Summary
Nous décrivons des procédés pour la fabrication de grandes quantités de micro-bulles d'oxygène à base de lipides (OLM) conçus pour la délivrance par voie intraveineuse de l'oxygène en utilisant une homogénéisation à cisaillement élevé et la concentration en série.
Abstract
microbulles remplies de gaz ont été mis au point en tant que contraste ultrasonore et des agents de libération de médicaments. Les microbulles peuvent être produits par traitement à l'aide des tensioactifs sonication, une agitation mécanique, des dispositifs microfluidiques, ou l'homogénéisation. Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour fournir de l'oxygène par voie intraveineuse en cas d'urgence médicale, inversant hypoxémie de la vie en danger, et de prévenir tout dommage ultérieur d'organes, l'arrêt cardiaque et la mort. Nous présentons les méthodes pour la production à l'échelle-up de microbulles hautement oxygénées à l'aide d'une boucle fermée à cisaillement élevé d'homogénéisation. Le processus peut produire 2 L de LOM concentrées (90% en volume) en 90 min. Les bulles résultantes ont un diamètre moyen d'environ 2 pm, et un profil rhéologique conforme à celle du sang lorsqu'il est dilué à 60% en volume. Cette technique produit OLM à haute capacité et à haute pureté de l'oxygène, ce qui suggère que cette technique peut être utile pour les laboratoires de recherche translationnelle.
Introduction
Microbulles composés de protéines, de polymère, et des obus de lipides ont été développés en tant que vecteurs pour l'administration de médicaments, la thérapie génique et les agents de contraste ultrasonores 1-5. Parce que ces utilisations thérapeutiques nécessitent persistance microbulles intravasculaire, ces microbulles sont généralement remplis de gaz moléculaire, de poids élevés inertes tels que les hydrocarbures perfluorés 6, qui ont une faible solubilité dans le sang et stabilisent le 3,4 bulle.
Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour administrer des doses thérapeutiques de l'oxygène, ce qui peut préserver l'apport d'oxygène aux organes cibles et prévenir l'instabilité hémodynamique pendant les périodes d'obstruction des voies respiratoires ou hypoxémie 7. Émulsions conçus pour la livraison de gaz par voie intraveineuse ont besoin de différents éléments de conception que ceux utilisés pour les agents de contraste ultrasonores ou administration ciblée des médicaments. En premier lieu, parce que le corps consomme de grandes quantités de gaz d'oxygène (~ 200 ml / min), OLM doivent être produites etinjecté sur une grande échelle. Il faut pour cela que le procédé de fabrication soit efficace. Deuxièmement, le processus de fabrication doit être en boucle fermée afin d'éviter la contamination de l'azote à travers l'exposition de LOM (qui doit être rempli avec 100% d'oxygène) à l'air ambiant. Troisièmement, parce que le but de LOM est la livraison de gaz par voie intraveineuse, la fraction de gaz de LOM doit être maximisée, en reconnaissant les limites imposées par la viscosité de l'émulsion 7. Enfin, comme avec n'importe quel injectable par voie intraveineuse, un contrôle précis de la distribution de taille des particules est indispensable pour éviter l'obstruction microvasculaire 8.
Il existe plusieurs méthodes établies pour la fabrication de micro-bulles. La sonication utilise une grande intensité, à basse fréquence ultrasonore appliquée à l'interface air-liquide d'une émulsion qui comprend un agent tensio-actif, tel qu'un phospholipide amphipathique, en présence d'un ciel gazeux pour produire des microbulles 7,9. Ce processus peut être commandé en faisant varier ultrala fréquence du son, la puissance et la durée d'impulsion, et la distribution de la taille résultante peuvent être adaptées pour produire des micro-bulles d'une distribution de taille spécifique, bien que la sonication est rarement utilisé dans la fabrication de micro-bulles cliniquement utilisés. Fusion est l'agitation mécanique intense d'un tensioactif et de gaz dans un système fermé, qui est également difficile à l'échelle en place pour accueillir de grands volumes 2. Microfluidique à base de gouttelettes permet un contrôle précis de la distribution de taille des microbulles de 10 à 13. Bien que traditionnellement difficile d'extrapoler, multi-canal, la microfluidique à haut débit ont été décrits qui augmentent l'efficacité de la production de microbulles 13. Microbulles fabriqués en utilisant une de ces méthodes peuvent nécessiter des processus de réduction de la taille de post-production, telles que le fractionnement centrifuge 14,15 et 16,17 microbulles flottation.
