Summary
我々は、高剪断均質化およびシリアル濃度を用いて、静脈内酸素供給用に設計された脂質ベースの酸素の微小気泡（のLOM）の大量製造するための方法を記載している。
Abstract
ガス充填マイクロバブルは超音波造影および薬物送達剤として開発されている。マイクロバブルは、超音波処理、機械的攪拌、マイクロ流体デバイス、または均質化を用いて界面活性剤を処理することにより製造することができる。最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、生命を脅かす低酸素血症を逆転、医療緊急時に静脈内に酸素を供給するように設計され、その後の臓器損傷、心停止、死亡を防止しています。我々は、閉ループ高剪断ホモジナイザーを使用して、高度に酸素化されたマイクロバブルのスケールアップ生産のための方法を提示する。プロセスは、90分での濃縮のLOM 2 L（90体積％）を生成することができる。 60体積％に希釈したときに得られた気泡は、約2ミクロンの平均直径、および血液のそれと一致するレオロジープロファイルを有する。この技法は、この技術はトランスレーショナルリサーチラボのために有用であり得ることを示唆している、高容量および高酸素純度のLOMを生成します。
Introduction
タンパク質、ポリマー、および脂質のシェルからなるマイクロバブルは、薬物送達のためのベクター、遺伝子治療、および超音波造影剤1-5として開発されている。これらの治療的使用は、血管内マイクロバブル持続性を必要とするので、このようなマイクロバブルは、一般に、血液中の低い溶解性を有し、気泡を安定化させる3,4パーフルオロカーボン6のような不活性、高分子量のガスが充填されている。
最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、末端器官の酸素供給を維持し、気道閉塞や低酸素血症7の期間中に血行動態不安定性を防ぐことができる酸素の治療用量を提供するように設計されています。静脈内のガス送達のために設計されたエマルジョンは、超音波造影剤または標的化薬物送達のために使用されるものとは異なる設計上の特徴を必要とする。本体は、酸素ガス（〜200ml /分）を大量に消費するため、まず、のLOMを製造する必要があり、大規模に注入された。これにより、製造プロセスが効率的である必要があります。第二に、製造プロセスは、周囲空気に（100％酸素で充填されたい）のLOMの露光を通して窒素汚染を回避するために閉ループであるべきである。のLOMの目的は、静脈内のガス送達であるので第三に、のLOMのガス留分は、エマルジ ョンの粘度7による制限を認識し、最大化されるべきである。最後に、すべての静脈内注射用と同様に、粒径分布の正確な制御は、微小血管障害物08を回避するために不可欠である。
マイクロバブルの製造のためのいくつかの確立された方法がある。超音波処理は、高い強度を利用し、低周波の超音波は、マイクロバブル7,9を生成するためのガスヘッドスペースの存在下では、このような両親媒性リン脂質のような界面活性剤を含むエマルジ ョンの空気-流体界面に適用した。このプロセスは、超変えることによって制御可能である超音波処理はほとんど臨床的に使用されるマイクロバブルの製造に使用されていないものの、音の周波数、パワー、パルス持続時間、得られた粒度分布は、特定のサイズ分布のマイクロバブルを生成するように調整することができる。合併は、大量の2に対応するためにスケールアップすることも困難である、密閉系、中の界面活性剤やガスの激しい機械的攪拌である。液滴ベースのマイクロ流体は、マイクロバブルの粒度分布10月13日の正確な制御が可能になります。伝統的に困難なスケールアップするものの、多チャンネルの高速マイクロフルイディクスは、マイクロバブル生産効率を高める13が記載されている。これらの方法のいずれかを用いて製造されたマイクロバブルは、遠心分画14,15及びマイクロバブル浮遊選鉱16,17として製造後小型化プロセスを必要とし得る。
