫键丰富的蛋白质是特别感兴趣的。毒液是生物活性肽和蛋白质的复杂混合物，具有潜在价值的药理学和治疗学。然而，含二硫键蛋白的表达是不平凡的。这些蛋白六时五十九二硫键之间通常含有，并且必须以激活与正确的二硫键键合模式被氧化。目前，该平台被用于筛选大量二硫键丰富的动物毒液蛋白的表达作为欧盟第七框架计划的欧洲VENOMICS项目（www.venomics.eu）的一部分和基准新颖的协议为数千个目标的高通量表达。这里，一个自动化的方法提供了一种用于高通量小规模的表达筛选和纯化（参见图1）施加到二硫化物富含动物毒液蛋白。战略二硫化物丰富的肽和蛋白质利用His-标签纯化和氧化还原活性的融合伴侣，及DsbC，创造裂解HIS-及DsbC融合物与靶蛋白（参见图2）。
而该协议的重点是这里使用的自动化液体处理机器人和HTP电泳，这些方法也适用于高吞吐量的手工做法，这意味着即使有基本的设置实验室可以利用协议的优势没有任何先决条件昂贵的设备。为转换到纯化和分析（不特定二硫化物富含蛋白质）手动协议已经在别处24出版并在此将不再重复。吞吐量的手动过程（从表达克隆，通过重组速率产生国家克隆25，以可溶性蛋白水平的分析）为96（用SDS-PAGE检测）或384（4×96;用点印迹和SDS-PAGE 26）每星期培养物（参见图1）。这可以如（使用液体处理机械臂和斑点印迹26或HTP电泳，如用卡尺GXII芯片实验室系统22中的半自动化的方式执行增加 为结果），以高达1152（12×96）培养物在平行超过一周，如本文中所述的分析。培养是在深井24（DW24）格式进行的，这样经常晃动孵化器可以在对比生长在深井96（DW96）格式，这需要使用的短轨道高速晃动孵化器有足够的通风（晃动培养使用在800rpm）。使用自动感应介质27还简化表达，消除了手工归纳步骤。即使在实验室已经在使用预定义的表达和纯化fication条件，这些都可以直接传送到该HTP系统仅仅是为了提高效率。高通量筛选管道为二硫化物富含蛋白质的详细的原理图在图3中提供。在管道中的参数的基础上广泛筛选实验11，22，这使我们能够选择用于蛋白质生产的最有用的条件下被选定。
特性可以直接从在试验性研究，其中几十样品微克的就足够了，或者对于敏感功能测定及结合测定法（例如，低体积HTP膜片钳系统28）的小规模的表达纯化标记的蛋白来进行。相同的，甚至可以在未标记的目标来进行裂解之后，所提供的标记和蛋白酶被除去（例如，通过反相HPLC）。质量控制也可以通过质谱法进行的（以确认预期的大小和氧化STATE）或色谱法（以确认纯度或异质性）29。有时标签切割是不必要的或什至不希望的（特别是对于难溶蛋白30,31），所以在这个协议裂解是任选的。无论如何，在所有构建体有一个TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQ / [G] 32）直接与靶基因切割后，以产生天然蛋白质前述（ 见图2和讨论）。如果融合标记的裂解需要，裂解可以被测试（在洗脱级分或“上的列'）在小规模分析效率，优化，如果需要，将获得的产量为随后按比例放大实验的可靠估计的条件。
有两种选择的亲和纯化过程中使用的珠的体积，取决于实验的目的和期望。为了能够捕获尽可能多的蛋白可能（以纯化为导频测定或质谱，或到EXTRAPOL吃了规模化收益率）的200微升树脂的最终体积应使用，使系统的饱和之前在1-100 mg / L的文化范围内检测可溶性蛋白质（见协议（一）第8.1节） 。然而，如果该实验的目的是低量的可溶性蛋白质的检测，然后50μl的树脂的最终体积是合适的，允许在0.1-25毫克/升培养的范围内检测可溶性蛋白质（见协议（乙）第8.2节）。
生产可以按比例增加，如果需要的话，得到的纯化的目标毫克量为，使用鉴定为可溶性表达的条件的其他结构和功能研究。在AFMB使用向上扩展协议的详情已在别处22,24讨论。
有关的实验装置，该协议中的关键步骤的进一步详情，改进和故障排除和技术的限制在盘被提供ussion。在开始实验前，请先阅读讨论。
整个预计的90％的成功率在每个步骤中的协议（例如，至少90％的培养物的生长必须在任何给定工序）。如果在实验中的任何步骤的成功率低于90％的样品被丢弃和重复实验的完整集合构建体。然而，这种成功率不是适用于表达为可溶性蛋白，或具有100％效率的切割结构的比例的结构的数目，因为这将是高度依赖于测试的蛋白质。
提供每个协议的具体细节的设置了机器人工作台（也如图4所示 ），但是它们可以被修改为需要的替代工作台设置窗口。机器人硬件（Tecan公司）由一个96多通道臂（MCA96），机器人机械臂（罗马）和8通道的液体处理头（中LIHA）。也可以使用LIHA如果MCA96不可执行的所有利用MCA96步骤，但是他们会花费更长的时间，因为LIHA需要步骤之间进行洗涤。当机器人在技术上是不是无菌环境，包括抗生素一般可确保不会有问题，污染或不育。
Protocol
A部分：转型与测试表达式
手动程序，克隆22和改造，净 化在别处24讨论。改造协议可以在机器人26得到充分执行，但它通常是更多的时间效率做手工。因此，在此协议从接种表达的预培养和改造的电镀开始从热震惊转变混合手工完成。关于手动克隆和转化程序的进一步详情，请参阅相关文献22,24。
1，预培养和电镀
- 准备机器人工作台（参见图4的位置）：
- 把300毫升槽含有150ml无菌LB培养基（补充了氨苄青霉素（100微克/毫升）/氯霉素（34微克/毫升），或其它适当的抗生素）在位置8。
- 把无菌DW96在位置11。将4倍事先准备好的24孔LB琼脂（安培/ CAM）的组织培养板（含2ml琼脂，每孔），其盖子上的位置14至17。
- 把变换板（含有热休克后的96变换混合）在位置13，这将被用于接种液体预培养和LB琼脂平板上。把一箱无菌200微升移液器吸头18位。