Une autre méthode connue pour la fabrication de micro-bulles très stables au cisaillement est homogenization 6, ce qui peut se traduire par un motif hexagonal de phospholipide stabilisateur sur la surface à microbulles 18. S'appuyant sur ce concept, nous décrivons l'incorporation d'un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne pour créer OLM d'auto-assemblage 19. Dans ce processus, l'homogénéisation utilise des lames en rotation rapide à proximité de deux beaux écrans maille émulseur, créant un fort cisaillement mécanique et hydraulique pour la création de micro-bulles. Concentration de série de l'émulsion lipidique à travers ce système produit une fraction de gaz de plus en plus concentrées, qui peuvent être encore plus concentré par centrifugation.
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Protocol
1. Configuration du système
Le système est constitué d'un support et en concentrant réservoir (HCT) équipé d'un mélangeur à un étage, un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne, une pompe à rouleaux pour déplacer le fluide entre le HCT et l'homogénéisateur, et un échangeur de chaleur (figure 1).
- Placez un, large ouverture 4 L récipient de collecte de verre stérilisé équipé de 2 ports de base et 3 ports secondaires sous le mélangeur en une seule étape. Abaissez la tête du batteur jusqu'à l'embouchure de la cuve et assurer un raccord étanche aux gaz en utilisant des joints en caoutchouc ou du ruban adhésif (pour éviter de contaminer l'air ambiant de l'espace de tête).
- Monter un des ports de base (Figure 1, le port n ° 1) du HCT avec stérile 3/8 "(ID) tuyau transparent, environ 10" de long, munie d'un robinet 3 voies à la pointe pour la collecte de l'émulsion concentrée .
- Monter le deuxième port de base (figure 1, le port # 2) stérile 3/8 "(ID) des tubes, approximately 36 "de longueur. Alimenter ce tube à travers une pompe à rouleaux. Monter l'entrée de l'homogénéisateur à cisaillement élevé avec un T-pièces, y compris deux ports et connecter comme suit: connecter les tubes du port n ° 2, à travers la pompe à galet et se connecter au port du côté de la pièce en T. Attachez l'autre orifice à un réservoir d'oxygène en utilisant un débitmètre à faible débit d'oxygène gazeux.
- Connecter le port de sortie du dispositif d'homogénéisation à cisaillement élevé à l'orifice d'entrée d'un échangeur de chaleur en ligne maintenue à 4 ° C. Connecter le port de sortie de l'échangeur de chaleur à l'orifice de retour du HCT (figure 1, le port n ° 3), la création d'un système en boucle fermée.
- Attacher un réservoir d'oxygène (via un débitmètre) au HCT (figure 1, le port # 4). Fixer un écran de composition du gaz qui est ouvert à l'atmosphère à l'orifice supérieur de l'HCT (figure 1, le port n ° 5).
- Si la stérilité est souhaitée, stériliser les composants de verre et de métal avant chaque utilisation par autoclave. Stériliser les composants de tubes et co plastiquennectors par l'oxyde d'éthylène avant chaque utilisation. Ceci est particulièrement important si le produit doit être testé in vivo.
2. LOM Fabrication
- Placer 20 g de GMP 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC) et 10 g de cholestérol à la base du HCT. Ajouter 1 L d'Plasma-Lyte A à l'HCT et mélanger à la main pendant 1 minute, en intégrant autant que possible des lipides en phase aqueuse.