非常に安定したマイクロバブルの製造のための別の確立された方法は、せん断homogenizですマイクロバブルの表面18上の安定六角形のリン脂質パターンになることができますATION 6、。この概念を踏まえ、我々は自己組織化のLOM 19を作成するために、インライン高剪断ホモジナイザーの組み込みについて説明します。このプロセスでは、ホモジナイザが急速にマイクロバブルを作成するための高い機械と油圧剪断を作成する、デュアル細かいメッシュemulsorスクリーンに近接して回転ブレード利用する。このシステムを介して脂肪乳剤のシリアル濃度はさらに遠心分離によって濃縮することができ、ますます濃厚ガス留分を、得られます。
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Protocol
1。システムのセットアップ
システムは、単段ミキサー、インライン高剪断ホモジナイザー、HCT、ホモジナイザーとの間に流体を移動させるローラーポンプ、および熱交換器（図1）を取り付け、保持タンクを濃縮（HCT）からなる。
- 一段ミキサーの下に2ベースポートと3側面ポートを装備滅菌、広口4リットルのガラス回収容器を置きます。容器の口にミキサーヘッドを下げて（ヘッドスペースを汚染する周囲の空気を防ぐために）ゴム製のシールやテープを使用して気密フィットを保証します。
- 無菌3月8日とHCTの（図1、ポート＃1）ベースポートのいずれかに合わせて」（ID）をクリアチューブ、およそ10 "長い、濃縮エマルジ ョンの収集のための先端の3方活栓を装備。
- 無菌3/8 "（ID）のチューブで二塁ポート（図1、ポート＃2）を取り付け、approximatel長さY 36 "。ローラーポンプを介して、このチューブを通します。 2ポートを含むTピースと高せん断ホモジナイザーの入口にフィットし、次のように接続し、ローラーポンプを介して、ポート＃2からチューブを接続し、Tピースの側ポートに接続します。低流量酸素ガス流量計を用いて酸素タンクに他のポートを接続します。
- 4℃に維持し、インライン熱交換器の入口ポートに高剪断ホモジナイザーの出口ポートを接続閉ループシステムを作成、HCT（図1、ポート＃3）の戻り口に熱交換器の出口ポートを接続する。
- HCT（図1、ポート＃4）に（流量計を経由して）酸素タンクを取り付けます。 HCTの上部ポート（図1、ポート＃5）の大気に開放されているガス組成計を取り付けます。
- 無菌性が望まれる場合には、オートクレーブによる各使用の前にガラスと金属成分を滅菌する。配管部品やプラスチックのCOを殺菌各使用前に、エチレンオキシドによるnnectors。生成物はインビボで試験される場合、これは特に重要である。
2。のLOM製造
- GMP 1,2 -ジステアロイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DSPC）およびHCTの基部におけるコレステロール10gを20gのを置く。水相に可能な限り多くの脂質を統合し、1分間、HCT、手撹拌するプラズマLyte Aの1リットルを追加します。
- ミキサー全体ヘッドは水相で覆われていることを確認して、水相中に一段階ミキサーを下げます。 HCTの上部は気密（上記の手順1.1を参照）、全くのオープンサイドポートがないことであることを確認してください。ポート＃4に取り付けられたガス源をオンにして、HCTのヘッドスペースの酸素分率が> 95％に達するまで待ちます。 10リットル/分（LPM）で、これは約10分を取る必要があります。
- 単段ミキサーを用いて、5,000 rpmで5分間、前駆体エマルションを混合する。得られた混合物を淡い白で表示し、目に見えるLIPIが含まれているべきではないD塊。混合した後、未使用の脂質 - 水混合物は、単回使用の前に最大30日間4℃で保存することができる。
- 総理1.3 LPMでのローラーポンプをオンにして前駆体エマルション全体閉ループシステム。システムが準備されると、1.3 LPMでオンポンプを保つ。
