Summary
우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.
Abstract
전이는 종양 세포가 차 틈새 시장을 extravasate 및 양식에 대한 액세스를 확보함으로써, 기본 종양 intravasate 혈액 혈관과 림프 시스템에서 창고하는 과정이다. 혈액 혈관 시스템에서 종양 세포의 혈관 외 유출은 다양한 세포주에서 얻은 내피 세포 (EC에) 및 종양 세포를 이용하여 연구 될 수있다. 초기 연구는 정적 조건을 사용하여 실시되었다하지만 그것은 잘되는 EC 생리 흐름 조건에서 다르게 행동하는 것이 설명되어 있습니다. 따라서, 다른 유동 챔버 조립체는 현재의 EC와 암세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고있다. 현재 유량 용기 어셈블리는 다른 전단 응력 조건에서 서로 다른 세포주 또는 유체를 사용하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, 관찰하고 종양 세포 (의 CTCs)를 순환하는 희귀 세포와의 상호 작용을 연구하기 위해, 특정 변경 내용은 기존의 유량 용기의 조립을 할 필요합니다. 의 CTCs혈액 세포의 수백만 사이 희소 세포 집단이다. 결과적으로,의 CTCs 순수 인구를 얻기 어렵다. 정상적으로 순환에서 발견 세포의 다른 유형의 CTCs 오염은 본 농축 또는 공핍 기술을 사용 불가피하다. 본 보고서에서, 우리는 형광 라벨 순환하는 전립선 암 세포에 고유 한 방법을 설명하고 자기 조립 흐름 챔버 시스템에서의 EC와의 상호 작용을 연구한다. 이 기술은 또한 전립선의 CTCs 및 또한 어떤 단백질 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
전이가 제대로 이해 남아있는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. E-selectin/selectin 리간드 축은 혈관 내피 세포와 암세포 간의 1,2 차 접착제 상호 작용을 촉진함으로써 종양 전이에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 다른 E-셀렉틴 리간드 (들) 종양 세포 (3)에 의해 표현되는 반면 내피 (E)-셀렉틴은 활성화 된 내피 세포에 의해 발현 막 횡단 단백질이다. 다수의 체외 방법이 성공적으로 종양 세포와 내피 세포 사이의 E-selectin/selectin 리간드 상호 작용되는 EC (1) 모델로 사용되어왔다. 이러한 상호 작용을 연구하기 위해, 다른 흐름 챔버 시스템은 혈액 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 사용하고있다. 유량 용기 어셈블리 중, 내피와 함께 병렬 플레이트 흐름 챔버 (PPFC)는 정기적으로 생체 전단 응력 조건에서 시뮬레이션 체외 모델로 사용됩니다. 이에방법, 내피는 35 mm 접시에 성장하고 단일 층을 달성 한 후, 내피는 PPFC에 부착하고 전단 응력을 기준으로 실험이 수행된다.
그러나 PPFC과 다른 현재의 시스템은 환자와 내피에서 파생 된 종양 세포 (의 CTCs)를 순환 사이의 접착제의 상호 작용을 연구하는 많은 제약을 제시 주로의 CTCs는 혈액 세포의 수백만의 사이에 순환, 기본 종양에서 흘려 세포의 희소 한 인구 때문에 (1 CTC 9 혈구 열마다) 4. 따라서, 배양 세포 라인의 무제한 공급과 달리 낮은 CTC 수는 재생 분석을위한 상호 작용을 기록하는 적절한 흐름의 채널 폭을 필요로하는, 매우 적은 희귀 CTC / EC의 상호 작용을지도한다. 환자 유래의 CTCs가 불순한 인구 때문에 또한, 따라서 식별 마커는 특정의 CTCs를 추적해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 (PCA) CT 전립선 암을 확인하는 새로운 방법을 개발CS 거의 모든 이들의 CTCs가 자신의 세포 표면 5,6에 전립선 특이 막 항원 (PSMA)을 표현한다는 사실을 활용하여. 이 보고서에서, 우리는 결국 전이의 메커니즘을 이해하기 위해, 내피로 전립선 CTC 상호 작용을 연구하기위한 새로운 시스템의 잠재적 인 유틸리티를 보여, 전립선 암 세포주 MDA PCa2b (MDA)를 사용했다.