- Abaisser le mélangeur en une seule étape dans la phase aqueuse, en veillant à ce que la tête de mélangeur est entièrement recouverte par la phase aqueuse. Assurez-vous que le haut de la HCT est étanche aux gaz (voir l'étape 1.1 ci-dessus) et qu'il n'y a pas de ports secondaires ouvertes. Allumez la source de gaz connecté au port n ° 4 et attendre jusqu'à ce que la fraction d'oxygène de l'espace libre du HCT atteint> 95%. À 10 L / min (LPM), ce qui devrait prendre ~ 10 min.
- Utilisation de la console en une seule étape, mélanger l'émulsion de précurseur pendant 5 min à 5000 rpm. Le mélange obtenu doit apparaître blanc pâle et ne contiennent pas lipi visibled touffes. Une fois mélangé, le mélange eau-lipide utilisé peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 30 jours avant de l'utiliser seul.
- Premier l'ensemble du système en boucle fermée avec l'émulsion de précurseur en activant la pompe à galet à 1,3 LPM. Une fois que le système est amorcé, garder la pompe à 1,3 LPM.
- Pour commencer la fabrication des OLM, mettez le cisaillement élevé homogénéisateur en ligne à 7500 rpm. Immédiatement par la suite, mettre en marche le flux d'oxygène à la partie d'entrée du dispositif d'homogénéisation à 0,5 LPM. Gardez le mélangeur en une seule étape (dans le HCT) sur à 3500 rpm. LOM sont formées à l'interface des pales de rotor et les écrans d'émulseur au sein de l'homogénéisateur en ligne (figure 2). En quelques minutes, le liquide doit être visiblement plus visqueux. Une approche plus rigoureuse est de déterminer la viscosité en fonction du temps, ce qui peut être fait par prélèvement des aliquotes de Port 1 lors de la fabrication et de l'analyse avec un viscosimètre.
Remarque: si des bulles d'air visibles sont présents dans le tube sortant du mélangeur, de l'oxygèneiront à l'homogénéisateur en ligne est trop élevé. Titrer bas débit de gaz jusqu'à ce que le fluide est opaque et ne contient pas de bulles de gaz visibles. - Faire fonctionner le système pendant 15 min, puis éteignez l'homogénéisation de cisaillement élevé et l'entrée de l'oxygène à elle. Continuez à faire fonctionner le mélangeur en une seule étape dans le HCT jusqu'à l'émulsion est supprimé; atténue cette séparation de phase et maintient le produit relativement uniforme à l'intérieur de la HCT.
Remarque: Le volume de l'émulsion rempli de gaz devrait augmenter d'environ 2 à 3 fois pendant la phase de série de la concentration. Si ce n'est pas, vérifier pour s'assurer que l'oxygène s'écoule dans l'homogénéisateur à cisaillement élevé et que les concentrations de lipides dans l'émulsion de précurseur sont corrects. Efficacité de la production diminue à mesure que diminue la concentration en lipides.
3. Collection, Concentration, l'évaluation, et le stockage des OLM
- Attacher une stérile, modifié 140 ml luer-lock seringue au robinet d'arrêt connecté au port de base n ° 1 sur le récipient de collecte. Dresser 100 ml de liquide. Fermer hermétiquement la seringue et répéter jusqu'à ce que tout le liquide a été retiré.
- Modifier seringues en retirant 100 ml d'air dans la seringue et scier l'excédent piston et matériau de la seringue au-dessus de la marque de 140 ml alors. Remplissez et seringues vides en utilisant une pince à griffes de dresser le piston. Cette modification permet plus facile centrifugation.
- seringues à centrifuger avec la fin plafonné orientée vers le bas dans un réfrigérateur (4 ° C) seau centrifuger à 225 g pendant 10 min.