- のLOMの製造を開始するには、7,500 rpmまでのインライン高剪断ホモジナイザーをオンにします。その直後に、0.5 LPMでのホモジナイザーの入口部への酸素の流れをオンにします。 3,500 rpmで上（HCT）で一段階ミキサーを保管してください。のLOMは、インラインホモジナイザー（図2）内のロータブレード及びemulsor画面の界面に形成されている。数分以内に、流体が目に見えてより粘性になる必要があります。より厳密な手法は、製造中に、ポート1からのアリコートを除去し、粘度計を用いて分析することによって行うことができる時間の関数としての粘度を決定することである。
注：目に見える気泡はミキサーを出るチューブ中に存在する場合、酸素インライン·ホモジナイザーへの流れが高すぎる。流体は不透明であり、目に見える気泡を含まないまでガス流を下滴定する。 - 15分間のシステムを実行してから、それに高剪断ホモジナイザーおよび酸素注入をオフにしてください。エマルジョンが除去されるまで、HCT単段ミキサーを実行し続ける。これは相分離を軽減し、HCT内で比較的均一な製品を保持します。
注意：ガス充填エマルジョンの量は、シリアル濃度段階の間に約2〜3倍に増やす必要があります。そうでない場合は、その酸素が高剪断ホモジナイザーに流入され、前駆体エマルションでその脂質濃度が正しいことを確認してください。脂質濃度が低下すると生産効率が低下する。
3。コレクション、集中、評価、およびのLOMのストレージ
- 無菌を取り付け、収集容器上のベースポート＃1に装着活栓に140ミリリットルルアーロックシリンジを変更しました。 10を策定流体の0ミリリットル。すべての流体が除去されるまでしっかりとシリンジを繰り返し、キャップ。
- 注射器への空気の100ミリリットルを引き出す、次に140ミリリットルマークの上に余分なプランジャーとシリンジ材を切り鋸で注射器を変更します。プランジャーを策定する歯付き鉗子を使用して記入し、空の注射器。この変更は、簡単に遠心分離することができます。
- エンドキャップ付き遠心シリンジは10分間225×gで冷蔵（4℃）バケット遠心機で下向き。
- 材料の3つの層は、遠心分離後に表示されます。過剰曇っ水相の最下層を追放して捨てる。第二層は明るい白で、集中のLOMが含まれています。雰囲気ガスの汚染を防止するために三方活栓を用いて、ガス不透過性のシリンジに濃縮された泡を移す。破裂したのLOMから遊離酸素ガスを含む最終的な層を捨てる。
- 泡質濃縮泡の≥90％のガスに達することによって評価することができる。カルキユル次のようにガス濃度を食べた。
体積％のガス= [（発泡体重/泡体積） - 1]×100- 粒径が予想範囲内である場合に、第2の品質管理として、光掩蔽によるサイズのマイクロバブルを決定する。これは、均質化時間または処方の変化が気泡のサイズを変化させる可能性があることに留意すべきである。
- しっかりとルアーロックフィッティングでガラスシリンジにキャップ。集中のLOMは、使用時にプラズマLyte Aで希釈することができる。注射器は22、4で保存するか、あるいは可能な-20℃º;より低い温度は、強化された貯蔵寿命安定性7を提供することがあります。
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Representative Results
高せん断均質化は、動物の研究のために十分のLOMの（ すなわち 1日の午後内で）効率的な生産を可能にし、技術的専門知識を必要としません。一旦熟練し、濃縮のLOMの最大2 Lは90分で製造することができる。
マイクロバブルのサイズ及び形態を光学顕微鏡により光オブスキュレーションにより評価した。のLOM10μlのサンプルを可視化した場合には、球状のLOMに注意だけでなく、脂質の破片（図3A）の相対的な不足た。 GMP生成物を用いた場合に特に当てはまる。のLOMの同じサンプルは、光オブスキュレーションによって評価したところ、平均粒径が2.624±0.332ミクロン（SD）であった。のLOMの90％以上が直径<10μmのようで、人口は多分散（図3B）であった。
