Summary
हम उच्च कतरनी homogenization और धारावाहिक एकाग्रता का उपयोग कर नसों में ऑक्सीजन प्रसव के लिए डिजाइन लिपिड आधारित ऑक्सीजन microbubbles (LOMs) की बड़ी मात्रा के निर्माण के लिए विधियों का वर्णन.
Abstract
गैस से भरे microbubbles अल्ट्रासाउंड विपरीत और दवा वितरण के एजेंट के रूप में विकसित किया गया है. Microbubbles sonication, मैकेनिकल आंदोलन, microfluidic उपकरणों, या homogenization का उपयोग surfactants प्रसंस्करण द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. हाल ही में, लिपिड आधारित ऑक्सीजन microbubbles (LOMs) जीवन के लिए खतरा hypoxemia पीछे, चिकित्सा आपात स्थिति के दौरान नसों ऑक्सीजन देने के लिए तैयार है, और बाद में अंग चोट, हृदय की गिरफ्तारी, और मौत को रोकने के लिए किया गया है. हम एक बंद लूप उच्च कतरनी homogenizer का उपयोग अत्यधिक oxygenated microbubbles के स्केल अप उत्पादन के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. प्रक्रिया 90 मिनट में केंद्रित LOMs के 2 एल (मात्रा से 90%) का उत्पादन कर सकते हैं. परिणामस्वरूप बुलबुले रक्त की कि 60 वॉल्यूम% तक पतला जब साथ संगत ~ 2 माइक्रोन का एक मतलब व्यास, और एक rheologic प्रोफ़ाइल है. यह तकनीक इस तकनीक शोधों प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी हो सकता है, सुझाव है कि उच्च क्षमता में और उच्च ऑक्सीजन पवित्रता के साथ LOMs पैदा करता है.
Introduction
प्रोटीन, पॉलिमर, और लिपिड के गोले से बना microbubbles दवा वितरण के लिए वैक्टर, जीन थेरेपी, और अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों 1-5 के रूप में विकसित किया गया है. इन चिकित्सीय का उपयोग करता intravascular microbubble दृढ़ता की आवश्यकता होती है, क्योंकि ऐसा microbubbles आमतौर पर इस तरह के रक्त में कम विलेयता है और बुलबुला 3,4 स्थिर जो perfluorocarbons 6, के रूप में निष्क्रिय, उच्च आणविक वजन गैसों से भर रहे हैं.
हाल ही में, लिपिड आधारित ऑक्सीजन microbubbles (LOMs) अंत अंग ऑक्सीजन प्रसव के संरक्षण और airway बाधा या hypoxemia 7 की अवधि के दौरान hemodynamic अस्थिरता रोक सकता है जो ऑक्सीजन का चिकित्सीय खुराक देने के लिए डिजाइन किया गया है. नसों में गैस वितरण के लिए तैयार emulsions अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों या लक्षित दवा वितरण के लिए इस्तेमाल की तुलना में अलग डिजाइन सुविधाओं की आवश्यकता होती है. शरीर ऑक्सीजन गैस (~ 200 मिलीग्राम / मिनट) के लिए बड़ी मात्रा में सेवन करती है, क्योंकि सबसे पहले, LOMs उत्पादन किया है और किया जाना चाहिएएक बड़े पैमाने पर इंजेक्शन. इस निर्माण प्रक्रिया कुशल होने की आवश्यकता है. दूसरा, विनिर्माण प्रक्रिया हवा परिवेश (100% ऑक्सीजन से भरा होना चाहिए) LOMs के प्रदर्शन के माध्यम से नाइट्रोजन संक्रमण से बचने के क्रम में बंद लूप होना चाहिए. LOMs के उद्देश्य नसों में गैस वितरण है क्योंकि तीसरा, LOMs की गैस अंश पायस चिपचिपापन 7 द्वारा लगाया सीमाओं को पहचानने, अधिकतम करना चाहिए. अंत में, किसी भी नसों में इंजेक्शन के साथ के रूप में, कण आकार के वितरण पर सटीक नियंत्रण microvascular रुकावट 8 से बचने के लिए आवश्यक है.