- Trois couches de matériau apparaissent après centrifugation. Expulser la couche inférieure de l'excès de phase aqueuse trouble et jeter. La seconde couche est blanc lumineux et contient OLM concentrés. Transférer la mousse concentrée pour une seringue étanche aux gaz au moyen d'un robinet à trois voies pour empêcher la contamination du gaz ambiant. Jeter la couche finale, qui contient de l'oxygène libre de LOM rompus.
- la qualité de la mousse peut être évaluée en atteignant ≥ 90% de gaz de la mousse concentré. Calculmangé concentration de gaz de la manière suivante:
Gaz =% en volume [(poids de la mousse / volume de mousse) - 1] x 100- A titre de témoin seconde qualité, de la taille des microbulles par obscurcissement de lumière afin de déterminer si la taille des particules est comprise dans la plage attendue. Il est à noter que le changement dans le temps d'homogénéisation ou de la formulation peut modifier la taille des bulles.
- Fermer hermétiquement la seringue en verre avec un ajustement luer-lock. OLM concentrés peuvent être dilués avec de Plasma-Lyte A au moment de l'utilisation. Les seringues peuvent être stockés à 22, 4, ou -20 ° C; des températures plus froides peuvent fournir une meilleure stabilité durée de vie 7.
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Representative Results
Homogénéisation à cisaillement élevé permet la production efficace (c'est à dire dans un après-midi) de LOM suffisantes pour une étude sur l'animal et ne nécessite pas de compétences techniques. Une fois compétent, jusqu'à 2 litres de concentré OLM peut être fabriqué en 90 min.
taille de microbulles et de la morphologie a été évaluée par microscopie optique et par obscurcissement. Quand un échantillon de 10 pi de OLM a été visualisé, OLM sphériques ont été notés, ainsi qu'une relative rareté des débris lipidique (figure 3A). Cela est particulièrement vrai lorsque le produit est utilisé GMP. Lorsque le même échantillon de LOM a été évaluée par obscurcissement, le diamètre moyen des particules était de 2,624 ± 0,332 um (SD). Plus de 90% des OLM étaient <10 um de diamètre, et la population a été polydisperse (Figure 3B).
viscosité de l'émulsion était fortement dépendante de la fraction de gaz (et donc, sur la concentration de microbulles). Deux ml aliquotesdes OLM de concentrations de gaz différentes ont été étudiés en utilisant un débit de balayage à l'état stable en utilisant une géométrie de plaques parallèles de 40 mm que le stress a varié de 0,1 à 10 000 μN · m. Toutes les fractions de gaz LOM présentent un comportement rhéofluidifiant, et ce phénomène était plus prononcé à des fractions de l'essence. LOM contenant du gaz de 60% en volume présentaient un profil rhéologique similaire à sang (figure 4A).
Enfin, la teneur en oxygène (y compris les fractions de gaz et la concentration fractionnelle de l'oxygène) du OLM a été testée en ajoutant des volumes variables de l'oxygène contenus dans le volume 60% OLM à des aliquotes de sang humain désaturée avec un déficit en oxygène connue. Comme décrit précédemment, la teneur en oxygène du OLM peut être calculée à partir de l'augmentation de la concentration d'oxyhémoglobine 7. La relation entre le volume d'oxygène ajouté dans LOM et l'augmentation volumétrique de la teneur en oxygène du sang était de 1,053 ± 0,03025 (SD) (IC à 95% = 0,9865 à 1,120) (figureure 4B), ce qui suggère que les OLM testés contiennent près de 100% d'oxygène, exposé quelques poches de gaz emprisonnées (qui ne transférer efficacement pas d'oxygène au sang, mais flotter rapidement), et transférer efficacement leur charge en oxygène ensemble au sang humain in vitro.