エマルション粘度（マイクロバブル濃度にあるので）高濃度ガス留分に依存した。 2mlのアリコート応力が0.1〜10,000μN·mと変化させたとして変化するガス濃度のLOMから40ミリメートルの平行プレート形状を使用して、定常状態の流れスイープを用いて調べた。すべてのLOMガス画分をずり減粘挙動を示し、この現象は、最も高いガス画分において顕著であった。 60体積％のガスを含有するのLOMは、血液（図4A）と同様のレオロジー特性を示した。
最後のLOMの（ガス留分と酸素の分別濃度を含む）、酸素含有量は、既知の酸素欠損を有する不飽和化ヒト血液のアリコートに60容量％のLOM内に含まれる酸素種々のボリュームを追加することによって試験した。前述のように、のLOMの酸素含有量はヘモグロビン濃度の上昇7から計算することができる。のLOM内の酸素の添加量、血液の酸素含有量の容積の増加との関係は（SD）（95％CI = 0.9865から1.120）1.053±0.03025であった（ 図URE 4B）、テストのLOMがほぼ100％の酸素を含有していたことを示唆している、（効率的に血液に酸素を転送しますが、急速にフロートしない）いくつかのトラップされたガスポケットを示し、効果的に生体外でヒトの血液に彼らの全体の酸素ペイロードを転送します。
図1。セットアップ回路図を作製した。のLOMは閉ループ·システムで、インライン、高剪断ホモジナイザーを用いて製造される。のLOMが保持内に保持し、一定の混合下にタンク（HCT）に集中している。エマルジョンは、ローラーポンプを使用して、システムを通って移動する。ホモジナイザーで発生した熱は、熱交換器を用いて除去する。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</ A>
図2。細かいメッシュemulsor画面内のLOMの自己組織化。A）高速回転するブレードは、水とガスのフェーズで描くサイフォン効果を作り出し、細かいメッシュemulsor画面上を通過する。小さな酸素の気泡を剪断することによって形成され、迅速に自己組織化ガス充填気泡（B）を作成し、両親媒性リン脂質の疎水性脂質尾部に囲まれている。
図3のLOM。A）多分散サイズ分布を示す球状のLOMの代表的な顕微鏡写真の特徴付け 。スケールバー=10μmである。 B）のLOMのサイズ分布を光遮蔽によって評価される。データ=平均、誤差= SEM。
図4遠心分離し、濃縮のLOMの性質。A）60、70および90体積％のガスでLOMエマルジ ョンのレオロジープロファイル。 60体積％のガス泡濃縮物の希釈は、ヒト血液（ヘマトクリット値40％）と類似のレオロジー特性が得られる。データ=平均、誤差= SEM。 B）のLOMの酸素含有量との関係は、ヒト血液および血液中の酸素の量を測定した増加に加えた。最適な直線の95％信頼区間を使用したデータ=平均、誤差= SEM、ライン=線形回帰。
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Discussion
濃縮性の高い酸素化のLOMを作成する最も重要なステップは次のとおりです。1）HCT内のヘッドスペースが十分に酸素化されたままであることを確実にする。 2）脂質賦形剤の純度は（）貯蔵条件およびGMP製品の使用を含む最適であることを保証する; 3）粉末の脂質は、システムをプライミングする前に、水相と完全に混ぜることを保証する; 4）ガスの体積分率が70％を超えないことを確実にするためにHCT内のガス分率の増加に細心の注意を払う。
