Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Produksjon av Konsentrert, Lipid-baserte Oxygen mikrobobleutskillere Emulsjoner av High Shear Homogenisering og Serial Konsentrasjon

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

Vi beskriver metoder for produksjon av store volum med lipid-baserte oksygen mikrobobler (LOMs) beregnet for intravenøs oksygentilførsel ved hjelp av høy klippe homogenisering og serie konsentrasjon.

Abstract

Gassfylte mikrobobler som er blitt utviklet som ultralyd-kontrast-og medikamentavleveringsmidler. Mikrobobler kan fremstilles ved å behandle overflateaktive midler ved hjelp av sonikering, mekanisk omrøring, microfluidic enheter, eller homogenisering. Nylig har lipid-baserte oksygen mikrobobler (LOMs) er designet for å levere oksygen intravenøst ​​under medisinsk nødhjelp, rygging livstruende hypoksemi, og hindre påfølgende organskader, hjertestans og død. Vi presenterer metoder for skalert opp produksjon av høyt oksygenmikrobobler ved hjelp av en lukket sløyfe med høy skjær-homogenisator. Fremgangsmåten kan produsere 2 L av konsentrerte LOMs (90 volum%) i 90 min. Resulterende bobler har en gjennomsnittlig diameter på ~ 2 mikrometer, og en reologiske profilen i samsvar med at av blod når fortynnet til 60 volum%. Denne teknikken gir LOMs i høy kapasitet og med høy oksygen renhet, noe som tyder på at denne teknikken kan være nyttig for translasjonell forskningslaboratorier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrobobler som består av protein, polymer, og lipidskall har blitt utviklet som vektorer for levering av legemidler, genterapi, og ultralydkontrastmidler 1-5. Fordi disse terapeutiske anvendelser krever intravaskulær persistens mikrobobler, er slike mikrobobler som vanligvis er fylt med inerte, høye molekylvekt gasser som perfluorkarboner 6, som har lav oppløselighet i blod og stabilisere boble 3,4.

Nylig har lipid-baserte oksygen mikrobobler (LOMs) er designet for å levere terapeutiske doser av oksygen, noe som kan bevare end-organ oksygentilførsel og hindrer hemodynamisk ustabilitet i perioder med luftveisobstruksjon eller hypoksemi 7. Emulsjoner beregnet for intravenøs gass levering krever forskjellige design funksjoner enn de som brukes for ultralydkontrastmidler eller målrettet levering av legemidler. Først, fordi kroppen forbruker store mengder oksygengass (~ 200 ml / min), LOMs må produseres oginjisert i stor skala. Dette krever at produksjonsprosessen være effektiv. For det andre bør fremstillingsprosessen være lukket sløyfe for å unngå nitrogenforurensning ved eksponering av LOMs (som skal bli fylt med 100% oksygen) til omgivende luft. Tredje, fordi hensikten med LOMs er intravenøs gass levering, gass brøkdel av LOMs skal maksimeres, erkjenner de begrensninger som følger av emulsjon viskositet 7. Til slutt, som med hvilken som helst intravenøs injeksjon, er avgjørende for å unngå mikrovaskulær blokkering 8 nøyaktig kontroll over partikkelstørrelsesfordeling.

Det er flere etablerte metoder for fremstilling av mikrobobler. Sonikering benytter høy intensitet, lavfrekvent ultralyd påført luft-væskegrenseflate av en emulsjon som inneholder et overflateaktivt middel, slik som en amfipatisk fosfolipid, i nærvær av en gass-headspace for å produsere mikrobobler 7,9. Denne prosessen kan kontrolleres ved å variere ultralydfrekvens, strøm og pulsvarighet, og den resulterende størrelsesfordelingen kan skreddersys for å gi mikrobobler med en bestemt størrelsesfordeling, selv om lydbehandling er sjelden brukt i fremstillingen av klinisk brukte mikrobobler. Sammenslåing er intens mekanisk omrøring av et overflateaktivt middel og gass i et lukket system, som også er vanskelig å skalere opp for å imøtekomme store volumer 2. Droplet-baserte MicroFluidics tillater presis kontroll av mikrobobler størrelsesfordelingen 10-13. Selv om tradisjonelt vanskelig å skalere opp, multi-kanal, high-speed MicroFluidics har blitt beskrevet som øker mikrobobleutskillere produksjonseffektivitet 13. Mikrobobler produsert ved hjelp av noen av disse metodene kan kreve post-produksjon størrelse reduserende prosesser, for eksempel sentrifugal fraksjone 14,15 og mikrobobleutskillere flotasjon 16,17.