Microbubble निर्माण के लिए कई तरीकों की स्थापना कर रहे हैं. Sonication उच्च तीव्रता का इस्तेमाल, कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड microbubbles 7,9 निर्माण करने के लिए एक गैस headspace की उपस्थिति में इस तरह के एक amphipathic फॉस्फोलिपिड के रूप में एक surfactant, भी शामिल है, जो एक पायस की हवा द्रव इंटरफ़ेस करने के लिए आवेदन किया. इस प्रक्रिया अल्ट्रा अलग से चलाया हुआ हैsonication शायद ही कभी चिकित्सकीय इस्तेमाल किया microbubbles के निर्माण में प्रयोग किया जाता है, हालांकि ध्वनि आवृत्ति, बिजली और नाड़ी की अवधि, और जिसके परिणामस्वरूप आकार के वितरण, एक विशिष्ट आकार के वितरण की microbubbles उत्पादन के अनुरूप किया जा सकता है. समामेलन बड़ी मात्रा 2 को समायोजित करने के लिए पैमाने पर करने के लिए भी मुश्किल है जो एक बंद व्यवस्था में एक surfactant और गैस का तीव्र यांत्रिक आंदोलन है. छोटी बूंद आधारित microfluidics microbubble आकार वितरण 10-13 की सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है. परंपरागत रूप से कठिन पैमाने पर करने हालांकि, मल्टी चैनल, उच्च गति microfluidics microbubble उत्पादन क्षमता में 13 वृद्धि जो वर्णन किया गया है. इन तरीकों में से किसी का उपयोग कर निर्मित microbubbles ऐसे केन्द्रापसारक fractionation 14,15 और microbubble प्लवनशीलता 16,17 के बाद के निर्माण आकार में कमी प्रक्रियाओं, आवश्यकता हो सकती है.
अत्यधिक स्थिर microbubbles के निर्माण के लिए एक और स्थापित विधि कतरनी homogeniz हैmicrobubble सतह 18 पर एक स्थिर हेक्सागोनल फॉस्फोलिपिड पैटर्न में परिणाम कर सकते हैं, जो व्यावहारिक 6,. इस अवधारणा पर बिल्डिंग, हम स्वयं कोडांतरण LOMs 19 बनाने के लिए एक में लाइन उच्च कतरनी homogenizer के समावेश का वर्णन. इस प्रक्रिया में, homogenizer तेजी microbubbles के निर्माण के लिए उच्च यांत्रिक और हाइड्रोलिक कतरनी बनाने, दोहरी ठीक जाल emulsor स्क्रीन के पास ब्लेड घूर्णन का इस्तेमाल करता. इस प्रणाली के माध्यम से लिपिड पायस के सीरियल एकाग्रता और आगे भी centrifugation द्वारा केंद्रित किया जा सकता है जो एक तेजी से ध्यान केंद्रित गैस अंश, पैदावार.
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Protocol
1. सिस्टम सेट अप
प्रणाली एक ही मंच मिक्सर, एक में लाइन उच्च कतरनी homogenizer, HCT और homogenizer के बीच तरल पदार्थ ले जाने के लिए एक रोलर पंप, और एक गर्मी एक्सचेंजर (चित्रा 1) के साथ लगे एक होल्डिंग और टैंक ध्यान केंद्रित (HCT) के होते हैं.
- एकल चरण मिक्सर के नीचे 2 आधार बंदरगाहों और 3 पक्ष बंदरगाहों के साथ लगे एक निष्फल, चौड़े मुँह 4 एल कांच संग्रह पोत रखें. पोत के मुंह को मिक्सर सिर को कम और (सिर अंतरिक्ष contaminating से परिवेशी वायु को रोकने के क्रम में) रबर सील या टेप का उपयोग कर एक गैस टाइट फिटिंग करता है.
- बाँझ 3/8 के साथ HCT की (चित्रा 1, पोर्ट # 1) आधार बंदरगाहों में से एक फिट '(आईडी) स्पष्ट ट्यूबिंग, लगभग 10 "लंबे, केंद्रित पायस के संग्रह के लिए नोक पर एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के साथ फिट .
- दूसरा आधार बंदरगाह बाँझ 3/8 के साथ (चित्रा 1, पोर्ट # 2) "(आईडी) ट्यूबिंग, approximatel फ़िटलंबाई में Y 36 ". एक रोलर पंप के माध्यम से इस ट्यूबिंग फ़ीड. दो बंदरगाहों सहित एक टी टुकड़े के साथ उच्च कतरनी homogenizer के इनलेट फिट और के रूप में कनेक्ट: रोलर पंप के माध्यम से, पोर्ट # 2 से ट्यूबिंग कनेक्ट और टी टुकड़ा की ओर पोर्ट से कनेक्ट. एक कम प्रवाह ऑक्सीजन गैस flowmeter का उपयोग कर एक ऑक्सीजन टैंक के लिए अन्य बंदरगाह देते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक में लाइन हीट एक्सचेंजर के प्रवेश बंदरगाह के लिए उच्च कतरनी homogenizer के आउटलेट बंदरगाह से कनेक्ट एक बंद लूप सिस्टम बनाने, HCT की वापसी बंदरगाह (चित्रा 1, बंदरगाह # 3) को हीट एक्सचेंजर की दुकान के पोर्ट से कनेक्ट करें.