我々はここで説明する方法は、中空のマイクロバブルを作成するために、高せん断均質化を利用しています。両親媒性脂質は、インラインホモジナイザーに脂質を運ぶために使用される水相に懸濁されている。 GMPグレードの脂質は、 インビボ研究のために利用されており、それらはより少ない脂質凝集体および不純物を含有するので、一般に好ましい。格納されている場合は特に脂質は、（また、脂質酸化を受けやすい酸素化流体）及び細菌汚染の中。疎水性尾部はインラインホモジナイザー（図2）内に作成された周りの小さな酸素ガスマイクロバブルを配置するときのLOMが形成されている。それらは、ロータブレードの先端とステータの内壁との間に粉砕されるように7,500 rpmでのLOMを均質化するには、追加の機械的応力にマイクロバブルを施す。それらは超微細メッシュスクリーンを通してemulsor高速で強制されるのLOMはまた、粒子サイズを減少させる、油圧剪断を受ける。せん断力は、インラインホモジナイザー内で局所的に一段階ミキサーで熱を発生させる。 HCTに戻る前に、インライン熱交換器は、この熱を除去する必要がある。熱交換器が存在しないことは、製品の損失脂質および結果の流動性を増加させる脂質（DSPC、55℃）の相転移温度以上の温度を上昇させることができる。クローズド内の乳剤の作成は、インラインデバイスは、確実にその純粋oxygenが空気汚染を防止することにより、LOMコアに組み込まれる。さらに、のLOMを連続HCTのガス状のヘッドスペースににさらされている。これは、HCT内実験室用ミキサーで作成された吸引効果は、（HCTの加圧を防止するために、大気に開放され、ガス組成モニタを介して、）HCTに大気からの空気流の逆転を作成しないことを保証することが不可欠である。ここで説明する酸素ガス流量は、この現象を防止するのに十分であるべきである。
シリアル濃度フェーズ中に、インラインホモジナイザーを通して、エマルジョンのリサイクルは水相に残っている「未使用」のリン脂質から追加のLOMを作成し、さらに粒子サイズを減少させることができる繰り返させん断にそのままのLOMを施す。粒径及びガス濃度は、したがってemulsorスクリーン、メッシュサイズ、およびシリアルcは、実行時 （ すなわち持続時間、ミキサーの速度を調整することによって調整することができるoncentrationステップ）。機械的攪拌は、多分散サイズ分布を生成する。広いサイズ分布は、それによって泡の所与の体積の最大カプセル化された気体留分を増加させる、マイクロバブルのより緊密な充填を可能にする。封入粘度増強剤によって製剤の化学的性質を変化させることは、所望であれば、より均一なサイズ分布を作成するために使用されてもよい。我々は、15分の実行時間が最も理想的であることを見出した。マイクロバブルの濃度が増加するにつれて、エマルジョンは、次第に粘稠になる。それは重要な粘度に達すると、それはもはや効果的にローラーポンプを用いて圧送されない。これはのLOMに組み込まれ、明確なチューブの中に見ることができずにホモジナイザーを通過する遊離ガスが発生します。この段階で、我々は一般的に、所望であれば、インラインホモジナイザーへのガス流量を減らすことができ、ローラポンプ流量が高いガス画分を作成するために増加させることができるが、シリアル濃縮工程を停止することを選択する。しかし、高度にviscouのエマルジョンは、遠心分離工程のために注射器に引き出すために、より大きな力を必要とし、この方法の収率を低下させることができる。
遠心分離工程は、充填された注射器であっても、シリンダを形成するように、シリンジのプランジャ及び塩基をトランケートする140ミリリットルの注射器を変更することによって促進された。これは大幅に遠心分離機にシリンジのロードとアンロードを容易にします。遠心分離後、注射器は一般的に3層を含有する。 （注射器が機首下げをロードされている注射器の先端近く）最高密度層が使用されていないリン脂質と水相の大部分が含まれています。いくつかの場合において、濁った「破片」は、典型的には、脂質凝集塊を含有する注射器先端部内に見ることができる。我々は、これが実質的プロセスの効率を減少させることを見出したものの基本的な実験のために、この「水相」の内容は、その後の実験のために再利用されてもよい。 （この問題を緩和するには、さらなるリン脂質賦形剤がよい各シリンジ内の各賦形剤のモル比を維持するように注意しながら、リサイクルの前駆体エマルションに添加すること。）中間層は明るい白で、集中のLOMが含まれています。一番下と真ん中の層の間の境界のシャープなラインは一般的にあります。各シリンジの中間層は、後述するように更なる処理のために組み合わせることができる。