Figure 1. Fabrication configuration schématique. OLM sont produites en utilisant un, à cisaillement élevé homogénéisateur en ligne dans un système en boucle fermée. OLM sont détenus dans une exploitation et en concentrant réservoir (HCT) sous agitation constante. L'émulsion est déplacée à travers le système en utilisant une pompe à galet. La chaleur générée par l'homogénéisateur est éliminé en utilisant un échangeur de chaleur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ A>
Figure 2. L'auto-assemblage de LOM dans un écran émulseur à mailles fines. A) Une lame en rotation rapide passe sur un écran d'émulseur à mailles fines, créant un effet de siphon qui attire dans les phases aqueuses et gaz. De minuscules bulles d'oxygène sont formées par cisaillement, et sont rapidement entourés par les queues lipidiques hydrophobes des phospholipides amphiphiles, création d'une bulle remplie de gaz auto-assemblage (B).
Figure 3. Caractérisation des OLM. A) Une microphotographie représentative d'OLM sphériques présentant une distribution de taille de polydisperse. Barre d'échelle =10 um. B) la distribution des tailles des OLM évaluée par obscurcissement. Données = moyenne, erreur = SEM.
Figure 4. Propriétés de OLM centrifugés et concentrées. A) Le profil rhéologique d'une émulsion de LOM à 60, le gaz 70 et 90% en volume. La dilution du concentré pour la mousse gazeuse 60% en volume donne un profil rhéologique similaire à du sang humain (à hématocrite de 40%). Données = moyenne, erreur = SEM. B) La relation entre la teneur en oxygène du OLM ajouté à du sang humain et de l'augmentation mesurée de la teneur en oxygène du sang. Données = moyenne, erreur = SEM, ligne = régression linéaire avec IC à 95% de la ligne de meilleur ajustement.
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Discussion
Les étapes les plus importantes à la création concentrés OLM, très oxygénés comprennent: 1) veiller à ce que l'espace libre dans le HCT reste entièrement oxygéné; 2) veiller à ce que la pureté des excipients lipidiques est optimal (y compris les conditions de stockage et d'utilisation des produits BPF); 3) faire en sorte que les lipides en poudre se mélangent complètement avec la phase aqueuse avant l'amorçage du système; et 4) portant une attention particulière à l'augmentation de la fraction de gaz à l'intérieur de la HCT faire en sorte que la fraction volumique de gaz ne dépasse pas 70%.
La méthode que nous décrivons ici utilise homogénéisation à cisaillement élevé pour créer des microbulles creuses. Les lipides amphiphiles sont mises en suspension avec la phase aqueuse, qui est utilisé pour transporter les lipides dans l'homogénéisateur en ligne. Les lipides de qualité GMP sont utilisés pour des études in vivo, et sont généralement préférés parce qu'ils contiennent moins des agrégats lipidiques et les impuretés. Les lipides sont également sujets à l'oxydation des lipides (en particulier lors d'un stockageau sein d'un fluide oxygéné) et la contamination bactérienne. LOM sont formés lorsque les queues hydrophobes arranger autour de petites microbulles de gaz de l'oxygène créé à l'intérieur de l'homogénéisateur en ligne (figure 2). Homogénéisation à 7500 rpm OLM soumet les micro-bulles à des contraintes mécaniques supplémentaires car ils sont fraisées entre les pointes des pales de rotor et la paroi intérieure du stator. OLM subissent également cisaille hydraulique comme ils sont forcés à grande vitesse à travers l'écran mailles ultra-fines émulseur, réduisant encore la taille des particules. Les forces de cisaillement génèrent de la chaleur dans l'homogénéisateur en ligne et sur place à la table de mixage en une seule étape; un échangeur de chaleur en ligne avant le retour à la HCT est nécessaire d'enlever cette chaleur. L'absence d'un échangeur de chaleur peut augmenter les températures supérieures à la température de transition de phase du lipide (55 ° C pendant DSPC), ce qui augmente la fluidité du lipide et entraîne une perte de produit. Création de l'émulsion au sein d'une fermeture, dispositif en ligne permet de s'assurer que oxyge purn est incorporé dans le noyau LOM en prévenant la contamination de l'air. En outre, OLM sont continuellement exposés à la ciel gazeux du HCT. Il est donc impératif de veiller à ce que l'effet d'aspiration créé par le mélangeur de laboratoire à l'intérieur de la HCT ne crée pas une inversion du flux d'air de l'atmosphère dans le HCT (par l'intermédiaire du moniteur de la composition du gaz, qui est ouvert à l'atmosphère pour empêcher la pressurisation du HCT) . Les débits du gaz d'oxygène décrites ici devraient être suffisantes pour empêcher ce phénomène.