- HCT (एक flowmeter) के माध्यम से एक ऑक्सीजन टैंक संलग्न (चित्रा 1, बंदरगाह # 4). HCT के शीर्ष बंदरगाह (चित्रा 1, बंदरगाह # 5) के लिए वातावरण के लिए खुला है कि एक गैस रचना की निगरानी संलग्न करें.
- बाँझपन वांछित है, आटोक्लेव द्वारा प्रत्येक उपयोग से पहले कांच और धातु घटकों बाँझ. ट्यूबिंग उपकरणों और प्लास्टिक सह जीवाणुरहितप्रत्येक उपयोग से पहले ethylene ऑक्साइड से nnectors. उत्पाद vivo में परीक्षण किया जाना है अगर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
2. LOM निर्माण
- जीएमपी 1,2-distearoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine (DSPC) और HCT के आधार में कोलेस्ट्रॉल की 10 ग्राम की 20 ग्राम रखें. जलीय चरण में जितना संभव हो उतना लिपिड को एकीकृत, 1 मिनट के लिए HCT और हाथ हलचल को प्लाज्मा Lyte एक की 1 एल जोड़ें.
- पूरे मिक्सर सिर जलीय चरण द्वारा कवर किया जाता है यह सुनिश्चित करना कि जलीय चरण में ही मंच मिक्सर कम करें. HCT के ऊपर तंग गैस है (ऊपर 1.1 कदम देखें) और कोई खुला पक्ष बंदरगाहों रहे हैं कि सुनिश्चित करें. पोर्ट # 4 से जुड़ी गैस स्रोत पर बारी और HCT headspace की ऑक्सीजन अंश> 95% तक पहुँच जाता है जब तक प्रतीक्षा करें. 10 एल / मिनट (LPM) में, यह ~ 10 मिनट में लेना चाहिए.
- एकल चरण मिक्सर का प्रयोग, 5000 rpm पर 5 मिनट के लिए अग्रदूत पायस मिश्रण. जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण पीला सफेद दिखाई देते हैं और कोई दिखाई लिपि को शामिल करना चाहिएडी clumps. एक बार मिला, अप्रयुक्त लिपिड पानी के मिश्रण एकल उपयोग करने से पहले करने के लिए 30 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- प्रधानमंत्री 1.3 LPM पर रोलर पंप पर बदल कर अग्रदूत पायस के साथ पूरे बंद लूप सिस्टम. प्रणाली primed है एक बार, 1.3 LPM पर पर पंप रखना.
- LOMs का निर्माण शुरू करने के लिए, 7500 rpm के लिए लाइन में उच्च कतरनी homogenizer पर बारी. इसके तत्काल बाद, 0.5 LPM पर homogenizer के इनलेट भाग को ऑक्सीजन का प्रवाह मोड़ पर. 3,500 rpm पर पर (HCT में) एक मंच मिक्सर रखें. LOMs में लाइन homogenizer (चित्रा 2) के भीतर रोटर ब्लेड और emulsor स्क्रीन के इंटरफेस में गठन कर रहे हैं. मिनट के भीतर, द्रव दिख अधिक चिपचिपा हो जाना चाहिए. एक और अधिक कठोर दृष्टिकोण निर्माण के दौरान पोर्ट 1 से aliquots को हटाने और एक viscometer साथ विश्लेषण करके किया जा सकता है, जो समय के एक समारोह के रूप में चिपचिपापन निर्धारित करने के लिए है.
नोट: दिखाई हवाई बुलबुले मिक्सर, ऑक्सीजन बाहर निकलने ट्यूबिंग में मौजूद हैंमें लाइन homogenizer के प्रवाह बहुत अधिक है. तरल पदार्थ अपारदर्शी है और कोई दिखाई गैस बुलबुले होता है जब तक गैस का प्रवाह नीचे टाइट्रेट. - 15 मिनट के लिए सिस्टम को चलाने के लिए, और फिर इसे करने के लिए उच्च कतरनी homogenizer और ऑक्सीजन प्रवेश बंद कर देते हैं. पायस निकाले जाने तक HCT में एक मंच मिक्सर चलाने के लिए जारी; इस चरण जुदाई mitigates और HCT भीतर अपेक्षाकृत समान उत्पाद रहता है.