우리의 방법은 생체 내 혈관 시스템 7-9에서 시뮬레이션 각종 전단을 기준으로 실험에 적용 할 수 있습니다. PCA CTC / EC 상호 작용을 조사 외에, 전류 흐름 챔버 시스템은 쉽게 말초 혈액 단핵 세포를 분석하거나 내피와 종양 세포의 상호 작용을 위해 구성 될 수있다. 분해 및 유량 용기의 재 조립의 용이성,하는 마이크로는 III (0.1) (이하 마이크로 슬라이드로 함), 관류 및 홍보를 유도하는 다른 사이토 카인과 내피를 자극에서 배양되는 EC 수 있습니다식을 otein. 또한, 배양 된 내피 같은 E-셀렉틴 및 P-재조합 단백질은 종양 세포와 상호 작용하는 마이크로 슬라이드 상에 코팅 할 수는 층류 조건 (10)으로 관찰 할 수있다.
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Protocol
관측 CTC - 내피 세포 상호 작용에 대한 Microslides 1. 배양 된 HUVEC
- 조직 문화 후드에서 첫 번째, PBS 1 ㎜의 채널 폭을하는 마이크로 린스. 부드럽게 코트 50 ㎍ / ml의 피브로넥틴 (PBS에 용해 된) 1 ㎖의 루어 로크 시린지를 사용하여 200 μL와 마이크로 슬라이드.
- 뚜껑을하는 마이크로을 덮고 30 분 동안 조직 문화 후드 내부에 보관. 마이크로 슬라이드에있는 액체의 느린 분배 채널에서 거품 형성을 방지 할 수 있습니다.
- 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 성장 배지 200 μl를 Perfuse (M199 미디어, 1M HEPES, 20 % FBS, 5 ㎎ / ㎖ 헤파린, 100 ㎍ / ㎖의 내피 세포 성장 인자, 및 L-글루타민)하는 마이크로 이상과 부화 실온에서 20 분. 관류하는 동안, HUVEC 세포 현탁액을 준비합니다.
- PBS로 된 HUVEC을 씻어 RT에서 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 5 분 180 XG에 2 ㎖ 성장 매체에 원심 분리기 된 HUVEC.
- neuba를 사용하여 세포 농도를 측정UER의 혈구 및 성장 매체 μL 10 7 HUVEC의 cells/100를 준비합니다. 그런 다음 조심스럽게 200 μL 피펫 팁을 사용하는 마이크로의 입구에서 매체를 제거합니다.
- 눈 높이로하는 마이크로 및 1-ML 루어 잠금 주사기를 사용 가져와 부드럽게 채널로 된 HUVEC의 준비 농도의 200 μl를 perfuse. 주의 기포 형성을 방지하기 위해이 단계에서 필요하다. 거품이 나타날 경우, 거품이 출구 채널을 입력 할 때까지 약간 긴 시간 동안 관류 유지.
- 입구와하는 마이크로의 콘센트에 HUVEC 미디어의 동일한 볼륨 (~ 80 μL)을 넣습니다. 이는 어느 한 방향으로 세포의 유동을 방지한다.
- 슬라이드를 커버하고 1.5 시간 동안 인큐베이터 (37 °의 C)를 유지한다.
하는 마이크로 밤새 HUVEC 문화 흐름 상공 회의소 총회의 2. 준비
- 15 마일의 인큐베이터에서 멸균 20 ML 주사기, 여성과 남성 루어 커넥터, 튜브, 주사기 펌프를 배치N.
- 최소한의 죽은 볼륨의 경우, 0.04 인치의 내경 튜브를 사용합니다. 작은 튜브의 직경은 거품 형성을 방지 할 수 있습니다.