- 使用96-多信道臂（MCA96）和200μl的提示，吸出200μl的LB培养基（第8位），并分装到DW96 11位，重复，直到有1毫升的LB肉汤中的每个终体积为孔的该DW96。这将成为液体预培养。
- 使用机器人操纵器（罗马），取出第一个24 - 孔LB琼脂平板上的盖子，将其放置在其他地方（例如在旅馆载体），直到电镀完成该盘。
- 采用8通道的液体处理（LIHA）的头，然后混合吸50微升吨转化混合物在13位，他的第一列。改造组合本卷是刚够覆盖LB-琼脂良好。
- 与第一通道4，分配到第一个24孔的LB琼脂板上，在位置14的第一列（ 如图5）。
- 与最后4个通道，分配到第一个24 - 孔LB琼脂平板上的第二列中。
- 分装后彻底清洗所有的提示。
- 继续这个过程，直到所有的转换已被镀在第一板位置14，从96转移-使用图5中所提供的方案24 -孔。
- 一旦第一板已经完成，使用ROMA更换盖，并从下一板取下盖子在位置15。继续使用电镀计划在未来3板。
- 一旦电镀完成后，将德摇到1200转，动摇所有板块1分钟有转化混合物的均匀分布。 使用MCA96和原来的枪头，然后混合吸60微升，其余转化混合液（13位），并分配到含有LB培养基在位置11的DW96。
- 密封DW96预培养具有透气粘结膜，使文化曝气。
- 放置在37℃摇床以最大速度O / N（200/800转视摇床轨道）。
- 的LB琼脂平板上应该放置在其盖子的罩关闭，直到干燥（10分钟）。然后，它们被放置在倒置37℃恒温箱板，直到第二天早晨。
- 第二天，将预培养物用于接种在自动诱导培养基和用于制备甘油原种测试表达式。将琼脂平板在冰箱中，作为备份。如果有必要，从琼脂平板或甘油股票开始，测试表达式可以重新做直接接种新鲜LB预培养。
2，准备DW24 ZYP的-5052板
注：此过程大约需要5分钟才能完成每一套4倍DW24板。
- 弥补500毫升ZYP-5052自动诱导培养基96培养物（464毫升ZY介质中加入250μl2M的MgSO 4干燥，将10毫升50×5052，将25ml 20倍NPS中，在该顺序的每个重复-配方为每个组件是在表1中提供），补充有合适的抗生素。
- 准备机器人工作台：
- 把两个300毫升槽，每片含约250毫升培养基在5位和6。将4无菌DW24板在位置14至17。将200μl的提示位置18处。
- 使用MCA96和200μl的提示，吸出200μl的ZYP-5052的从第5位，分装到第一DW24板在位置14。执行此操作共5次（4提示将分配到单个井一次，共4毫升）中。在位置重复其余3×DW24板15至17日，SWIT清至ZYP-5052在第6位的最后两个DW24板。
3，接种测试文化表达和生长
注：接种大约需要10分钟才能完成每一套4倍DW24板，和持续增长的O / N。
- 准备机器人工作台：
- 把DW96板包含预培养（从步骤1.15）在位置11。将四个DW24板含ZYP-5052培养基（步骤2.3）在位置14至17。
- 使用LIHA分泌物从位置11 100微升的预培养使用图5中提供的方案接种测试表达式文化（1/40稀释），在96孔预培养的各列之间的洗漱台彻底清洗LIHA头。
- 密封DW24板的透气膜，并在37℃振荡（200/400转）4小时。这是生长阶段期间的时间而glucosE从媒体将优先被耗尽27。
- 降低温度至17℃。在4小时和葡萄糖耗尽后，乳糖就会开始被代谢，从而导致诱导表达。提供最佳的生长条件为BL21（DE3）pLysS中或罗塞塔2（DE3）pLysS中，在此工作22。离开细胞表达的O / N。使用剩余的预培养，使甘油股票。
4，甘油制备的股票
注：甘油股应一式三份，以被存储在不同的位置，以防冷冻故障作出。
- 准备机器人工作台：
- 把酶标板在位置5〜7容纳甘油股票。把300ml的波谷位置8填充50毫升100％的甘油。将含有800微升预培养的DW96（步骤3.2之后），以及每个位置11。将200微升的提示在第18位。
- 使用SLO瓦特愿望和点胶速度，使用MCA96和200微升提示，甘油添加到包含预培养的DW96。
- 吸200微升甘油（从位置8）。
- 免除150微升（11位），然后再暂停20秒，以允许其余的甘油，以达到尖端的底部。免除剩余的50微升。
- 使用相同的技巧，拌入DW96文化和甘油在位置11，直到它们完全混合。甘油的最终浓度为20％。从DW96吸液140微升，分装到第一微量滴定板在5位。
- 重复步骤4.3对其余每个微量滴定板（位置6和7）。
- 用塑料胶带密封存放每个酶标板在-80°C。放弃在DW96其余的文化，与处理前的抗菌剂去污。
5，评估培养物的生长
600通常是相同的大多数文化（围绕在这些条件下12），但不增加任何文化中应该注意的。
- 取50微升每一种文化的（步骤3.4），分装到含有150微升培养基的平底，清晰的微孔板。
- 测定OD 600，并考虑到了4倍稀释。如果有任何未长得很好，注意，这对于最后的分析。
6，收集细胞
注：此过程大约需要45分钟才能完成。
- 在3000×g离心10分钟，离心4倍DW24板（步骤3.4），然后弃去上清液到含有抗菌剂的废弃物容器中。轻触板，倒置，在吸水纸上，以消除任何多余的介质。
- 在此期间，制备100ml裂解缓冲液（50mM的Tris，300mM的氯化钠，10mM咪唑pH为8，或其它优选的缓冲液）含有溶菌酶（终浓度为0.25毫克/毫升）。
- 准备机器人工作台：
- 将裂解缓冲液中的300毫升槽在位置5。将一个干净DW96在位置11。将含细胞沉淀的4×DW24板（来自步骤6.1）中的位置14-17。把200微升的提示在第18位。