नोट: गैस से भरे पायस की मात्रा धारावाहिक एकाग्रता चरण के दौरान लगभग 2-3X में वृद्धि करनी चाहिए. यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच नहीं करता है, तो उस ऑक्सीजन उच्च कतरनी homogenizer में बह रही है और अग्रदूत पायस में है कि लिपिड सांद्रता सही हैं. लिपिड एकाग्रता कम हो जाती है के रूप में उत्पादन की क्षमता कम हो जाती है.
3. संग्रह, एकाग्रता, आकलन, और LOMs का भंडारण
- एक बाँझ संलग्न करें, संग्रह पोत के आधार पर पोर्ट # 1 से जुड़ी पानी निकलने की टोंटी को 140 मिलीलीटर luer ताला सिरिंज संशोधित. 10 ड्रातरल पदार्थ के 0 मिलीलीटर. सभी तरल पदार्थ निकाल दिया गया है जब तक कसकर सिरिंज और दोहराने टोपी.
- सिरिंज में हवा की 100 मिलीलीटर वापस लेने और फिर 140 मिलीलीटर के निशान से ऊपर अतिरिक्त सवार और सिरिंज सामग्री बंद काटने का कार्य द्वारा सीरिंज सुधारे. भरें और सवार को आकर्षित करने के लिए दांतेदार संदंश का उपयोग कर खाली सीरिंज. इस संशोधन आसान centrifugation की अनुमति देता है.
- 10 मिनट के लिए 225 XG पर एक प्रशीतित (4 डिग्री सेल्सियस) बाल्टी अपकेंद्रित्र में नीचे की ओर उन्मुख छाया हुआ अंत के साथ अपकेंद्रित्र सीरिंज.
- सामग्री के तीन परतों Centrifugation के बाद दिखाई देगा. अतिरिक्त रूप से बादल जलीय चरण के नीचे की परत को निष्कासित और त्यागें. दूसरी परत सफेद चमकदार है और केंद्रित LOMs होता है. परिवेश गैस प्रदूषण को रोकने के लिए एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी का उपयोग कर एक गैस अभेद्य सिरिंज केंद्रित करने के लिए फोम स्थानांतरण. उठी LOMs से मुक्त ऑक्सीजन गैस शामिल हैं जो अंतिम परत, त्यागें.
- फोम गुणवत्ता केंद्रित फोम के ≥ 90% गैस तक पहुँचने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता. Calculके रूप में निम्नानुसार गैस एकाग्रता खाया:
वॉल्यूम% गैस = [(फोम वजन / फोम मात्रा) - 1] x 100- कण आकार अपेक्षित श्रेणी में है अगर एक दूसरे गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में, प्रकाश ग्रहण द्वारा आकार microbubbles निर्धारित करने के लिए. यह homogenization के समय या तैयार करने में एक परिवर्तन बुलबुला आकार को बदल सकता है ध्यान दिया जाना चाहिए.
- कसकर एक luer ताला फिटिंग के साथ कांच सिरिंज टोपी. केंद्रित LOMs उपयोग के समय प्लाज्मा Lyte एक साथ पतला किया जा सकता है. सीरिंज 22, 4 में संग्रहीत, या किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस; ठंडा तापमान बढ़ाया शैल्फ जीवन स्थिरता 7 उपलब्ध करा सकता है.
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Representative Results
उच्च कतरनी homogenization एक जानवर अध्ययन के लिए पर्याप्त LOMs के कुशल (एक दोपहर भीतर यानी) के उत्पादन में सक्षम बनाता है और तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है. एक बार जब प्रवीण, केंद्रित LOMs के ऊपर से 2 एल 90 मिनट में निर्मित किया जा सकता.
Microbubble आकार और आकृति विज्ञान प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा और प्रकाश ग्रहण द्वारा मूल्यांकन किया गया था. LOMs की एक 10 μl नमूना कल्पना की गई थी, गोलाकार LOMs उल्लेख किया है, साथ ही लिपिड मलबे के एक रिश्तेदार कमी (चित्रा 3) थे. जीएमपी उत्पाद का उपयोग किया जाता है जब यह विशेष रूप से सच है. LOMs का ही नमूना प्रकाश ग्रहण द्वारा मूल्यांकन किया गया था, मतलब कण व्यास 2.624 ± 0.332 मीटर (एसडी) था. LOMs के 90% से अधिक <व्यास में 10 माइक्रोन थे, और जनसंख्या polydisperse (3B चित्रा) था.