En annen etablert metode for fremstilling av svært stabile mikrobobler er skjær homogenizasjon 6, noe som kan resultere i en stabiliserende sekskantet fosfolipid mønster på mikrobobleoverflaten 18.. Bygge på dette konseptet, beskriver vi inkorporering av en in-line høy skjær homogenisatoren å lage selv-montering LOMs 19. I denne prosessen, benytter homogenisatoren raskt roterende kniver i umiddelbar nærhet til to flotte mesh emulsor skjermer, skape høy mekanisk og hydraulisk skjær for etablering av mikrobobler. Serie konsentrasjon av lipidemulsjon gjennom dette systemet gir en stadig konsentrert gassfraksjon, som kan ytterligere konsentreres ved sentrifugering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. System Set-up

Systemet består av en holde-og konsentrering tanken (HCT) utstyrt med en en-trinns mixer, en in-line-homogenisator med høy skjærkraft, en rullepumpe for å bevege fluid mellom HCT og homogenisatoren, og en varmeveksler (figur 1).

  1. Plasser en sterilisert, bred åpning 4 L glass beholder utstyrt med 2 basis porter og tre sideporter under den enkelt scene blandebatteri. Senk blandehodet til munningen av beholderen og sikrer en gasstett tilpasning ved hjelp av gummipakninger eller tape (for å hindre omgivende luft fra å forurense det øvre rommet).
  2. Monter en av base-porter (Figur 1, port nr. ​​1) av HCT med sterilt 3/8 "(ID) klar rør, omkring 10" lang, utstyrt med en 3-veis stoppekran på spissen for oppsamling av den konsentrerte emulsjon .
  3. Monter den andre base-port (fig. 1, port nr. ​​2) med sterilt 3/8 "(ID) slange, approximately 36 "i lengde. Strøm denne slangen gjennom en berg-pumpe. Monter innløpet av den høye skjær homogenisatoren med et T-stykke med to porter og koble som følger: koble slangen fra port nr. 2, gjennom valsen pumpen og koble til sideporten på T-stykket. Fest den andre porten til en oksygentank ved hjelp av en lav-strømningsoksygengass strømningsmåleren.
  4. Kople til utløpsporten av den høye skjærkraft-homogenisator til innløpsporten i en in-line varmeveksler holdt ved 4 ° C. Koble utløpsporten til varmeveksleren til returporten på HCT (Figur 1, port 3), og skaper et lukket kretsløp.
  5. Fest et oksygen-tank (via en strømningsmåler) til HCT (Figur 1, port nr. ​​4). Fest en gass sammensetning skjerm som er åpen til atmosfæren til toppen porten på HCT (Figur 1, port # 5).
  6. Hvis sterilitet er ønsket, sterilisere glass-og metallkomponenter før bruk ved autoklavering. Sterilisere rørkomponenter og plast connectors av etylenoksid før hver bruk. Dette er spesielt viktig dersom produktet skal testes in vivo.

2. LOM Produksjon

  1. Plasser 20 g GMP 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC) og 10 g kolesterol i bunnen av HCT. Tilsett 1 L av plasma Lyte A til HCT-og hånd røres i 1 min, og integreres så mye lipid som mulig inn i vannfasen.
  2. Senk ettrinns blanderen inn i den vandige fase, noe som sikrer at hele blandehodet er dekket av den vandige fase. Påse at toppen av HCT er gasstett (se trinn 1.1 over), og at det ikke er noen åpne sideporter. Skru på gass-kilde koblet til port 4, og vente inntil oksygen brøkdel av HCT headspace når> 95%. Ved 10 l / min (LPM), bør dette ta ~ 10 min.
  3. Ved hjelp av en-trinns mixer, bland forløper emulsjon i 5 min ved 5000 rpm. Den resulterende blanding skal vises blek hvit, og inneholder ingen synlig lipid klumper. Når blandet, kan ubrukte lipid-vann-blanding kan lagres ved 4 ° C i opp til 30 dager før engangsbruk.
  4. Prime hele lukket kretsløp med forløperen emulsjon ved å slå på rullepumpe på 1,3 LPM. Når systemet er fylt, å holde pumpen i til 1,3 LPM.
  5. Til å begynne produksjon av LOMs, slå på in-line høy skjær homogenizer til 7500 rpm. Umiddelbart etterpå, slå på oksygentilførsel til innløpsdelen av homogenisatoren ved 0,5 LPM. Hold enkelt scene blandebatteri (i HCT) på ved 3500 rpm. LOMs er dannet ved grenseflaten av rotorbladene og de ​​emulsor skjermene innen i-linje homogenisator (figur 2). Innen minutter, bør væsken blir synlig mer tyktflytende. En mer rigorøs metode er å bestemme viskositeten som en funksjon av tid, noe som kan gjøres ved å fjerne alikvoter fra port 1 under fabrikasjon og analyse med et viskosimeter.
    Merk: Hvis synlige luftbobler i slangen som kommer ut av blanderen, oksygenstrømme til in-line homogenisator er for høy. Titrer ned gasstrømmen til væsken er ugjennomsiktig og inneholder ingen synlige gassbobler.
  6. Kjør systemet i 15 minutter, og deretter slå av høy skjær homogenisatoren og oksygen innløpet til det. Fortsett å kjøre en-trinns mixer i HCT inntil emulsjonen er fjernet; Dette reduserer faseatskillelse og holder produktet relativt ensartet i HCT.
    Merk: Volumet til gassfylt emulsjon bør øke tilnærmet 2-3x i seriekonsentrasjonsfasen. Hvis det ikke gjør det, sjekk for å sikre at oksygen strømmer inn høyskjær homogenisatoren og at lipid konsentrasjoner i forløperen emulsjon er riktige. Effektivitet i produksjonen avtar som lipid konsentrasjonen synker.