- 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 미디어 (12 ㎖) 20 ㎖를 주사기를 채우십시오. 주사기에 커넥터와 튜브를 연결합니다. 거품을 제거합니다. 마이크로 슬라이드에이 어셈블리를 연결합니다.
- 완전히 HUVEC 미디어와 마이크로 슬라이드의 입구를 입력합니다. 다음 마이크로 슬라이드에 커넥터에 연결된 가득 20 ML의 주사기를 가져옵니다. 부드럽게하는 마이크로에 커넥터를 연결합니다.
- 인큐베이터에 셋업을 가지고 있으며 10 μL / 분의 전단 속도로 설정 주사기 펌프에 연결합니다. 37 ℃에서 인큐베이터에있는 세포 O / N를 남겨
- 다음날, 마이크로 슬라이드의 유입구에 연결된 커넥터를 제거함으로써 셋업을 분해.
- 내장 컴퓨터에 E-selectin의 발현을 상향 조절하려면 4 ML 미디어 / ㎖를 겨 (10)에서 IL-1β를 포함하는 신선한 성장 매체를 준비합니다. 10 ㎖를 주사기에 미디어를 대기음. T를 제거그가하는 마이크로의 입구에서 미디어와 슬라이드에 주사기를 연결합니다.
- 인큐베이터에서 4 시간 10 μL / 분의 전단 속도에서 주사기 펌프를 설정합니다.
3. 안티 PSMA의 준비 (J591-488) 레이블이 전립선 암 세포
- 된 HUVEC의 IL-1β의 배양하는 동안, 안티 PSMA의 J591-alexa488 표시 PCA 세포를 준비합니다. 1 분 동안 MDA 세포에 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 이 세포 표면에 존재하는 글리코 펩타이드에 영향을 미칠 수있는 긴 시간 동안 트립신으로 세포를 노출시키지 않는다. 효소 자유로운 세포 해리 시약 대신 트립신 사용될 수있다. 5 분 200 XG에 원심 분리기.
- 1 ㎖의 H / H 버퍼 (행크스 균형 소금 solution/0.1 % HSA/10 mM의 HEPES / 1 ㎜ 염화칼슘)에 MDA 세포 펠렛을 Resuspend. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA의 J591-alexa488 항체를 추가합니다. 배양 중에 세포를 재현 탁.
- 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 세포 용액을 원심 분리기. ASPI레이트 및 1 ml의 H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 표지 MDA 세포를 세어 1 × 6 세포 / ml로 최종 농도를 가져옵니다. J591-488 라벨 MDA 세포와 5 ML의 주사기를 입력하고 거품을 제거합니다.
4. PCA 환자에서 안티 PSMA (J591-488) 레이블의 CTCs 풍성하게 준비
- (구연산 나트륨을 포함하는) 파란 모자 관에서 전립선 암 환자에서 7.5 ml의 혈액을 수집합니다. 부드럽게 0.1 % BSA / 1 ㎜ EDTA / PBS에서 혈액 1:1 희석.
- 5.3 ㎖의 피콜 - paque 플러스 50 ML 원뿔 튜브를 추가합니다. 레이어 피콜 - paque 위에 혈액을 희석. 30 분 400 XG에 원심 분리기.
- 프리 코트의 모든 튜브 또는 팁은 2 % FBS/RPMI-1640 / 1 ㎜ 염화칼슘 2 / 4 mM의 MgCl2를 표면에의 CTCs 비 특정 바인딩을 방지하기 위해 (R / S 버퍼)과의 CTCs과 접촉. 의 CTCs과 접촉 매체 및 버퍼의 4 ° C 온도를 유지합니다.
- 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 분획을 모아서30 ml의 R / S 버퍼를 포함하는 다른 50 ml의 원추형 튜브 인터페이스에서의 CTCs 함유. 8 분 400 XG에 원심 분리기.
- 펠렛을 재현 탁하고 8 분 400 XG에서 R / S 버퍼에 다시 씻는다. 원심 분리 후, H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA J591-488 항체를 추가합니다.