पायस चिपचिपापन (microbubble एकाग्रता पर, और इसलिए) भारी गैस अंश पर निर्भर था. दो मिलीलीटर aliquotsबदलती गैस सांद्रता के LOMs के तनाव 0.1 से 10,000 μN के लिए विविध किया गया था के रूप में एम · एक 40 मिमी समानांतर थाली ज्यामिति का उपयोग कर एक स्थिर राज्य प्रवाह झाड़ू का उपयोग कर अध्ययन किया गया. सभी LOM गैस भिन्न कतरनी-thinning व्यवहार प्रदर्शन, और इस घटना सबसे ज्यादा गैस अंशों में स्पष्ट किया गया था. 60 मात्रा% गैस युक्त LOMs रक्त के समान rheological प्रोफाइल (चित्रा -4 ए) का प्रदर्शन किया.
अंत में, LOMs की (गैस अंश और ऑक्सीजन की आंशिक एकाग्रता सहित) ऑक्सीजन सामग्री एक ज्ञात ऑक्सीजन की कमी के साथ desaturated मानव रक्त की aliquots 60 वॉल्यूम% LOMs भीतर निहित ऑक्सीजन के अलग संस्करणों जोड़कर परीक्षण किया गया था. पहले से वर्णित है, LOMs की ऑक्सीजन सामग्री आक्सीहीमोग्लोबिन एकाग्रता 7 में वृद्धि से गणना की जा सकती. LOMs भीतर गयी ऑक्सीजन की मात्रा और रक्त की ऑक्सीजन सामग्री में बड़ा वृद्धि के बीच संबंध 1.053 ± 0.03025 (एसडी) (95% सीआई = .9865-1.120) (चित्र थाure 4 बी), परीक्षण किया LOMs लगभग 100% ऑक्सीजन निहित, सुझाव है कि (कुशलतापूर्वक खून में ऑक्सीजन हस्तांतरण, लेकिन तेजी से बाहर नाव नहीं है) कुछ फंस गैस जेब का प्रदर्शन किया, और प्रभावी ढंग से इन विट्रो में मानव रक्त के लिए अपनी पूरी ऑक्सीजन पेलोड हस्तांतरण.
चित्रा 1. सेटअप योजनाबद्ध विनिर्माण. LOMs एक बंद लूप सिस्टम में एक में लाइन, उच्च कतरनी homogenizer का उपयोग कर उत्पादन कर रहे हैं. LOMs एक होल्डिंग के भीतर आयोजित की और लगातार मिश्रण के तहत टैंक (HCT) ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. पायस एक रोलर पंप का उपयोग कर प्रणाली के माध्यम से ले जाया जाता है. Homogenizer से उत्पन्न गर्मी हीट एक्सचेंजर का उपयोग कर हटा दिया जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. </ A>
एक ठीक जाल emulsor स्क्रीन भीतर LOMs की चित्रा 2. स्व विधानसभा. ए) एक तेजी से घूर्णन ब्लेड जलीय और गैस चरणों में खींचता है कि एक अपनाना प्रभाव बनाने, एक ठीक जाल emulsor स्क्रीन के ऊपर से गुजरता है. टिनी ऑक्सीजन बुलबुले कतरनी द्वारा गठित कर रहे हैं, और जल्दी से एक स्वयं कोडांतरण गैस से भरे बुलबुला (बी) बनाने, amphipathic phospholipids के हाइड्रोफोबिक लिपिड पूंछ से घिरे हैं.
LOMs. ए) एक polydisperse आकार के वितरण का प्रदर्शन गोलाकार LOMs का एक प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ की चित्रा 3. विशेषता. स्केल बार =10 माइक्रोन. बी) का आकार प्रकाश ग्रहण द्वारा मूल्यांकन के रूप में LOMs का वितरण. डेटा =, त्रुटि = SEM मतलब है.
चित्रा 4. Centrifuged और केंद्रित LOMs के गुण. ए) 60 में एक LOM पायस के rheological प्रोफाइल, 70 और 90 वॉल्यूम% गैस. 60 मात्रा% गैस केंद्रित करने के लिए फोम के कमजोर पड़ने मानव रक्त के समान rheological प्रोफाइल (hematocrit 40%) अर्जित करता है. डेटा =, त्रुटि = SEM मतलब है. बी) LOMs की ऑक्सीजन सामग्री के बीच संबंध मानव रक्त और रक्त की ऑक्सीजन सामग्री में मापा बढ़ाने के लिए जोड़ा. डेटा = मतलब, त्रुटि = SEM, रेखा = सबसे फिट लाइन के 95% सीआई के साथ रेखीय प्रतिगमन.