- 使用MCA96和200微升的提示，吸125微升裂解液从位置5，分装到每个DW24板（位置14-17）。重复。注：4提示将分配到一个单一的以及在一次为1毫升在DW24板的每个孔的最终体积。
- 摇板则采用德颤（1000转）15分钟，悬浮颗粒的位置14-17。
- 一旦沉淀重新悬浮，使用第4信道的LIHA的从样品中吸出550微升1到4（第一DW24，在位置14的第一列），然后使用升ast的4个通道的LIHA抽吸的550微升样品5到8（第一DW24的第二列）。分装到DW96的第一行11位。
- 重复步骤6.6，以使所有的细胞悬液转移至DW96。
- 经过各组样品洗LIHA提示在洗漱台。
- 使用图5中提供的方案中的每个DW24板的每一列（仓位15-17）重复步骤6.6至6.8。用塑料薄膜封严。
- 为净化在同一天或短期冷冻，在-80℃下至少1小时的店，在-20否则存储°C。
B部分：纯化与分析
7，细胞裂解
注：此过程大约需要60分钟才能完成。
- 解冻冷冻的细胞悬浮液（来自步骤6.10），在水浴中（在室温或37℃）下约15分钟，并重新悬浮在摇动培养箱中的一个DDITIONAL 10分钟。文化应该成为粘稠。
- 取500微升的DNA酶的股票，并用1毫升硫酸镁股票混合。手动与一个8通道移液器或机器人LIHA，取15微升到DW96的各孔中，得到的DNA酶的10微克/毫升和20mM MgSO 4干燥的终浓度。
- 重新密封板用塑料胶带，动摇了另外15分钟。此时培养物应该是无粘性的。仔细检查（目视检查），所有的文化都不再粘稠。注意：这是关键，如果某些文化中仍然粘性（例如，如果DNA酶不小心被遗忘或无法在某些井中适当分配），过滤器会堵塞，产生的样本和溢出或总堵塞的压力不均匀过滤板的纯化过程中都可能发生。
- 对全细胞裂解物，吸出10μl的裂解液，分装到一个含有96孔PCR板的SDS-PAGE样品加入10μl的4×SDS-PAGE样品缓冲液和20μl水中。变性3分钟，在95℃和冷冻直到分析（合计分数）。如果一个HTP电泳系统是可用的，样品可以在此之后，而不是制造商的样品制备推荐的方案进行分析。有关样品的分析进一步详情，请参阅第10节。
8，镍亲和纯化
注：一个缓慢的吸液速度应被用于所有吹打悬浮树脂，作为悬浮液是相当厚。过干燥该树脂会导致在结合能力的降低。对于纯化，指定的咪唑浓度适用于镍亲和树脂。如果替代性的离子（ 如钴）时，则该浓度应该相应地进行调整。
- A - 镍亲和纯化用于检测在1-100毫克/升的范围内（最终树脂体积= 200微升）
注：T他的纯化过程大约需要1.5小时才能完成，这意味着多达4可以在一天内完成。- 准备机器人工作台：
- 放300毫升波谷含有的结合缓冲液（50mM的Tris，300mM的氯化钠，10mM咪唑pH 8）中，洗涤缓冲液（50mM的Tris，300mM的氯化钠，50mM的咪唑pH 8）中和洗脱缓冲液（50mM的Tris，300mM的的NaCl，250mM咪唑pH为8）中的位置6至8中。
- 留下一个空300毫升槽在位置5的树脂浆料。在9位和第10放盘人。位置10处的放DW96在最上面的SPE块和过滤器/接收器板（20微米）。
- 把含有裂解液（步骤7.3）在位置14的DW96。在位置18和19把200微升大口径的技巧和200μl的提示，分别。把两个备用DW96板在一家酒店的洗涤和洗脱。注：他们也可以在不同的地点放在工作台上，如果一个酒店不可用。
- 准备105平衡毫升33％的树脂浆料（35毫升树脂+ 70 1ml结合缓冲液）。立即开始在手术前加入树脂悬浮槽在位置5。
- 使用MCA96和200微升全口径的提示（第18位），吸液和分配200μL的树脂浆料倒入含有溶解物在位置14的DW96前彻底混合树脂浆料在位置5，重复两次，使600微升的树脂浆已被添加到该溶胞产物中，每个吸液前的树脂悬浮液中混合。
- 执行使用MCA96在位置14，以便结合并防止树脂造粒10分钟混合步骤。
- 吸出从位置14和分配800微升（在200μl手）到过滤板9位，每个抽吸之前混合，否则树脂将在DW96的底部保留。
- 打开真空位置10处为约90秒至穿过板的裂解物过滤进DW96收集流通，注意不要干出树脂。关闭真空断。
- 重复步骤8.1.5和8.1.6使所有的树脂，然后在过滤板。
- 使用ROMA手臂移动SPE块保持滤板从位置10到位置9，使下一个清洗步骤直接进入垃圾和10位传输含流过的DW96到另一个站点（ 例如 ，成酒店载体），直到程序结束。
- 用一套新的200μl的提示（19位），以总共800微升的结合缓冲液洗涤树脂（9位）（从位置6），然后应用真空，在9位，直到缓冲区已经通过传递。再重复一次。
- 使用ROMA手臂放置一个新鲜DW96在10位，收集50 mM咪唑的洗涤和移动SPE块和过滤板重回巅峰（第10位）。
- 从位置7加入800μL洗涤缓冲液到第10位，转真空，直到缓冲区已通过。开关的真空断。
- 与罗姆人，除去SPE块和过滤板定位9和含洗样品到酒店的DW96，并保持它放在一边，直到程序结束。
- 与其他800μL洗涤缓冲液洗涤树脂（从位置7到第9位），适用于真空，直到缓冲区已通过。再重复一次。
- 使用ROMA放置一个新鲜DW96在10位，并放置在SPE块和过滤板重回巅峰，收集洗脱。
- 共500微升的洗脱缓冲液中加（从第8位到第9位）并孵育原位 3分钟。打开真空，直到所有的缓冲区已通过。
- 可选：对于高表达的蛋白，第二洗脱可以执行到一个新的DW96如步骤8.1.14和8.1.15。
- 取的样品流过，洗涤和洗脱/ s的SDS-PAGE或HTP电泳。
- 对于HTP电泳样本，依照制造商的指示。有关样品的分析进一步详情，请参阅第10节。
- 准备机器人工作台：