- 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 J591-488 표지의 CTCs 함유 PBMC를 원심 분리. H / H 버퍼를 Resuspend. 샘플 1 ML의 주사기 (R / S 버퍼 사전 코팅)을 입력합니다.
5. 현미경의 준비, 주사기 펌프 및 유량 용기 조립
- 거꾸로 현미경을 켜고 10X 목적에 쾰러 조명을 설정합니다. 현미경의 시료 스테이지 같은 수준의 주사기 펌프를 지참 한 DYN / cm이 전단 응력 (~ 10 μL / 분)로 설정.
- 혈구 AxioVision의 소프트웨어를 엽니 다. 컴퓨터 화면에 목표를 선택한다. 새로 만들기소프트웨어의 도구 옵션에서 폴더.
- AxioVision의에서 스마트 실험 옵션을 열고 30 분 동안 짧은 30 초 영상을 기록하는 설정을 조정합니다.
- 실시간 형광 영상의 경우, 영상 옵션-12 밀리 초 노출, 2 × 2 빈 5 게인을 설정합니다. 이러한 매개 변수는 MRM 자이스 카메라와 비디오 프레임 속도 (~ 초당 23 프레임)에 가까운 동영상을 달성하는 데 도움이됩니다.
- 컴퓨터 화면에 10 X의 목적에 유동 채널의 전체 너비를 시각화 C-마운트 어댑터 (0.63 xf/60 mm 인터페이스)를 사용하십시오.
- 수은 램프를 켭니다.
- 주사기 펌프에 주사기와 세포를 포함하는 커넥터를 놓습니다.
- 가져 IL-1β를 인큐베이터에서 HUVEC를 자극. 된 HUVEC을 포함하는 마이크로의 작성 유입 채널에 커넥터를 연결합니다.
- 튜브에 부착 된 커넥터와 콘센트 채널을 연결합니다. 을 통해 흐름을 수집하는 접시 15 ML 원뿔 튜브에 튜브를 넣어.
- infusi를 시작합니다10 μL / 분하는 마이크로를 통해서 전달됩니다. 내피 세포 및 표시 MDA 세포 또는 표면 형광 현미경에 488 나노 필터에 따라 환자에서 파생 된 레이블의 CTCs 사이의 상호 작용을 관찰한다.
- 30 초 짧은 영상으로 실험을 녹음을 시작합니다. 재생 분석 중에, 압연 속도를 측정. 회전 속도는 시간이 지남에 따라 셀에 의해 이동 한 거리를 나눔으로써 측정된다.
하는 마이크로의 6. 면역 염색
- 10 분 동안 IL-1β 자극 된 HUVEC에 MDA 세포를 관류 한 후하는 마이크로의 입구와 출구에서 용지를 제거합니다.
- 200 ㎕의 팁을 사용하여 5 분 동안하는 마이크로의 입구에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 따뜻한 (37 ℃) PBS를 넣어. 벤치에 소품으로의 뚜껑을 사용하는 마이크로를 기울이십시오. 면역 염색 동안 모든 배양을 위해 기울어 진 위치에하는 마이크로 유지.
- 입구에 따뜻한 2 % 포름 알데히드를 관류하여 HUVEC를 수정
- 실온에서 10 분 동안 PBS에서 5 % BSA에 트리톤-X 100 (0.1 %)를 추가합니다.
- 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. 30 분 동안 PBS에서 5 % BSA로 차단합니다.
- 차 항체 염소와 부화 방지 VE-cadherin의 (1:100)를 2.5 % BSA의 O / N로 4 ℃에서
- 다음 날, 5 분마다 PBS로 두 번 세척한다. 45 분 동안 차 당나귀 방지 염소 647 항체를 추가합니다. 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오.
- 1 시간 동안 인간 답게 J591-alexa488 복합 항체로 실온에서 품어.
- 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분 DAPI를 추가합니다. 5 분 동안 증류수로 세척 할 것.