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Discussion
केंद्रित, अत्यधिक oxygenated LOMs बनाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: 1) HCT भीतर headspace पूरी तरह से ऑक्सीजन युक्त रहता है यह सुनिश्चित करना कि; 2) लिपिड excipients की शुद्धता () भंडारण की स्थिति और जीएमपी उत्पादों के उपयोग सहित इष्टतम है कि यह सुनिश्चित करना; 3) पाउडर लिपिड प्रणाली भड़काना के लिए पहले जलीय चरण के साथ पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करना है कि; और 4) गैस की मात्रा अंश 70% से अधिक नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए HCT भीतर गैस अंश में वृद्धि करने के लिए करीब ध्यान दे.
हम यहाँ वर्णन विधि खोखला microbubbles बनाने के लिए उच्च कतरनी homogenization का इस्तेमाल करता. Amphipathic लिपिड में लाइन homogenizer में लिपिड ले जाने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो जलीय चरण, साथ निलंबित कर रहे हैं. जीएमपी ग्रेड लिपिड vivo अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, और वे कम लिपिड समुच्चय और दोष होते हैं, क्योंकि आम तौर पर पसंद कर रहे हैं. संग्रहित खासकर जब लिपिड (भी लिपिड ऑक्सीकरण के अधीन हैंएक ऑक्सीजन तरल पदार्थ के भीतर) और बैक्टीरियल संक्रमण. हाइड्रोफोबिक पूंछ में लाइन homogenizer (चित्रा 2) के भीतर बनाया आसपास छोटे ऑक्सीजन गैस microbubbles व्यवस्था जब LOMs गठन कर रहे हैं. वे रोटर ब्लेड और stator की भीतरी दीवार के सुझावों के बीच milled हैं के रूप में 7,500 rpm पर LOMs homogenizing अतिरिक्त यांत्रिक तनाव को microbubbles विषयों. वे आगे कण आकार को कम करने, अल्ट्रा ठीक जाल emulsor स्क्रीन के माध्यम से उच्च वेग पर मजबूर कर रहे हैं के रूप में LOMs भी हाइड्रोलिक कतरनी गुजरना. कतरनी बलों में लाइन homogenizer भीतर और स्थानीय स्तर पर एक मंच मिक्सर में गर्मी पैदा; HCT में लौटने से पहले एक में लाइन हीट एक्सचेंजर इस गर्मी दूर करने के लिए आवश्यक है. एक हीट एक्सचेंजर की अनुपस्थिति उत्पाद घटाने में लिपिड और परिणामों की तरलता बढ़ जाती है जो लिपिड (DSPC के लिए 55 डिग्री सेल्सियस), के चरण संक्रमण तापमान ऊपर तापमान बढ़ा सकते हैं. एक बंद भीतर पायस के निर्माण में ऑनलाइन युक्ति सुनिश्चित करता है कि शुद्ध oxygen वायु प्रदूषण को रोकने के द्वारा LOM कोर में शामिल किया है. इसके अलावा, LOMs लगातार HCT की गैसीय headspace के साथ सामने आ रहे हैं. यह HCT भीतर प्रयोगशाला मिक्सर के द्वारा बनाई गई सक्शन प्रभाव (HCT के दबाव को रोकने के लिए वातावरण के लिए खुला है जो गैस रचना की निगरानी के माध्यम से,) HCT में वातावरण से airflow के एक उलट पैदा नहीं करता है यह सुनिश्चित करने के लिए इसलिए जरूरी है . यहाँ वर्णित ऑक्सीजन गैस प्रवाह दर इस घटना को रोकने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
धारावाहिक एकाग्रता चरण के दौरान लाइन में homogenizer के माध्यम से पायस के पुनर्चक्रण जलीय चरण में शेष 'अप्रयुक्त' phospholipids, से अतिरिक्त LOMs बनाता है और आगे भी कण आकार में कमी आ सकती है, जो दोहराया बाल काटना, को बरकरार LOMs विषयों. कण आकार और गैस एकाग्रता इसलिए emulsor स्क्रीन, जाल आकार, और धारावाहिक सी के चलाने के समय (यानी अवधि, मिक्सर गति का समायोजन करके अनुरूप किया जा सकता हैoncentration कदम). यांत्रिक आंदोलन एक polydisperse आकार वितरण पैदा करता है. विस्तृत आकार वितरण जिससे फोम की एक निश्चित मात्रा में अधिकतम समझाया गैस अंश बढ़ रही है, microbubbles की तंग पैकिंग के लिए अनुमति देता है. शामिल किए जाने चिपचिपाहट बढ़ाने एजेंटों द्वारा तैयार रसायन