- 乙 - 镍亲和纯化用于检测在0.1-25毫克/升的范围内（最终树脂体积= 50微升）
注：此纯化过程大约需要30分钟才能完成，这意味着多达12可以在一天内完成。- 准备机器人工作台：
- 放300毫升波谷含有的结合缓冲液（50mM的Tris，300mM的氯化钠，10mM咪唑pH 8）中，洗涤缓冲液（50mM的Tris，300mM的氯化钠，50mM的咪唑pH 8）中和洗脱缓冲液（50mM的Tris，300 mM氯化钠，250mM咪唑pH为8）中的位置6至8中。
- 留下一个空300毫升槽在位置5的树脂浆料。在9位和第10放盘人。位置10处的放DW96在最上面的SPE块和过滤器/接收器板（20微米）。
- 把含有裂解液（步骤7.3）在位置14的DW96。在位置18和19把200微升大口径的技巧和200μl的提示，分别。把备用的96孔微孔板在一间酒店的洗脱。注意：这也可以在不同的地点放在工作台上，如果一个酒店不可用。
- 准备50毫升平衡25％的树脂浆料（12.5毫升树脂+37.5毫升结合缓冲液）的。立即开始在手术前加入树脂悬浮槽在位置5。
- 使用MCA96和200微升全口径的提示（第18位），抽吸和散开前彻底混合树脂浆料在位置5nsing 200微升的树脂浆料倒入含有溶解物在位置14的DW96。
- 在室温下孵育使用的碲摇摇晃在1400 rpm离心10分钟，以允许绑定。
- 吸出从位置14，并使用大口径的提示（位置18）到过滤板在10位分配的全部1200微升（在200μl手）。各抽吸之前混合，否则树脂将在DW96的底部保留。
- 打开真空上位置10处为约30秒通过板来过滤的溶胞产物进入DW96，收集流过，小心不要干出树脂。关闭真空断。
- 使用ROMA手臂，将SPE块从位置10保持滤板，使下一个清洗步骤直接进入垃圾定位9和含转流过10位到另一个站点（ 如 DW96，成饭店载体），直到程序结束。
- 与200μ升片（19位），以总共800微升的结合缓冲液（从位置6）的洗涤树脂（9位），然后应用真空，在9位，直到缓冲区已通过。重复。
- 使用ROMA手臂放置新鲜DW96在位置10收集50 mM咪唑的洗涤和移动SPE块和过滤板重回巅峰（第10位）。
- 从第7位加入150μl洗涤缓冲液到第10位，打开真空，直到缓冲区已通过。开关的真空断。
- 与罗姆人取出SPE块和过滤板定位9和含洗样品到酒店的DW96，并保持它放在一边，直到程序结束。
- 与其他800μL洗涤缓冲液洗涤树脂（从位置7到第9位），适用于真空，直到缓冲区已通过。重复。
- 使用ROMA放置微孔板第9位，并放置在SPE块和过滤板重回巅峰，收集日Ë洗脱。
- 添加190微升的洗脱缓冲液（从第8位到第9位）并孵育原位 3分钟。适用于真空，直到所有的缓冲区已通过。
- 就拿流过，洗涤和洗脱进行SDS-PAGE或HTP电泳的样品。
- 为流过的SDS-PAGE样品，取10微升到含有10微升4×SDS-PAGE样品缓冲液和20μl水中的96孔PCR板。对于洗涤和洗脱的SDS-PAGE样品/ s的分配的30μl至含有10微升4×SDS-PAGE样品缓冲液PCR板。变性3分钟，在95℃和冷冻直至分析。
- 对于HTP电泳样本，依照制造商的指示。有关样品的分析进一步详情，请参阅第10节。
- 准备机器人工作台：
9。标签卵裂（可选）
- 添加TEV蛋白酶（2毫克/毫升），以洗脱的蛋白（来自步骤8.1.15（和8。在1/10的比率1.16）或步骤8.2.14）（体积/体积）。
- 在室温下孵育（或4℃的温度敏感的蛋白质）O / N与温和摇动。
- 在切割结束时分配30微升到含有10微升4×SDS-PAGE样品缓冲液或遵循HTP电泳样品制造商的指示的PCR板。
- 通过一个96孔0.22μm的过滤板过滤剩余的裂解混合物（来自步骤9.2），并收集可溶性流通过在DW96通过施加真空。这可以在真空位点中的一个（ 例如 ，位置10）上的液体处理机器人来完成，如在章节8.1和8.2的洗脱步骤。这消除了裂解过程中沉淀的蛋白质。
- 过滤后，取30微升到含有10微升4×SDS-PAGE样品缓冲液中的PCR板或准备作为HTP电泳样品。这使得蛋白质的裂解前的比较，裂解和溶胶后的混合物裂解后伊布勒剩余的蛋白质，并给出了在随后的扩大规模实验的预期结果良好迹象。有关样品的分析进一步详情，请参阅第10节。
结果10。分析
- 确定通过分析在SDS-PAGE，斑点印迹或HTP电泳系统，如卡尺芯片实验室的样品纯化表达的可溶性蛋白的构建体。
- 首先分析洗脱样品，以确定结构产生可溶性蛋白。在大多数情况下，仅在洗脱样品进行了分析，如果可溶性的结构被确定，以减少用在分析的时间。
- 如果蛋白质是不是在洗脱，运行清洗和流过的样品，看它是否被表达，并没有适当地结合到树脂上。
- 对于其中无可溶性蛋白质，可以检测运行的全细胞裂解物，以查看是否该蛋白的表达构建体。
注：此处的一个限制是，如果在p感兴趣的rotein不存在上述背景表达水平，但可能无法看到的蛋白质，并可能导致假阴性。但必须指出的是，总是有可能为蛋白粘和沉淀在亲和树脂，并且这可能导致假阴性或低估使用推荐的协议（在本工作的一个罕见的事件）的产率。在该蛋白质沉淀后洗脱（白色沉淀物是可见洗脱后数分钟/小时）的情况下，建议改变缓冲液的组成（例如，盐的浓度）和/或执行的差示扫描荧光测定法来优化缓冲区。树脂的少量样品，也可以悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液并煮沸，以检测是否正在被保留在树脂上的蛋白质。 - 如果没有被表达的蛋白质，但细胞确有增长，追求一种新的表达策略，或者外径600不够高再生，重新分析了文化。 >
- 如果裂解样品进行分析，就应该在侧面并排的方式进行分析，以使每一个构建体可以显示切割之前的裂解在相邻车道后，为了简化分析。