- PBS를 추가 (또는 장기 저장을 위해 MOWIOL). 공 초점 현미경으로하는 마이크로 시각화.
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Representative Results
그림 1은 마이크로 슬라이드에 내장 컴퓨터의 단일 층의 O / N 문화를 보여줍니다. 그림 1A에 스케일링은하는 마이크로의 100 %는 70 %가 10 배 목표 (그림 1B)를 사용하여 표시되는 동안 5 배 목표를 사용하여 볼 수 있음을 보여줍니다. E-셀렉틴 매개되는 상호 작용의 경우, 가장자리에서 롤링 균체 영상 기록 재생 분석을위한 마이크로 슬라이드의 70 % 이상이 가능하게하는 것으로 간주되지 않는다. 우리의 경험에서, 처음에이 세트 업 어셈블리 문화에 전단 응력에서의 EC의 단일 층을 연습을 필요로한다. 마이크로 슬라이드에 EC 성장을 확립 한 후에, 우리는, 전립선 암 세포 MDA 레이블. J591-488 항-PSMA 항체의 특이성은 건강한 공여자의 혈액에서 아군 및 항-PSMA J591-488 단일 클론 항체에 표지 된 형광 물질로 표지 MDA 세포를 사용하여 시험 하였다. 제공된 PSMA 면역 염색은 PBMC를 (데이터 미도시)에서 관찰되지 않았다. J591-488 바인딩 및 국제화 알테 가능성을 배제하려면RS 행동을 압연, 우리는 J591-488과 MDA 세포를 표시하고 1-10 DYN / ㎠에 이르는 전단 응력에서 레이블이없는 MDA 세포와 회전 동작을 비교했다. 박스 플롯은 다른 전단 응력 조건에서 IL-1β 자극되는 EC의 두 레이블과 J591-488-라벨 MDA 세포의 회전 속도의 분포를 보여줍니다. 유의 한 차이는 1의 회전 속도에서 관찰되었다 각각 5 DYN / ㎠, P = 0.634과 P = 0.601, (그림 2). 10 DYN / cm 2의 높은 전단 응력에서 통계적으로 유의 한 차이는 비 표지의 압연 속도와 J591-488-표지 MDA 세포 (p <0.05) 사이에서 관찰되었다. 이전 연구는 높은 전단 응력 (> 3 DYN / ㎠) 조건에서, 더 적은 종양 세포 부착 및 낮은 전단 응력 조건 (11, 12)에 비해 내피에 롤을 보여준다. 따라서, 종양 세포와 내피 사이의 상호 작용을 분석하는 연구가 낮은 전단 응력에서 실시된다. 일우리, 우리의 데이터의 CTCs가 J591-488과의 CTCs의 형광 라벨 크게 전단 응력의 넓은 범위에서 회전 동작에 영향을주지 않습니다으로 표시 될 수 있음을 시사한다. 참고로, 우리는 내피 (데이터 미도시)의 IL-1β의 자극 부재에 어떠한 CTC / EC 상호 작용을 검출하지 못했다. 또한, 원칙의 증거로, 우리는 또한 J591-488와 CRPC 환자의 격리 및 IL-1β 자극되는 EC를 통해 관류 농축의 CTCs를 표시. 시간 스티치 비디오는 전립선의 CTCs와 내피 사이의 상호 작용의 다른 유형을 보여줍니다 (비디오 1). 비디오 (의 CTCs도 30 초 후 분리하지 않은) 상호 작용을 안정 접착의 세 가지 유형을 보여줍니다, 테 더링 (CTCs를 붙이고 다시 연결), 알 수없는 상호 작용. Microslides 쉽게 면역 염색 할 수 있으며 microslides는 1.5 mm 두께의 커버 글라스 7 유사한 광학적 특성을 가지고 있기 때문에 형광 이미지를 촬영할 수 있습니다. 그림 3 J591-488 라벨 MDA 세포 선미의 밀착성을 보여줍니다IL-1β 자극되는 EC에 어 관류.