Recyclage de l'émulsion à travers l'homogénéisateur en ligne lors de la phase série de concentration crée OLM supplémentaires de phospholipides «inutilisés» reste dans la phase aqueuse, et soumet OLM intactes au cisaillement répétée, qui peut en outre diminuer la taille des particules aussi. La taille des particules et la concentration de gaz peut donc être adaptée en ajustant la vitesse de mixage, émulseur écrans, maillage, et le temps d'exécution (c.-à-durée de la série Concentration étape). Une agitation mécanique produit une distribution de taille de polydisperse. La distribution de taille large permet de garnissage serré de microbulles, ce qui augmente la fraction de gaz encapsulé maximale dans un volume donné de mousse. La modification de la chimie de formulation par l'inclusion des agents augmentant la viscosité peut être utilisée pour créer une distribution de taille plus homogène si on le souhaite. Nous avons trouvé que le temps d'exécution de 15 minutes est le plus idéal; en tant que concentration de microbulles augmente, l'émulsion devient de plus en plus visqueux. Une fois qu'il atteint une viscosité critique, il n'est plus effectivement pompé en utilisant une pompe à rouleaux. Cela provoque gaz sans passer par l'homogénéisateur sans être incorporé dans les LOM et peut être vu dans le tuyau transparent. A ce stade, nous choisissons généralement pour arrêter l'étape de série de la concentration, mais si on le souhaite, le taux dans l'homogénéisateur en ligne écoulement de gaz peut être diminué et la vitesse d'écoulement de la pompe à galet peut être augmentée pour créer des fractions de gaz plus élevés. Cependant, très viscous émulsions nécessitent plus de force à se retirer dans des seringues pour l'étape de centrifugation, et peuvent diminuer le rendement de ce procédé.
L'étape de centrifugation a été facilitée par la modification de 140 ml seringues pour tronquer le piston et la base de la seringue, de sorte que seringues remplies forment un cylindre même. Ceci facilite grandement le chargement et le déchargement des seringues dans la centrifugeuse. Après la centrifugation, les seringues contiennent typiquement trois couches. La couche la plus dense (près de l'embout de seringue lorsque des seringues sont chargées en piqué) contient des phospholipides non utilisés et la majeure partie de la phase aqueuse. Dans certains cas, nuageux «débris» peut être vu dans le bout de la seringue qui contient généralement des amas lipidiques. Pour les expériences de base, le contenu de cette «phase aqueuse» peuvent être réutilisés pour des expériences ultérieures, même si nous avons constaté que cela diminue considérablement l'efficacité du processus. (Pour pallier ce problème, les excipients phospholipides supplémentaires peutajouter à l'émulsion de précurseur recyclé, en prenant soin de maintenir le rapport molaire de chaque excipient.) La couche intermédiaire à l'intérieur de chaque seringue est blanche et brillante et contient OLM concentrées. Il est généralement une ligne de démarcation nette entre le fond et les couches moyennes. La couche intermédiaire de chaque seringue peut être combiné à un traitement ultérieur, comme décrit ci-dessous. La couche supérieure contient une mousse duveteuse contenant du gaz libre de LOM brisées au long du processus de fabrication. Les couches supérieure et inférieure sont généralement jetés. Lors de la centrifugation, il est important de veiller à ce que chaque seringue est recouverte d'un capuchon de seringue étanche afin d'empêcher l'extrusion de l'émulsion dans la centrifugeuse pendant le traitement. Centrifugation à grande vitesse a été limitée par la résistance à l'écrasement des seringues, nous avons utilisé. Si nécessaire pour atteindre une ligne de démarcation nette entre les couches inférieures et moyennes (généralement lorsque émulsions contenant fraction élevée de gaz ont été centrifugés), le temps de centrifugation peut êtreétendu. Utilisation d'un, robinet à 3 voies étanche aux gaz de combiner les OLM concentrés est utile pour prévenir la contamination de l'air. Il est également important de veiller à ce que les seringues contenant LOM sont toujours maintenus écrêtée et que tout l'air ambiant est expulsé immédiatement. Pour limiter la contamination de l'air au cours du stockage, les seringues doivent être scellés avec des bouchons luer-lock seulement. Les seringues en plastique sont connus pour être perméable aux gaz, de sorte que les seringues en verre ou en métal sont préférables pour le stockage à long terme.