- 除非使用一种方法，给出了洗脱浓度的直接定量，应通过测量280nm处的吸光度（A 280）来执行对于阳性样品的定量。
- 测A280，取消光合作效率的蛋白质的考虑，并使用洗脱缓冲液作为空白，以提供蛋白质产量的估计，以确定最高表达可溶性结构。
- 可溶性产量的最可靠的比较，建议由文化的密度（用OD 600测量），这是采取第5正常化的收益率，如果所有的文化增长到大约相同的密度，归一化不必需的。
- 样品可以直接从通过液相色谱 - 质谱（LC / MS）的洗脱或裂解的样品进行分析。
- 可替换地，脱盐第一（以除去咪唑和任何缓冲盐可能存在的），使用ZipTip微量层析柱或液相色谱法，然后再分析使用基质辅助激光解吸/电离 - 飞行时间的（MALDI-TOF）或电喷雾电离（ ESI）质谱法。
- 小规模的功能性研究可以进行检查，如果该蛋白的功能是如预期。如果所需要的功能更大的量，比例放大培养可以作出与从一次的大小和氧化态的放大培养测试的功能已被证实在小规模的。
Representative Results
代表性的结果示于图6中用于从VENOMICS管道96二硫化物富含蛋白质的表达筛选的蛋白质被配置为通过增加数目的二硫键，然后增加残留的数目。将肽表达的有his标签和及DsbC融合伴侣细胞质中。当使用推荐的培养条件下，12的OD 600通常实现的。将肽用协议8.2-B为50微升镍亲和树脂的终体积进行纯化，从而可以在该实验被检测的最大〜25 mg / L的融合蛋白。
图6A示出了从钳芯片实验室系统（表示切割前的融合）和基于外推法得到的融合蛋白的mg / L的培养的评分系统（在0.1至2毫克/升培养物的水平，2到电泳结果10 mg / L的培养，10〜25 mg / L的培养和无吨检测。）请注意，切割及DsbC标签通常运行在大约32 kDa的，而不是27 kDa的预期。同样，融合及DsbC还奔波5 kDa的高于预期。对于很多的目标，我们不仅看到了完整的融合（上带），而且还融合伙伴单独（低频段）。对其中的一些目标优化培养条件，可以改善完好融合（上频带）相比，单独及DsbC允许增加的最终产率之比。计分是基于仅在完整的融合程度。仅16出96个蛋白质不能在融合水平进行检测。这对应于83％的整体成功程度。可能被检测出的80蛋白，含量大于2毫克/升培养物（56％）中检测到的这些45。取决于靶和融合蛋白产率通常为2-100 mg / L的培养的范围内（尽管在这个例子中使用的协议8.2 B可检测到最大〜25 mg / L的融合蛋白）。
T“>由目前二硫键数目（ 图6B所示）成功的分析显示为测试二硫键所有的数字（1和7之间）合理的成功，与成功的最低水平为66％，含二硫化6目标债券。表达成功的基于等电点和残基的数目（在图6C中示出）的分布的分析表明该技术没有特别的偏差，既成功地表达目标而那些没有检测到分散在整个小区的目标。图6D示出了从电喷雾电离质谱（ESI-MS），用于单个目标获得的，前和DTT还原的样品后的质谱分析结果的一个例子。通常，这样的穷举质谱分析将不需要进行（降低的样品将不需要被分析），但是，对于彻底demonstratio而言n我们已经表明两个结果。所示的目标是5.7 kDa的二硫键丰富的蛇毒蛋白有4个二硫键。在左侧的光谱显示之前DTT还原的结果为蛋白，因为它是裂解和脱盐无需进一步干预后。在右手侧的光谱显示DTT还原随后脱盐以除去任何过量的DTT后的蛋白质。对应于实验质谱中的离子被标记带频谱和指定为每个离子上的箭头显示为绿色。计算出这些离子的实验父块（用于蛋白质之前减少（-DTT）和还原（+ DTT）后）示于表中。群众（5709.6为大前减少和5717.6大的减少了样品的样品）展示的8大的质量差。 2沓的质量差对应的1氧化的二硫键的存在，因此8 Da的质量差表示的4个二硫键的存在下（如预期）中在非还原样品。
高通量表达筛选方案的图1。示意图。使用该协议，96至384的条件，可以由一个人在一个星期采用手工方式进行测试，或至多1152的条件与所描述的半自动化设备。表达质粒使用的是重组克隆技术让众多的目标可能是亚克隆在同一时间建造。一旦可溶性表达的条件已经确定，并进行切割，如果需要，所述蛋白质可以进行质量控制检查的氧化和纯度，microassays和/或大规模的生产。
图2为示意图通用重组克隆和构建设计，从目标条目克隆，多表达载体可以是子克隆在高通量方式（在一个星期内最多6×96入门克隆）一次实验。表达的蛋白编码镍亲和纯化His标签。及DsbC的（缺少其胞质信号序列的细胞质表达）融合伴侣是用来增加溶解度和/或援助折叠和靶蛋白的正确氧化。请注意，目标编码序列应该包含一个N-末端TEV蛋白酶位点（ENLYFQ）如果标签切割是需要的。在左上角的插图示出了生产中使用的供体载体和靶序列，可以通过PCR或基因合成获得的进入克隆。入门克隆，也可以从商业的入门克隆的集合获得的。多个重组克隆系统可用，但是我们利用网关系统·米，如图中示意。
图3的高通量筛选管道多个二硫键富含目标。目标最初表示为HIS-及DsbC融合体在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中大肠杆菌的细胞质大肠杆菌在37/18°下使用自动诱导培养基（ZYP-5052）。纯化是在镍树脂随后检测可溶性构建由HTP电泳（或斑点印迹/ SDS-PAGE）中进行。如果第一轮表达式筛选不成功，另类文化条件都试过了。如果构建体产生的可溶性蛋白在足够高的产率，microassays和质量控制可以被执行，如果需要，大规模生产可以追求。对于目标，其中可溶性收益率不够高，表达筛选可以继续使用替代STRA插件和温度那么其他的融合伙伴和周质表达。可选的步骤，由虚线框表示。