그림 1 :..하는 마이크로 배양 내피 세포의 단일 층 HUVEC를 배양 O / N은 5 배 목적에서 전단 응력 하에서 피브로넥틴 (50 ㎍ / ㎖)을 코팅하는 마이크로 III (0.1) (1 DYN / ㎠))에 있었다 (EC 계획 Neofluar 5X/0.16)는, 배양되는 EC 완전한 유로 폭이 관찰되었다. 채널 폭은 채널 1,065.79 μM이 관찰되었다 10X 대물 (플랜 Neofluar 10X/0.3 PH1)에서 1,545.95 μM. B)로 측정 하였다. 이되는 EC는 마이크로 슬라이드에 O / N을 배양 할 수 있고, 마이크로 슬라이드의 70 %가 10 배 배율로 볼 것을 제안합니다. 했습니다 큰를 보려면 여기를 클릭하세요이 그림의 rsion.
내피에 MDA 세포의 그림 2. 회전 속도는 마이크로 슬라이드에 배양. 백만 레이블과 J591-488 라벨 MDA 세포가 IL-1β 자극 된 HUVEC에 관류 하였다. 마이크로 슬라이드에 다양한 분야에서 열 비디오는 1,5 기록, 10 DYN / ㎠했다. 전단 응력 계산은 제조 업체에 의해 제공되었다. 회전 속도에 대한 오프라인 분석을 수행 하였다. N = 회전 속도 측정을위한 계산 세포의 수. 박스 플롯은 회전 속도와 J591-488 레이블과 레이블이없는 MDA 세포 사이의 평균 차이의 분포를 보여줍니다. P <0.05, 윌 콕슨의 순위 합 테스트. 원은 특이점을 나타냅니다. 바이올렛하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 확대 EW.
마이크로 슬라이드에 내장 컴퓨터와 상호 작용하는 MDA 세포의 그림 3. 면역 염색은. 백만 MDA 세포는 1 DYN / ㎠ 전단 응력에 IL-1β 자극 된 HUVEC에 관류 하였다. 재관류 후, 면역 염색은 마이크로 슬라이드에 대해 수행 하였다. 노란색 화살촉 단단히 내피에 부착 MDA 세포를 보여줍니다. PSMA = 빨강, = 녹색, DAPI = 블루-cadherin의 VE. 병합 된 이미지의 모든 색상을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1. IL-1β 자극 된 HUVEC과 전립선 암 환자에서 풍부한 안티 PSMA J591-488-라벨의 CTCs 사이의 상호 작용을 보여주는 동영상. 단층 오F는 HUVEC를 환자로부터의 CTCs 충실을 함유하는 마이크로 III (0.1) 및 항-PSMA J591-488 - 표지 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)에 배양은 / cm 2 일에 DYN 된 HUVEC에 관류 하였다. 관류 동안 짧은 30 초 동영상은 마이크로 슬라이드에 다양한 분야에서 기록되었다. 영상의 획득 시간은 왼쪽 하단 모서리에 표시됩니다. 다른 짧은 동영상이 비디오를 컴파일하기 위해 함께 물렸다했다. 2시 16분 36초에서, 비 - 상호 작용 CTC은 뷰의 왼쪽 필드 들어간다; 2시 19분 16초에서 다른 상호 작용이없는 CTC는보기의 왼쪽 모서리 필드를 입력; 2시 23분 12초에서보기의 상단 중간에 필드에 안정적으로 부착 CTC을 볼 수 있습니다. 2시 38분 9초에서 안정적으로 부착 된 CTC는 볼 수는 시야의 오른쪽에 볼 수 있습니다. 이 동영상은 물론 된 PBMC의 상호 작용을 보여 시야 및 형광 채널을 모두 사용하여 촬영 하였다. 2시 40분 18초에 안정적으로 부착의 CTCs은 뷰의 상단 중간에 필드에 관찰되었다. 이 동영상은 밝은 필드를 사용하여 촬영 한형광 채널은 PBMC를 롤링 동작을 표시합니다. 2시 51분 49초 통해 2시 51분 39초에서 CTC 전시 테 더링 문제는보기의 맨 아래 필드에서 관찰되었다. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인해 혈액 세포들 사이의 CTCs 낮은 숫자로, 그것은 세포의 순수로의 CTCs 모집단을 분리하는 것이 곤란하다. CTC / EC의 상호 작용을 연구하기 위해,의 CTCs 희귀하고 불순한 인구는 두 가지 주요 도전 포즈 : 혈액 세포들 사이의 CTCs) 확인을; B) CTC / EC의 상호 작용을 관찰.