Tre. Collection, Konsentrasjon, Assessment, og oppbevaring av LOMs

  1. Fest en steril, endret 140 ml luer-lock sprøyte til stoppekran festet til basen port # 1 på beholder. Tegn opp 100 ml av væsken. Tett cap sprøyte og gjenta til all væsken har blitt fjernet.
    1. Modifiser sprøyter ved å trekke tilbake 100 ml luft inn i sprøyten og deretter sage av overflødig stemplet og sprøytemateriale over 140 ml merket. Fyll og tomme sprøyter bruker tann tang til å trekke opp stempelet. Denne endringen gir enklere sentrifugering.
  2. Sentrifuger sprøyter med den avkortet ende orientert nedad i en nedkjølt (4 ° C) bøtte sentrifuger ved 225 xg i 10 min.
  3. Tre lag med materiale vil vises etter sentrifugering. Utvise nederste laget av overskytende regn vandige fasen og kast. Det andre laget er hvit og inneholder konsentrerte LOMs. Overfør konsentrert skummet til en gass-ugjennomtrengelig sprøyten ved hjelp av en tre-veis stoppekran for å hindre at omgivende gass-forurensning. Kast den endelige laget, som inneholder frie oksygengass fra ruptured LOMs.
  4. Skum kvalitet kan vurderes ved å nå ≥ 90% gass konsentrert skum. Calculspiste gasskonsentrasjon som følger:
    Volum% gass = [(Foam vekt / Foam volum) - 1] x 100
    1. Som et annet kvalitetskontroll, av størrelsesmikrobobler med lys obscuration fastslå om partikkelstørrelsen er innenfor det forventede området. Det bør bemerkes at en endring i homogenisering tid eller formuleringen kan endre boblestørrelse.
  5. Tett cap glassprøyte med en luer-lock montering. Konsentrerte LOMs kan fortynnes med Plasma Lyte A ved tidspunktet for bruk. Sprøyter kan lagres på 22, 4, eller -20 º C; kaldere temperaturer kan gi økt holdbarhet stabilitet 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Høy skjær homogenisering muliggjør effektiv (dvs. innenfor en ettermiddag) produksjon av tilstrekkelige LOMs for en dyrestudie og ikke krever teknisk ekspertise. Når dyktig, kan opp til 2 liter av konsentrert LOMs bli produsert i 90 min.

Mikroboblestørrelse og morfologi ble vurdert ved lysmikroskopi, og ved lys obscuration. Når en 10 pl prøve av LOMs ble visualisert, ble det sfæriske LOMs nevnt, så vel som en relativ knapphet på lipid rester (figur 3A). Dette gjelder spesielt når GMP produktet brukes. Når den samme prøve av LOMs ble vurdert ved lys obscuration, den midlere partikkeldiameter var 2,624 ± 0,332 mikrometer (SD). Større enn 90% av LOMs var <10 mikrometer i diameter, og populasjonen var polydisperse (figur 3B).