图4。机器人工作台设置为HTP平台。我们的液体处理机器人工作台的布局所示，虽然替代工作台还可以用于提供有可用的等效的网站上。该装置由一个清洗站（WS）为（8通道的液体处理头（LIHA）），两个微孔板运营商有4个位置各（MP4，持仓1-4和5-8），真空站2位置（TE-VACS，位置9和10），与3位置的微载体（MP3，持仓11-13），二板摇床2个位置各（德摇床，持仓14-15和16-17）和载体与3个位置一次性吸头（DITI，持仓18-20）。此外，该再有两个饭店载体深孔板，一个用于微板（未示出）。安装在液体处理机器人的硬件是一个96多通道臂（MCA96）与一次性吸头，一个8通道的液体处理头（LIHA）具有固定的提示和机器人操纵（罗马）的移动板/设备周围使用工作台。该位置的编号是指在整个协议。
图5原理图，用于从单个96孔板转移到4个24孔板中。
图6。代表性的结果示于96二硫化物丰富的毒液亲表达屏teins。将蛋白表达为HIS-及DsbC融合体在细胞质中，并使用50μl的镍树脂（协议8.2-B）进行纯化，A）中的表达筛选结果，是表示虚拟凝胶和得分的表达产率。在虚拟凝胶对比度进行了调整车道到车道，以弥补非常微弱的或激烈的乐队。请注意，对于某些目标两个频带中可以看出，上频带相对应的完整的融合蛋白和低频段对应于融合标记单独B）表示在每个表达水平的蛋白质的比例相比，二硫键的数目的蛋白质。蛋白质的各组中的实际数目被叠加在图形上。C）的表达水平的基础上，等电点（pI）和残基的数目的分布。D）的质谱结果为5.7 kDa的二硫键丰富毒液的一个例子蛋白4个二硫键。在频谱左手侧示出了减少前用DTT和在右手侧的频谱的蛋白显示出减少用DTT，然后脱盐的蛋白质。相应的实验群众的离子都标有箭头和他们的任务显示为绿色。前减少和还原后都显示在表中，表现出的8大的质量差，对应氧化蛋白除了还原剂之前存在的实验群众的蛋白质。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 元件 | 食谱 | 评论 | |||
| ZY | 〜928毫升 10g胰蛋白胨 5g酵母提取物 925毫升水 | 混合，然后高压灭菌消毒。 | 2M的硫酸镁 | 百毫升 49.3克硫酸镁4·7H 2 O 〜60毫升的水 | 搅拌至溶解，然后高压灭菌消毒。 |
| 50倍5052 | 1升 250克甘油 730毫升水 25克葡萄糖 100克α-乳糖 | 添加顺序，搅拌过热，直到全部溶解，然后高压灭菌消毒。 | |||
| NPS 20倍 | 1升 900ml去离子水中 66克（NH 4）2 SO 4的 136克KH 2 PO 4 142克的Na 2 HPO 4 | 添加顺序，搅拌至全部溶解，然后高压灭菌消毒。 |
表1配方为ZYP-5052培养基的组成部分。
Discussion
有可溶性的，折叠，功能性蛋白的表达没有单一的通用协议。具有成本和时间效益，因此大多数实验室或蛋白质核心设施具有多个目标的工作使用高通量蛋白质表达筛选，找到变量最好的'通用'组合，以获得可溶性活性蛋白，为广大的目标。我们已经确定及DsbC作为以二硫键丰富的肽和蛋白质11的可溶性表达一个普遍适用的融合伴侣。使用及DsbC融合和高通量的方法，在一个星期内的多个目标的可溶性表达，可以观察到11，然后附加变量，比如那些在引言中讨论的，可以在随后的几轮筛选对那些需要进一步优化的目标。本文中所描述的协议的目的是二硫键丰富的蛋白质和肽的表达。然而，对于用户希望为exp以高通量方式RESS非网状的蛋白质，相应的协议已被先前公布的，并且可以在其他地方找到22,24。
关于高吞吐量的设置是理想的许多应用，其中包括了大量不同的蛋白质为可溶性表达或用于在同一时间几个靶基因大量表达构建体（包括各种融合标签）的筛选的筛选（或者，为了提高成功率多个表达构建为一个单一的目标）。该平台还可以用于新的协议上的大量目标的基准测试和验证。其他应用包括的变体的筛选单个困难的目标， 例如 ，所有的直向同源物或同一个家庭的成员，或者测试生产单一靶的突变体在一个实验小组的成功。这个协议也已经在与共同表达载体（机智组合使用高电平单只标记蛋白），使上拉下来的蛋白-蛋白复合物随后更彻底的生物物理分析，以确认正确的复合物的形成和化学计量33初步鉴定。蛋白质纯化的量有时适于微测定法（功能测试，蛋白质-DNA 34或蛋白质-蛋白质相互作用测定法）。有几个优势，以高通量表达筛选策略：（i）向测试大量的目标的能力或大量的变量在单个实验中，（ⅱ）有限批次到批次的变化，（iii）该简单和易于使用的深的井，（ⅳ）可扩展性和重现性在规模较大，（V），用于自动化的潜力，以及跟踪的（ⅵ）简单性在较小规模的加工和处理（无标记单独的管的，更少的错误使用时，板格式较个别管中混合处理或克隆的交换）出台。
分析型亲和纯化从测试表现文化，以恢复可溶性融合蛋白和量化收益率执行。定量数据可在日获得100 mg / L的文化 - 在0.1之内表达的融合蛋白电子可溶性产量。如果目标不溶于水，不同的融合合作伙伴之前追求另类的表达和诱导温度，压力或媒体可以进行测试。对于二硫键蛋白质丰富的可溶性表达，我们此前排名融合合作伙伴的效果及DsbC> DsbA蛋白> GST> MBP> TRX> His标签的细胞质表达11。周质表达的是，可能有助于二硫键丰富的目标的成功折叠另一种可能性。周质是一个不太还原环境比细胞质和包含有用的氧化还原分子伴侣协助二硫键。及DsbC，DsbA蛋白和MBP蛋白通过其周质信号序列通常定位于周质中。这提供了机会，以引导二硫化物富目标到周质空间中，以协助折叠来利用这些标记。对于顽固性的目标，下一步将是为p从包涵体urify不溶性HIS标签的目标，溶解和复性（这是这项协议的范围，并不会在这里讨论3 9）。这对于只有一个或两个二硫键目标相当简单，但变成为二硫键数目的增加变得越来越困难。或者，特别是对于蛋白质和肽具有四个或更多个二硫键，它可能是有益的尝试较复杂的生产系统，例如酵母，昆虫或哺乳动物表达。