혈액 세포들 전립선의 CTCs 식별 첫번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 사실상 모든 전립선 종양 세포 PSMA 6 표현한다는 사실을 이용 하였다. 단일 클론 항체 J591-488은 PCA의 CTCs는 생체 레이블 및 CTC / EC의 상호 작용 (13)에 대해 연구 할 수있는 제안 바인딩 세포 표면을 따라 내면된다. 항체 및 최대 면역 최적의 국제화를 위해, 우리는 30 분 또는 1 시간도 4 ° C에서 37 ° C 하나에 항체와 MDA 세포를 배양 하였다. 우리는 최대의 면역 형광이 관찰 된 것을 관찰30 분 (데이터 미도시) 및 전립선 세포의 면역 형광 표지 용으로 37 °의 C는 비 표지 전립선 세포에 비해 롤링 동작에 영향을주지 않았다.
두 번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 PPFC, Bioflux의 미세 유체 시스템 및 Microslides 7과 같은 다른 흐름 챔버 어셈블리를 테스트했다. PPFC는 생리 학적 유동 조건 9에서의 EC와 백혈구와 종양 세포의 상호 작용을 조사하는 의지가되고있다. 이 흐름 시스템은 암 세포 라인으로 세포의 많은 수의 상호 작용을 연구하기 위해 잘 작동하지만, 이러한 환자 유래의 CTCs 및 EC에 희귀 세포 사이의 상호 작용을 관찰하고 연구하기가 적합하지 않습니다. 의 CTCs 레어 셀되고, 따라서, 유동 채널의 전체 폭의 기록이 재생 분석에서의 CTCs / 내피 사이 희귀 이벤트의 상호 작용을 관찰하고 분석하는 데 필요한, 유동 채널의 임의의 위치에서 임의의 EC와 상호 작용할 수있다. 일PPFC (2.5 mm)에 사용 된 실라 스틱 가스켓의 전자 폭은 10 배 목표 아래보기의 전체 필드를 제공하지 않습니다. 잠시는 10X 대물보다 낮은 배율에서 깨끗이 CTC / EC 상호 작용을 관찰하기 어렵게된다. 또, 연결 관 낮은 데드 볼륨은 연결 튜브의 CTCs 포착을 방지하는 데 필수적이다. 표준 PPFC 제공 실라 스틱 연결 관은 넓은 내부 직경 (인치 0.16)가있다. 반대로, Bioflux의 미세 유체 시스템은 20X 목적에 따라보기의 전체 필드를 제공하고 EC에 14 전단에 의한 변경 사항을 공부에 유용하지만, 암 세포가 아닌 균일 한 흐름으로 이어지는 챔버 우물에 정착 시작합니다. Bioflux 미세 유체 그러나, 사용하기 기술적으로 복잡, EC에있는 전단에 의한 변경 사항을 공부에 유용합니다. 하는 마이크로를 사용하여 우리의 자기 조립 흐름 챔버는 더 많은 관측을 허용 PPFC의 표준 채널 폭보다 좁은 채널 폭 (1 mm)를 가지고tional 지역. 또한, 내장 컴퓨터가하는 마이크로 시뮬레이션 생리 혈액의 흐름에 관류에서 배양하는 Ganguly는 달리 등. 7, EC에 정적 조건 (넓은 채널 폭) microslides에 재배 연구. 연결 관 내부 불감 부피 총칭 전립선 종양 세포의 면역 형광 라벨링 적절한 유동 채널 폭, 연결 튜브의 작은 내부 직경 0.02 인치의 내경과 연결 관을 사용하여 감소된다 한 전립선의 CTCs를 식별 할 수 있으며 내장 컴퓨터와의 상호 작용을 관찰합니다.