Comme décrit ci-dessus, les emulsions exposées à l'étape de concentration en série pendant 15 minutes présentent typiquement du gaz de 70% en volume et peuvent être concentrés à 90% de gaz par centrifugation. Même si 70% en volume émulsion est souhaitée à la fin, nous avons trouvé une centrifugation pour être utile pour éliminer les phospholipides qui ne sont pas incorporés dans les OLM de concentré. Ceci peut également être accompli en permettant emulsions reposer pendant une nuit pour obtenir la séparation de phase. Pour les expériences in vivo, nous dilue souvent concentréOLM avec Plasma-Lyte A, mélanger doucement, puis centrifuger à nouveau pour éliminer les phospholipides inutilisés supplémentaires et d'autres débris. Cette étape peut être répétée plusieurs fois si nécessaire pour éliminer les débris des lipides en excès. L'injection de phospholipides qui ne sont pas incorporés dans les LOM n'est pas souhaitable en raison de la charge lipidique supplémentaire qu'ils confèrent à la fixation d'un débit de perfusion élevé.
Nous avons trouvé plusieurs pièges courants à éviter dans ce processus de fabrication. Tout d'abord, les excipients lipidiques doivent être fraîches, stocké à -80 ° C, et n'est pas utilisé si expiré. La solution de précurseur ne doit pas être réutilisé pour des études in vivo, sous forme d'émulsions obtenues sont incompatibles dans leur distribution de taille et la fraction maximale du gaz, et peut contenir des contaminants bactériens, des lipides oxydés, ou des touffes de lipides. Deuxièmement, une fois l'émulsion atteint «viscosité critique» lors de la fabrication, il ne sera plus être pompé efficacement par le système, et de grandes poches de gaz se forment dans le HCT. La forte viscosité de l'émulsion permet aussi l'émulsion difficile à manipuler et à établir dans des seringues. Ces problèmes sont à éviter, par mesure de l'augmentation de la fraction de gaz à l'intérieur de la HCT (par la quantification de l'augmentation de volume en tant que la fraction de gaz augmente) et l'arrêt du processus de concentration en série une fois le double du volume de départ.
Une limitation essentielle de cette technique est la nécessité persistante pour une étape de centrifugation, ce qui est indésirable, car il crée le risque de contamination bactérienne de l'air et du produit final, et ceci empêche d'être un processus continu. Dans le futur, l'étape de concentration de série peut être modifié en un système à une seule étape pour la fabrication de médicaments du commerce en utilisant un système d'évacuation hydraulique pour éviter le recours à la centrifugation par lot. L'homogénéisateur en ligne et mélangeurs de laboratoire peuvent être fabriqués en acier inoxydable de 3/16 et stérilisés en place. L'inclusion d'autres gaz dans le système peut élargir èmee utilité de cette technique plus loin.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Financement: US Army Research & Medical Materiel Command (USAMRMC) et géré par la télémédecine et avancée Technology Research Center. Shunxi Ji a contribué à la modification des seringues comme décrit ici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
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