शास्त्र में फेरबदल अगर वांछित एक अधिक समरूप आकार वितरण बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम 15 मिनट की एक रन समय सबसे आदर्श है कि मिल गया है; microbubble एकाग्रता बढ़ जाती है, पायस तेजी से चिपचिपा हो जाता है. यह एक महत्वपूर्ण चिपचिपापन में पहुँचता है, यह अब प्रभावी रूप से एक रोलर पंप का उपयोग कर पंप है. इस LOMs में शामिल किया जा रहा है और स्पष्ट ट्यूबिंग भीतर देखा जा सकता है बिना homogenizer के माध्यम से पारित करने के लिए नि: शुल्क गैस का कारण बनता है. अगर वांछित, में लाइन homogenizer में गैस का प्रवाह दर को कम किया जा सकता है और रोलर पंप प्रवाह दर अधिक गैस भिन्न बनाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, हालांकि इस स्तर पर, हम आम तौर पर, धारावाहिक एकाग्रता कदम को रोकने के लिए चुनाव करते हैं. हालांकि, अत्यधिक viscouएस emulsions centrifugation कदम के लिए सीरिंज में वापस लेने के लिए अधिक बल की आवश्यकता होती है, और इस प्रक्रिया की उपज कम हो सकता है.
भरे सीरिंज एक भी सिलेंडर फार्म इतना है कि centrifugation कदम, सिरिंज के सवार और आधार काटना 140 मिलीलीटर सीरिंज को संशोधित करने से मदद की गई है. यह बहुत अपकेंद्रित्र में लोड हो रहा है और सीरिंज की उतराई की सुविधा. Centrifugation के बाद, सीरिंज आम तौर पर तीन परतों के होते हैं. (सीरिंज नाक डाउन लोड कर रहे हैं जब सिरिंज टिप के पास) सघनतम परत अप्रयुक्त phospholipids और जलीय चरण के थोक शामिल हैं. कुछ मामलों में, बादल 'मलबे' आम तौर पर लिपिड clumps होता है जो सिरिंज टिप के भीतर देखा जा सकता है. हम यह काफी हद तक इस प्रक्रिया की दक्षता कम हो पाया है कि हालांकि बुनियादी प्रयोगों के लिए, इस 'जलीय चरण' की सामग्री, बाद के प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है. (इस समस्या को कम करने के लिए, अतिरिक्त फॉस्फोलिपिड excipients मईप्रत्येक सिरिंज के भीतर प्रत्येक excipient की दाढ़ अनुपात बनाए रखने के लिए, देखभाल करने के पुनर्नवीनीकरण अग्रदूत पायस के लिए जोड़ दिया.) मध्यम स्तर चमकदार सफेद है और केंद्रित LOMs होता है. नीचे और मध्यम परतों के बीच सीमांकन का एक तेज रेखा वहां आम तौर पर है. प्रत्येक सिरिंज के बीच परत के नीचे वर्णित के रूप में आगे की प्रक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है. ऊपर परत निर्माण प्रक्रिया के दौरान टूट LOMs से मुक्त गैस युक्त शराबी फोम होता है. ऊपर और नीचे परतों आम तौर पर खारिज कर रहे हैं. Centrifugation के दौरान, यह प्रत्येक सिरिंज प्रसंस्करण के दौरान अपकेंद्रित्र में पायस के बाहर निकालना को रोकने के क्रम में एक तंग सिरिंज टोपी द्वारा कवर किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. उच्च गति पर centrifugation हम इस्तेमाल सीरिंज के कुचलने शक्ति द्वारा सीमित था. नीचे और मध्यम परतों (आमतौर पर उच्च गैस अंश युक्त emulsions centrifuged किया जा रहा था जब) के बीच सीमांकन का एक तेज लाइन प्राप्त करने की आवश्यकता है, centrifugation के समय किया जा सकता हैबढ़ाया. केंद्रित LOMs गठबंधन करने के लिए एक गैस तंग, 3 तरह पानी निकलने की टोंटी का उपयोग हवा प्रदूषण को रोकने के लिए उपयोगी है. यह LOM युक्त सीरिंज हमेशा छाया रखा है और किसी भी परिवेशी वायु तुरंत निष्कासित कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें कि यह भी महत्वपूर्ण है. भंडारण के दौरान वायु प्रदूषण को सीमित करने के लिए, सीरिंज केवल luer ताला टोपी के साथ बंद किया जाना चाहिए. प्लास्टिक सीरिंज पारगम्य गैस होने के लिए जाना जाता है, तो गिलास या धातु सीरिंज लंबी अवधि के भंडारण के लिए बेहतर होते हैं.