トップ層は、製造プロセス全体が壊れのLOMから遊離ガスを含んだふわふわの泡が含まれています。上部と下部の層は、典型的には、廃棄されます。遠心分離の間、各シリンジは、処理中に遠心分離機にエマルションの押し出しを防止するために気密シリンジキャップで覆われていることを確認することが重要である。高速で遠心分離を我々が使用した注射器の破砕強度によって制限された。底部および中間層（通常は高いガス画分を含有するエマルジョンを遠心分離されていた場合）の間の境界のシャープなラインを達成するために必要な場合には、遠心分離時間であり得る延長した。濃縮のLOMを組み合わせる気密、三方活栓の使用は、大気汚染を防止するのに有用である。それは、LOMを含む注射器は常に蓋を保ち、任意の周囲の空気がすぐに排出されていることをしていることを確認することも重要である。貯蔵中の空気汚染を制限するために、注射器は、ルアーロックキャップで密封されるべきである。プラスチック注射器はガス透過性であることが知られているので、ガラスや金属シリンジは、長期保存のために好ましいれる。
上述したように、15分間連続濃縮工程に曝さ乳剤は、典型的に70体積％のガスを発揮し、遠心分離により90％のガスに濃縮することができる。 70体積％のエマルションは、最終的に所望されても、我々は、濃縮物からのLOMに組み込まれていないリン脂質を除去するのに有用であると遠心分離を見出した。これはまた、エマルジョンが相分離を達成するために一晩放置することにより達成することができる。 in vivoでの実験のために、私たちはしばしば集中を希釈プラズマLyte AによるのLOMは、追加の未使用のリン脂質やその他の破片を除去するために、再度遠心して、穏やかに混合。過剰の脂質破片を除去するために、必要に応じて、この工程を数回繰り返すことができる。 LOMの中に組み込まれていないリン脂質の注入が原因は、高い注入速度の設定において付与する追加の脂質負荷の望ましくない。
我々は、この製造工程で回避するためにいくつかの一般的な落とし穴を発見した。まず、脂質賦形剤には、新鮮-80℃で保存し、有効期限が切れていない場合に使用すべきである。前駆体溶液が得られたエマルションは、それらのサイズ分布及び最大ガス留分で矛盾しているように、in vivo試験のために再利用されるべきではない、および細菌汚染物、酸化脂質、または脂質塊を含んでいてもよい。エマルションが製造中」の重要な粘度に '達すると第二に、それはもはや効果的にシステムを介してポンピングされず、大規模なガスポケットは、HC内で形成することになるT.高エマルジョン粘度も処理し、注射器に策定するエマルジョンを困難にしている。これらの問題は、最高の（ガス画分が増加するにつれて体積の増加を定量することによって）HCT内のガス分率の増加を測定し、出発体積倍増一旦シリアル濃縮プロセスを停止することによって回避される。
この技術の一つの重要な制限は、空気および最終生成物の細菌汚染の可能性を作成し、連続的なプロセスであることから、これを防止するため、望ましくない遠心分離ステップのための持続的な必要性である。将来的には、シリアル濃縮工程は、バッチ遠心分離の必要性を回避するために、油圧排気系を利用して商業的な薬剤を製造するための単一工程のシステムに修正することができる。 、インラインホモジナイザーおよび実験室ミキサーは、3/16、ステンレス鋼で製造され、代わりに滅菌することができる。システム内の他のガスを含むことは、目を広げることができるさらにこの技術のEユーティリティ。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
資金調達：米国陸軍の医学研究および資材コマンド（USAMRMC）と遠隔医療·先端技術研究センターが管理する。 Shunxi智は、ここで説明したように注射器の変更を貢献した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
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