프로토콜에 몇 가지 중요한 단계는 실험이 원활하게 실행할 수있는 적절한 치료와 함께, 그러나,이 있습니다. 거품의 방지는 플로우 기반 실험을 위해 매우 중요합니다. 우리의 경험에서, 따뜻한 (37 ℃) 성장 매체, 커넥터 및 주사기를 사용하여 온도 차이를 줄여 거품의 형성을 방지 할 수 있습니다. 객실에는 위성에서마이크로 슬라이드에 주사기를 연결하는 동안 N,주의를 기울여야합니다. 두 주사기 및 마이크로 슬라이드의 유입구에 연결된 커넥터는 임의의 기포 형성을 방지하여, 테두리로 채워 져야한다. 기술의 한계 중 하나는 마이크로 슬라이드 채널 (45)은 X 1mm (길이 × 폭)이기 때문에, 단지 성장 배지의 4.5 μl를 보유 할 수 있다는 것이다. 따라서하는 마이크로 정적 문화에 사용 산성화를 방지하고 HUVEC를위한 영양소의 적절한 공급을 유지하기 위해 성장 매체의 지속적인 살포를 필요로 할 수 없습니다. 그러나, 매체의 연속적인 공급이 용이 인큐베이터에서 마이크로 슬라이드에 연결된 주사기 펌프를 사용하여 달성 될 수있다. 전립선 암 환자에서의 CTCs을 풍부하게하는 동안, 치료는 미리 코트에주의해야한다 모든 튜브, 팁, 피펫, 비 특정 바인딩을 방지하기 위해 R / S 버퍼와의 CTCs과 접촉 주사기. 또한, 모든 단계 후 피콜 - paque 밀도 원심 분리, 전자XCEPT J591-488 항체 배양은의 CTCs의 저하를 방지하기 위해 4 ° C에서 실시되어야한다.
우리의 기술은 CTC 생물학을 이해하는 다른 방법에 비해 독특하다. 본 보고서는 하나의 단지 표현형 특성 외에, 전립선의 CTCs의 기능적 특성을 관찰 할 수 있습니다 전립선의 CTCs 가능한 형광 immunolabeling에 대해 설명합니다. 또한, 기재된 방법은 면역 형광 연구에 이상적인 시스템 만드는 다른 방법보다 낮은 시료 / 시약 양을 필요로한다. 우리의 방법론은 따라서, 전립선 암 전이의 개발에 관련된 메커니즘을 이해하는 데 도움이, 환자와 내피에서 파생 된 전립선의 CTCs 사이의 상호 작용을 연구 할 수있는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 세포 - 세포 상호 작용 8, 세포 단백질 상호 작용 (15) 등의 전단 흐름을 기반으로 연구를 포함한 여러 응용 프로그램에 대한 잠재력을 가지고 (16), 및 EC에 14 전단에 의한 변경.
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Disclosures
박사 Bander도이 문서에서 사용되는 J591 항체에 대한 코넬 연구 재단 ( "CRF")에 할당 된 특허의 발명자이다. 박사 Bander도 컨설턴트와 BZL 생물 의약품의 특허가 추가 연구 및 개발을위한 CRF에 의해 허가 된 것으로 회사의 주식을 소유하고 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부서의 방어 전립선 암 연구 프로그램 (W81XWH-12-1-0124)에서 자금에 의해 지원되었다, 국립 암 연구소, 그리고 로버트 McCooey 비뇨 생식기 종양학 연구 기금 U54CA143876. 우리는 HUVEC를 제공을위한 VE-cadherin의 항체를 제공하기 위해 박사 Annarita 로렌조 (병리학 교실)를 감사, 박사 마르코 Seandel (외과학 교실) 것이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
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