随着微型化和自动化的进步，HTP电生理实验室的单芯片技术28无疑将是未来的功能分析的方法。我们预期，对于大多数用途（或许除了结构研究的），这将否定需要大规模培养。小规模的文化将不仅是筛选表达式条件下非常有用，而且还能够提供萨夫ficient量样品的这些小型化的功能测定法。以足够的数量，以产生并行的多个目标功能特性的能力将降低培养和使用这些种平台的成本，重组蛋白质的表达和表征将变得更加成本和时间效益。
的协议本文已应用于二硫键丰富的肽和蛋白质的表达在FP7欧洲VENOMICS项目的初始阶段。毒液是生物活性肽，往往有有趣的药理潜力的极好来源。然而，它们的生产是由于其复杂的二硫键键合模式和小尺寸有挑战性。使用像这里所描述的高通量平台上，VENOMICS项目旨在产生10,000小说蛇毒肽库再现自然界中观察到的多样性。这个库将被利用为二硫化物-R的表征ICH肽与潜在的药物或治疗应用与开发新药的目标。该平台目前正在使用的基准测试和验证新的协议在VENOMICS项目中使用。
Acknowledgments
这项工作是由该VENOMICS项目，欧盟项目补助扆278346通过第七框架计划（FP7生2011-2015年）的支持。该VENOMICS项目是在欧洲一些研究机构和公司之间的合作：
AFMB，埃克斯 - 马赛UNIVERSITE（法国），东航萨克雷（法国），NZYTech（葡萄牙），SistemasGenomicos（西班牙），大学列日（比利时），VenomeTech（法国），Vitamib（法国），新西兰制药（丹麦）
这项工作是由法国基础设施一体化结构生物学（FRISBI）ANR-10-INSB-05-01支持。
作者还要感谢杰里米Turchetto先生协助筹备影片的拍摄。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot | Tecan Group Ltd. | Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8 |
|
| 96-well PCR (PCR96) plates | Greiner Bio-One | 652270 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ |
| LB medium | Autoclaved for sterility. | ||
| Antibiotic stocks | Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution. | ||
| Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity | Greiner Bio-One | 780270 | Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ |
| Expression vectors | For the expression of target constructs. Store at −20 °C. | ||
| BL21 (DE3) pLysS competent cells | Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C. | ||
| Breathseal breathable adhesive film | Greiner Bio-One | 676050 | |
| PCR machine with 96-well plate block | For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples. | ||
| 24-well sterile tissue culture plates | Greiner Bio-One | 662165 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/ |
| LB-agar | Autoclaved for sterility. | ||
| 200 μl sterile disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 617 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Multitron shaking incubator, with 3 mm throw | Infors | AJ103 | Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/ |
| Plate incubator | |||
| Microtiter plate | For glycerol stocks and elution using purification protocol B. | ||
| Glycerol | For the preparation of glycerol stocks. | ||
| 200 μl disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 616 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Adhesive tape pads | Qiagen | 19570 | http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads |
| Bactinyl | Orapi Group | Or equivalent microbial disinfectant. | |
| ZYP-5052 medium | See Table 1 for recipes of components. | ||
| Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity | Whatman | 7701-5102 | Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102 |
| Flat-bottomed, clear microtiter plate | Greiner Bio-One | 655101 | For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ |
| Plate reading spectrophotometer | Optional. For measuring OD600 of cultures. | ||
| Centrifuge with rotor for deep well plates | Suitable for 3,800 x g. | ||
| Lysozyme | 50 mg/ml in water. Store at −20 °C. | ||
| Imidazole ACS grade | Merck | IX0005-1 | A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield. |
| Lysis buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods. | ||
| Water bath | |||
| Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) | Misonix Inc. | Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis. | |
| DNase | 2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C. | ||
| Magnesium sulphate (MgSO4) | 2 M stock in water, autoclaved. | ||
| SDS-PAGE or Caliper sample buffer | |||
| Binding buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| Wash buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| Elution buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| 96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity | Macherey-Nagel | 740686.4 | http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx |
| 200 μl disposable wide bore tips | Tecan Group Ltd. | 30 050 348 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Ni Sepharose 6 Fast Flow resin | GE Healthcare | 17-5318-02 | For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802 |
| Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C. | ||
| 96-well 0.22 µm filter plate | Millipore | MSGV N22 10 | Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210 |
| SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment | Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion. | ||
| Spectrophotometer and cuvettes | For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper. | ||
| ZipTip pipette tips | Millipore | Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0 |
|
| Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted. | |||
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