ऊपर वर्णित है, 15 मिनट के लिए धारावाहिक एकाग्रता कदम से अवगत कराया emulsions आमतौर पर मात्रा से 70% गैस प्रदर्शन और centrifugation द्वारा 90% गैस के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. 70 मात्रा% पायस अंत में वांछित है, तो भी हम ध्यान से LOMs में शामिल नहीं हैं जो फॉस्फोलिपिड को दूर करने के लिए सहायक हो centrifugation पाया है. यह भी emulsions चरण जुदाई को प्राप्त करने के लिए रात भर खड़े करने की अनुमति देकर पूरा किया जा सकता है. Vivo में प्रयोगों के लिए, हम अक्सर केंद्रित पतलाप्लाज्मा Lyte एक साथ LOMs, धीरे मिश्रण, तो अतिरिक्त अप्रयुक्त phospholipids और अन्य मलबे को हटाने के लिए फिर से अपकेंद्रित्र. अतिरिक्त लिपिड मलबा हटाने के लिए जरूरत के रूप में यह कदम कई बार दोहराया जा सकता है. LOMs में शामिल नहीं हैं जो phospholipids के इंजेक्शन क्योंकि वे एक उच्च अर्क दर की सेटिंग में प्रदान अतिरिक्त लिपिड लोड की अवांछनीय है.
हम इस प्रक्रिया के निर्माण में से बचने के लिए कई आम नुकसान पाया है. सबसे पहले, लिपिड excipients, ताजा -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, और समाप्त हो गई है, तो उपयोग नहीं किया जाना चाहिए. अग्रदूत समाधान परिणामस्वरूप emulsions उनके आकार के वितरण और अधिक से अधिक गैस अंश में असंगत हैं, के रूप में vivo अध्ययन के लिए पुन: उपयोग किया जाना चाहिए, और बैक्टीरियल contaminants, ऑक्सीकरण लिपिड, या लिपिड clumps हो सकती है. पायस निर्माण के दौरान 'महत्वपूर्ण चिपचिपापन' पहुंचता है एक बार दूसरा, यह अब प्रभावी प्रणाली के माध्यम से पंप किया जाएगा, और बड़े गैस जेब कोर्ट भीतर बनेगीटी. उच्च पायस चिपचिपाहट भी संभाल और सीरिंज में आकर्षित करने के लिए पायस कठिन बना देता है. इन समस्याओं के लिए सबसे अच्छा (गैस अंश के रूप में बढ़ मात्रा में वृद्धि बढ़ाता द्वारा) HCT भीतर गैस अंश में वृद्धि को मापने और प्रारंभिक मात्रा युगल एक बार सीरियल एकाग्रता की प्रक्रिया को रोकने से परहेज कर रहे हैं.
इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा है कि यह हवा और अंतिम उत्पाद के जीवाणु संक्रमण के लिए संभावित बनाता है, और एक सतत प्रक्रिया होने से इस रोकता है क्योंकि अवांछनीय है जो एक centrifugation कदम, के लिए लगातार की जरूरत है. भविष्य में, धारावाहिक एकाग्रता कदम batched centrifugation के लिए जरूरत नहीं रहेगी लिए एक हाइड्रोलिक मुक्ति प्रणाली के उपयोग द्वारा वाणिज्यिक दवा निर्माण के लिए एक भी कदम प्रणाली में संशोधित किया जा सकता है. में लाइन homogenizer और प्रयोगशाला मिक्सर 3/16 स्टेनलेस स्टील के साथ गढ़े और जगह में निष्फल किया जा सकता है. प्रणाली में अन्य गैसों का समावेश वें व्यापक हो सकता हैआगे इस तकनीक का ई उपयोगिता.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
धन: अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (USAMRMC) और टेलीमेडिसिन और उन्नत प्रौद्योगिकी अनुसंधान केंद्र द्वारा प्रबंधित. Shunxi जी यहाँ वर्णित के रूप में सीरिंज के संशोधन का योगदान दिया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