Emulsjon viskositet var sterkt avhengig av gassfraksjonen (og derfor, på mikroboblekonsentrasjonen). To ml porsjonerav LOMs av varierende gasskonsentrasjoner ble undersøkt ved hjelp av en steady state flyt feie ved hjelp av en 40 mm parallell plate geometri som stress var varierte fra 0,1 til 10 000 μN · m. Alle LOM gassfraksjonene vise skjær-tynning atferd, og dette fenomenet var mest uttalt ved høyere gassfraksjonene. LOMs inneholder 60 volum% gass viste en rheologisk profil som ligner på blod (Figur 4A).

Til slutt ble oksygeninnholdet (inkludert gassfraksjon og fraksjonert konsentrasjon av oksygen) av LOMs testet ved å tilsette varierende mengder av oksygen som finnes på 60 volum% LOMs til alikvoter av Desaturated humant blod med kjent oksygenunderskudd. Som tidligere beskrevet, kan oksygeninnholdet i LOMs beregnes ut fra økningen i oxyhemoglobin konsentrasjon 7.. Forholdet mellom volumet av oksygen som tilsettes i løpet av LOMs og volumetrisk økning av oksygeninnholdet i blodet var 1,053 ± 0,03025 (SD) (95% Cl = 0,9865 til 1,120) (Fig.ure 4B), noe som tyder på at de LOMs testet inneholdt tilnærmet 100% oksygen, oppviste noen fanget gasslommer (som ikke effektivt overføre oksygen til blodet, men flyte ut raskt), og effektivt overføre hele sin oksygen nyttelast til humant blod in vitro.

Figur 1
Figur 1. Produksjons oppsett skjematisk. LOMs er produsert ved hjelp av en in-line, høy klippe homogenisator i et lukket system. LOMs holdes innenfor en beholdning og konsentrere tank (HCT) under konstant blanding. Emulsjonen blir beveget gjennom systemet ved hjelp av en valse pumpe. Varmen som genereres av homogenisatoren er fjernet ved hjelp av en varmeveksler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>

Fig. 2
Figur 2. Selvbygging av LOMs innenfor en finmasket skjerm emulsor A) En raskt roterende blad. Passerer over en finmasket emulsor skjerm, noe som skaper en hevert virkning som trekker de vandige og gassfaser. Små oksygenboblene er dannet ved skjæring, og blir raskt omgitt av de hydrofobe haler av amfipatiske lipid fosfolipider, og skaper en selv montering gassfylt boble (B).

Figur 3
Fig. 3. Karakterisering av LOMs. A) Et representativt fotomikrografi av sfæriske LOMs oppviser en polydispers størrelsesfordeling. Scale bar =10 mikrometer. B) Størrelse fordeling av LOMs som vurderes av lys skygge. Data = mener, feil = SEM.

Figur 4
Figur 4 Properties of sentrifugert og konsentrert LOMs. A) reologisk profil av en LOM emulsjon ved 60, 70 og 90 volum% gass.. Fortynning av konsentrert skummet til 60 volum% gass gir en reologisk profil tilsvarende humant blod (hematokrit 40%). Data = mener, feil = SEM. B) Forholdet mellom oksygeninnholdet i LOMs tilsatt til humant blod og den målte økning av oksygeninnholdet i blodet. Data = mener, feil = SEM, linje = lineær regresjon med 95% konfidensintervall av linjen som passer best.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De viktigste trinnene for å skape konsentrerte, svært oksygenrikt LOMs inkluderer: 1) sikre at headspace innenfor HCT forblir fullt oksygenrikt; 2) sikre at renheten av lipid eksipienser er optimal (inkludert lagringsbetingelser og bruk av GMP-produkter); 3) slik at de pulverformede lipider blandes fullstendig med den vandige fase før fylling av systemet; og 4) å betale hensyn til økningen i gassfraksjon i HCT for å sikre at volumfraksjonen av gass, ikke overskrider 70%.

Metoden vi beskriver her benytter høy skjær homogenisering å lage hule mikrobobler. Amfipatiske lipider er opphengt med den vandige fasen, som brukes til å bære de lipider inn i in-line-homogenisator. GMP-klasse lipider er benyttet for in vivo-studier, og er generelt foretrukket fordi de inneholder færre lipid-aggregater og urenheter. Lipider er også gjenstand for harskning (spesielt når den oppbevaresinnenfor en oksygenrikt væske) og bakteriell forurensning. LOMs dannes når de hydrofobe haler arrangere rundt små oksygengassmikrobobler som er opprettet innenfor den in-linje homogenisator (figur 2). Homogen LOMs ved 7500 rpm utsetter mikroboblene til ytterligere mekaniske påkjenninger som de er valset mellom tuppen av rotorbladene og den indre veggen i statoren. LOMs også gjennomgå hydraulisk saks som de er tvunget til høy hastighet gjennom den ultra-finmasket emulsor skjermen, noe som ytterligere reduserer partikkelstørrelse. Skjærkrefter generere varme inne i i-linje homogenisator og lokalt ved en-trinns mixer; en in-line varmeveksler før retur til HCT er nødvendig å fjerne denne varmen. Fravær av en varmeveksler kan heve temperaturer over faseovergangstemperaturen for lipidet (55 ° C i DSPC), noe som øker fluiditeten av lipidet og resulterer i tap av produkt. Opprettelse av emulsjonen innenfor et lukket, in-line enheten sørger for at rent oxygen er innlemmet i LOM kjernen ved å hindre luftforurensningen. Videre er LOMs kontinuerlig utsettes for med den gassformige øvre område av HCT. Det er derfor viktig å sikre at sugeeffekten som skapes av den laboratorieblander i HCT ikke skaper en reversering av luftstrømmen fra atmosfæren inn i HCT (gjennom gassanalysevekt, som er åpen mot atmosfæren for å hindre trykksetting av HCT) . Den oksygengassstrømningshastigheter som er beskrevet her bør være tilstrekkelig til å hindre dette fenomen.

Gjenvinning av emulsjonen gjennom in-line-homogenisator under serie konsentrasjon fasen skaper ytterligere LOMs fra "ubrukte" fosfolipider som er igjen i den vandige fase, og utsetter intakte LOMs til gjentatte skjær, noe som kan ytterligere redusere partikkelstørrelsen også. Partikkelstørrelse og gasskonsentrasjon kan derfor tilpasses ved å justere blandehastigheter, emulsor skjermer, maskevidde, og kjøretiden (dvs. varighet av serie concentration trinn). Mekanisk omrøring frembringer en polydispers størrelsesfordeling. Den brede størrelsesfordeling tillater tettere pakking av mikrobobler, og dermed øke den maksimale innkapslede gassfraksjon i et gitt volum av skum. Endring formulering kjemi ved inklusjons viskositet fremmende midler kan anvendes for å skape en mer homogen størrelsesfordeling hvis ønskelig. Vi har funnet ut at en kjøretid på 15 min er mest ideelt; som mikroboblekonsentrasjonen øker, blir det stadig mer viskøs emulsjon. Når det når en kritisk viskositet, er det ikke lenger er effektivt pumpes ved hjelp av en rullepumpe. Dette fører til at fri gass til å passere gjennom homogenisatoren uten å bli inkorporert i LOMs og kan sees i den gjennomsiktige rør. På dette stadium, vi vanligvis velge å stoppe den serielle konsentrasjon trinn, men hvis det ønskes kan gass-strømningshastigheten inn i det in-line-homogenisator reduseres og valsen pumpestrømningshastigheten kan økes for å skape høyere gassfraksjoner. Men svært viskøses emulsjoner krever mer kraft for å trekke seg inn i sprøytene for sentrifugeringstrinnet, og kan redusere utbyttet av denne prosessen.

Den sentrifuge trinnet har blitt lettere ved å endre 140 ml sprøyter til å avkorte stempelet og bunnen av sprøyten, slik at fylte sprøyter danne et enda sylinder. Dette letter i stor grad lasting og lossing av sprøyter inn i sentrifugen. Etter sentrifugering, sprøyter typisk inneholde tre lag. Det tetteste lag (i nærheten av sprøytespissen når sprøytene er lastet nese-ned) inneholder ubrukte fosfolipider og hoveddelen av den vandige fase. I noen tilfeller kan regn "rusk" ses innenfor sprøytetuppen som typisk inneholder lipid klumper. For grunnleggende forsøk, kan innholdet i denne "vandig fase" brukes om igjen for senere eksperimenter, selv om vi har funnet at dette i det vesentlige minsker effektiviteten av prosessen. (For å redusere dette problemet, flere fosfolipid stoffene kantilsettes til det resirkulerte forløper emulsjon, å ta vare for å opprettholde det molare forholdet av hvert eksipiens.) Midtsjiktet i hver sprøyte er hvit og inneholder konsentrerte LOMs. Det er typisk en skarp skillelinje mellom den nederste og midtre lag. Det midterste lag av hver sprøyte kan kombineres for videre behandling som beskrevet nedenfor. Det øverste laget inneholder myke skum inneholdende fri gass fra LOMs brutt gjennom hele produksjonsprosessen. Topp-og bunnlagene er vanligvis kastes. Under sentrifugering, er det viktig å sikre at hver sprøyte er dekket av en tett sprøytehetten for å hindre ekstrudering av emulsjonen inn i sentrifugen under behandlingen. Sentrifugering ved høyere hastigheter var begrenset av knusestyrke av de sprøyter vi brukte. Hvis det er nødvendig for å oppnå en skarp skillelinje mellom de nedre og midtre lag (vanligvis når emulsjoner med høyt gassfraksjon ble sentrifugert), kan sentrifugetiden væreforlenges. Anvendelse av en gass-tett, 3-veis stoppekran for å kombinere konsentrerte LOMs er nyttig for å hindre luftforurensning. Det er også viktig å sikre at LOM-holdige sprøyter er alltid holdt avkortet og at enhver omgivelsesluften utvist umiddelbart. For å begrense luftforurensingen under lagring, bør sprøyter tettes med luer-lock caps bare. Plast sprøyter er kjent for å være gass-gjennomtrengelige, slik at glass-eller metall-sprøyter er å foretrekke for langtidslagring.

Som beskrevet ovenfor, emulsjoner som utsettes for den serielle konsentrasjon trinn i 15 minutter vanligvis oppviser 70% gass ved volum og kan konsentreres til 90% gass ved sentrifugering. Selv om 70 volum% emulsjon ønskes til slutt, har vi funnet sentrifugering for å være nyttig for å fjerne fosfolipider som ikke er innlemmet i LOMs fra konsentratet. Dette kan også oppnås ved å la emulsjoner til å stå over natten for å oppnå faseseparasjon. For in vivo eksperimenter, vi ofte fortynne konsentrertLOMs med Plasma-Lyte A, bland forsiktig, deretter sentrifuger på nytt for å fjerne flere ubrukte fosfolipider og annet rusk. Dette trinnet kan gjentas flere ganger etter behov for å fjerne overskudd av lipid rusk. Injeksjon av fosfolipider som ikke er inkorporert i LOMs er uønsket på grunn av den ytterligere lipid last de formidler i innstillingen av en høy infusjonshastighet.

Vi har funnet flere vanlige fallgruver å unngå i denne produksjonsprosessen. Først bør fettstoffene være frisk, lagret ved -80 ° C, og som ikke brukes hvis utløp. Forløperen løsningen bør ikke brukes på nytt for in vivo-studier, som resulterer emulsjoner er i uoverensstemmelse i deres størrelsesfordeling og maksimale gassfraksjon, og kan inneholde bakterielle forurensninger, oksiderte lipider eller lipid-klumper. For det andre, når emulsjonen har nådd "kritisk viskositet 'under fremstillingen, vil det ikke lenger være effektivt pumpes gjennom systemet, og store gasslommer vil danne innenfor HCT. Den høye emulsjon viskositet gjør også emulsjonen vanskelig å håndtere og trekke seg inn i sprøyter. Disse problemene unngås best ved måling av økningen i gassfraksjon i HCT (ved å kvantifisere den volumøkning som gassfraksjon øker) og stopp av seriekonsentrasjonsprosessen når startvolum dobles.

En viktig begrensning av denne teknikk er det vedvarende behov for en sentrifugeringstrinn, noe som er uønsket fordi det gir mulighet for luft og bakteriell forurensning av sluttproduktet, og forhindrer denne fra å være en kontinuerlig prosess. I fremtiden kan det serielle konsentrasjon trinn modifiseres i en enkelt-trinns system for kommersiell fremstilling medikament ved å benytte en hydraulisk utløpssystem for å overflødiggjør satsvis sentrifugering. Den in-line-homogenisator og laboratorierøreverk kan fremstilles med 3/16 rustfritt stål og steriliseres på plass. Innlemmelsen av andre gasser i systemet, kan utvide the nytten av denne teknikken ytterligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansiering: US Army Medical Research & forsyningskommando (USAMRMC) og administreres av telemedisin og Advanced Technology Research Center. Shunxi Ji bidratt endring av sprøytene som er beskrevet her.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16, (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94, (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381, (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4, (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15, (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31, (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26, (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28, (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28, (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4, (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28, (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26, (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26, (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6, (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320, (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. (2013).
Produksjon av Konsentrert, Lipid-baserte Oxygen mikrobobleutskillere Emulsjoner av High Shear Homogenisering og Serial Konsentrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter