Summary
הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.
Abstract
גרורות היא תהליך שבו תאים סרטניים לשפוך ממערכת הלימפה וכלי דם גידול הראשוני intravasate דם, ובכך לקבל גישה לextravasate ויוצר נישה משני. Extravasation של תאים סרטניים ממערכת כלי דם דם ניתן ללמוד באמצעות תאי אנדותל (ECs) ותאים סרטניים המתקבלים משורות תאים שונות. מחקרים ראשוניים שנערכו באמצעות תנאי סטטי, אבל זה כבר מתועד היטב כי ECs מתנהג באופן שונה בתנאי זרימה פיסיולוגיים. לכן, מכלולי תא זרימה שונים משמשים כיום לחקר אינטראקציות של תאי סרטן עם ECS. מכלולי תא הזרימה הנוכחיים מציעים תוצאות לשחזור או באמצעות קווי תאים שונים או נוזל בתנאי לחץ גזירה שונה. עם זאת, כדי להתבונן וללמוד אינטראקציות עם תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs), שינויים מסוימים נדרשים להתבצע להרכבת תא זרימה הקונבנציונלית. CTCsהם אוכלוסיית תאים נדירה בין מיליון של תאי דם. כתוצאה מכך, קשה להשיג אוכלוסייה טהורה של CTCs. זיהום של CTCs עם סוגים שונים של תאים בדרך כלל נמצאים במחזור הדם הוא בלתי נמנע באמצעות העשרה בהווה או בטכניקות דלדול. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה ייחודית לתאים סרטניים fluorescently תווית במחזור ערמונית וללמוד האינטראקציות שלהם עם ECs במערכת תא זרימה עצמית התאספו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת נוספת לצפות אינטראקציות בין CTCs ערמונית וכל חלבון של עניין.
Introduction
גרורות היא תהליך רב שלבים מורכבים שנשאר הבינו היטב. ציר יגנד E-selectin/selectin הוכח לשחק תפקיד חשוב בגרורות סרטניים על ידי קידום אינטראקציות דבק עיקריים בין האנדותל של כלי הדם והתאים סרטניים 1,2. אנדותל (E)-selectin הוא חלבון הטרנסממברני לידי ביטוי על ידי תאי האנדותל הופעלו, ואילו ליגנד שונה E-selectin (ים) באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול 3. במבחנה גישות רבות כבר מועסקות בהצלחה למודל אינטראקציות E-selectin/selectin יגנד בין תאים סרטניים ותאי אנדותל (ECs) 1. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מערכות תא זרימה שונות להיות מועסקות כדי לדמות מערכת כלי דם בדם. בין מכלולי תא זרימה, חדר זרימת לוחות מקבילים (PPFC) בשיתוף עם ECs משמש באופן שגרתי כמבחנת מודל בהדמיה בתנאי לחץ הגזירה vivo. בזהשיטה, ECS גדלים על צלחת 35 מ"מ ולאחר השיג monolayer, ECS מחוברים PPFC וניסויים מבוססי מאמץ גזירה מבוצעים.
עם זאת, PPFC ומערכות שוטפות אחרות להציג מגבלות רבות לחקר אינטראקציות דבק בין תאים סרטניים במחזור (CTCs) נגזרים מחולים וECS, בעיקר, כי CTCs הוא אוכלוסייה נדירה של תאים, לשפוך מן הגידול הראשוני, במחזור בין מיליוני תאי דם (1 CTC לכל 10 9 תאי דם) 4. לפיכך, בניגוד לאספקה בלתי מוגבלת של שורות תאים בתרבית, ספירת CTC נמוכה להוביל לאינטראקציות CTC / EC כמה ונדירות מאוד, הדורשת רוחב ערוץ זרימה נכון כדי להקליט את האינטראקציות לניתוח השמעה. בנוסף, מאז CTCs נגזר המטופל הוא אוכלוסייה טמאה, ולכן סמן זיהוי נדרש כדי לעקוב אחר CTCs בספציפי. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חדשה לזיהוי סרטן הערמונית (PCA) CTCs על ידי ניצול של העובדה שכמעט כל CTCs אלה מבטאים אנטיגן הספציפי לערמונית קרום (PSMA) על פני התא שלהם 5,6. בדו"ח זה, השתמשנו בשורת תאי סרטן הערמונית, מד"א PCa2b (מד"א), כדי להדגים את התועלת הפוטנציאלית של המערכת החדשה שלנו כדי לחקור אינטראקציות CTC ערמונית עם ECS, סופו של דבר להבין את המנגנון של גרורות.
המתודולוגיה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניסויי גזירה מבוססות שונים לדמות במערכת כלי דם vivo 7-9. חוץ מבחינת אינטראקציות PCA CTC / EC, מערכת תא הזרימה הנוכחית יכולה להתאים בקלות לניתוח תאי הדם היקפיים mononuclear או אינטראקציות של התאים סרטניים עם ECS. הקלות של פירוק והרכבה של תא הזרימה, microslide III (0.1) (להלן כmicroslide), מאפשרת culturing ECs תחת זלוף ומגרה ECs עם ציטוקינים שונים כדי לגרום ליחסי ציבורotein ביטוי. חוץ מזה, ECs התרבותי, יכולים להיות מצופים חלבונים רקומביננטיים כגון E-ו-P-selectin על microslide ואינטראקציות עם תאים סרטניים יכול להיות שנצפה בתנאי זרימה למינרית 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing HUVECs על Microslides לאינטראקציות התבוננות CTC-אנדותל
- מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה, לשטוף ראשון microslide, רוחב ערוץ של 1 מ"מ עם PBS. בעדינות מעיל microslide עם 200 μl של 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין (מומס בPBS) באמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ"ל.
- כסה microslide עם המכסה ולשמור אותו בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה למשך 30 דקות. מחלק איטי של הנוזל בmicroslide מונע היווצרות בועה בערוץ.
- Perfuse 200 μl של (37 מעלות צלזיוס) HUVEC מדיום גידול החם (מדיה M199, 1M HEPES, 20% FBS, 5 מ"ג / מיליליטר הפרין, גורם גדילת תא האנדותל 100 מיקרוגרם / מיליליטר, ו-L-גלוטמין) מעל microslide ודגירה 20 דקות ב RT. במהלך זלוף, להכין את ההשעיה תא HUVEC.
- יש לשטוף HUVECs עם PBS ולהוסיף 0.05% טריפסין-EDTA במשך 1-2 דקות ב RT. צנטריפוגה HUVECs ב2 מדיום גידול מיליליטר ב 180 XG במשך 5 דקות.
- למדוד את ריכוז התאים באמצעות neubahemocytometer uer ולהכין 10 7 cells/100 HUVEC μl מדיום גידול. לאחר מכן, להסיר בזהירות את המדיום מהמפרצון של microslide באמצעות פיפטה קצה 200-μl.
- להביא microslide לגובה עיניים ובאמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ"ל, בעדינות ינקב 200 μl ריכוז מוכן של HUVECs לתוך התעלה. זהירות נדרשת בשלב זה כדי למנוע היווצרות בועה. אם הבועות מופיעות, לשמור מרוסס לזמן מעט ארוך יותר עד שבועות להיכנס לערוץ לשקע.
- שים את הנפח שווה (~ 80 μl) של תקשורת HUVEC בשתי הכניסה והיציאה של microslide. זה מונע את הזרימה של תאים בכל כיוון.
- כסה את השקופית ולשמור אותו בחממה (C ° 37) ל1.5 שעות.
2. הכנת תזרים עצרת הלשכה ללילה HUVEC התרבות בMicroslide
- הנח מזרק סטרילי 20-מיליליטר, מחברים Luer נשיים וגברי, צינורות, ומשאבת מזרק בחממה במשך 15 מיילn.
- עבור נפח מת מינימאלי, השתמש בצינורות עם קוטר פנימי של 0.04 סנטימטרים. קוטר צינורות קטן יותר מונע היווצרות בועה.
- מלא את מזרק 20 מ"ל עם חמה (37 מעלות צלזיוס) HUVEC תקשורת (12 מיליליטר). צרף את צינורות עם המחברים על המזרק. הסר את הבועות. חבר אסיפה זו לmicroslide.
- לחלוטין למלא את המפרצון של microslide עם תקשורת HUVEC. להביא את מזרק 20-מיליליטר המלא מצורף למחבר ליד microslide. בעדינות לצרף את המחבר לmicroslide.
- להביא את ההגדרה לתוך החממה ולחבר אותו למשאבת המזרק, שקיעה ב שיעור הגזירה μl / min 10. השאר את התאים O / N בחממה ב 37 ° C.
- למחרת, לפרק את ההגדרה על ידי הסרת את המחבר המצורף למפרצון של microslide.
- לupregulate ביטוי E-selectin על ECS, להכין מדיום גידול טרי המכיל IL-1β ב10 ng / ml ב4 מיליליטר תקשורת. לשאוב את התקשורת במזרק 10 מ"ל. הסר tהוא אמצעי התקשורת מהמפרצון של microslide ולחבר את המזרק לשקופית.
- הגדר את משאבת המזרק בשיעור הגזירה μl / min 10 עבור 4 שעות בחממה.
תאי סרטן הערמונית 3. הכנת אנטי PSMA (J591-488) תווית
- במהלך הדגירה IL-1β של HUVECs, להכין תאי PCA J591-alexa488 אנטי PSMA שכותרתו. הוספת 0.05% טריפסין-EDTA לתאי מד"א דקות 1. אל תחשוף את תאי טריפסין לזמנים ארוכים יותר כפי שהוא יכול להשפיע על glycopeptides ההווה על פני התא. גם מגיב תא דיסוציאציה בחינם אנזים יכול לשמש במקום טריפסין. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות.
- Resuspend תא גלולה מד"א במאגר H מיליליטר / H 1 (% solution/0.1 מלח מאוזן הנקס HSA/10 HEPES מ"מ / 1 מ"מ CaCl 2). הוסף נוגדן J591-alexa488 אנטי PSMA ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך. Resuspend התאים במהלך הדגירה.
- לאחר 30 דקות, צנטריפוגה פתרון התא בXG 800 למשך 5 דקות. ASPIשיעור וresuspend את הכדור במאגר H / H 1 מיליליטר. ספירת תאי מד"א שהכותרת ולהביא את הריכוז הסופי ל1x10 6 תאים / מיליליטר. ממלאי מזרק של 5 מיליליטר עם J591-488 תאי מד"א שכותרתו ולהסיר את הבועות.
4. הכנת אנטי PSMA (J591-488) מועשר CTCs תווית מחולי PCA
- לאסוף 7.5 דם מיליליטר מחולים בסרטן ערמונית בצינור כחול כובע (המכיל נתרן ציטרט). בעדינות לדלל 01:01 דם ב0.1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
- הוספת 5.3 מיליליטר Ficoll-Paque תוספת בצינור חרוטי 50 מ"ל. שכבת דילול דם על גבי Ficoll-Paque. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות.
- טרום מעיל כל הצינורות או הטיפים הבאים במגע עם CTCs עם 2% FBS/RPMI-1640 / 1 מ"מ CaCl 2/4 מ"מ MgCl 2 (חיץ R / S) כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של CTCs למשטחים. לשמור על טמפרטורת 4 מעלות צלזיוס של תקשורת ומאגרים הבאים במגע עם CTCs.
- איסוף תאי הדם ההיקפי mononuclear שבריר (PBMCs)המכיל CTCs מהממשק בצינור אחר 50 מ"ל חרוטי המכילים חיץ R / S 30 מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 8 דקות.
- Resuspend את הכדור ולשטוף שוב במאגר R / S ב XG 400 במשך 8 דקות. לאחר צנטריפוגה, resuspend את הכדור במאגר H / H. הוסף נוגדן אנטי PSMA J591-488 ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך.
- לאחר 30 דקות, צנטריפוגות PBMCs מכילה J591-488 CTCs כותרת בXG 800 למשך 5 דקות. Resuspend במאגר H / H. ממלאי מזרק 1 מ"ל (טרום מצופה עם חיץ R / S) עם המדגם.
5. הכנת מיקרוסקופ, מזרק משאבה וזרימת עצרת קאמרית
- הפעל את מיקרוסקופ ההפוכה ולהגדיר את תאורת קולר ב10X אובייקטיבי. להביא את משאבת המזרק באותה הרמה כמו בשלב המדגם של מיקרוסקופ ולהגדיר אותו בלחץ dyn 1/2 סנטימטר גזירה (~ 10 μl / min).
- פתח את תוכנת Zeiss AxioVision. בחר את המטרה על מסך המחשב. צור חדשתיקייה תחת אפשרות הכלים בתוכנה.
- פתח את אפשרות ניסויים החכמים בAxioVision ולהתאים את ההגדרות כדי להקליט קטעי וידאו שניות קצרים 30 ל30 דקות.
- עבור וידאו ניאון חי, להגדיר את האפשרויות-12 תמונה msec החשיפה, 2 x 2 סל, 5 רווח. פרמטרים אלה מסייעים בהשגת קטעי וידאו קרוב למסגרת שיעור וידאו (~ 23 מסגרות לשנייה) עם המצלמה Zeiss MRM.
- כדי להמחיש את הרוחב מלא של ערוץ הזרימה ב10 אובייקטיבי X על מסך המחשב, להשתמש במתאם C-Mount (0.63 ממשק xf/60 מ"מ).
- מדליק את מנורת הכספית.
- הנח את המזרק והמחבר המכיל את התאים על גבי משאבת המזרק.
- להביא IL-1β מגורה HUVECs מן החממה. חבר את המחבר לערוץ כניסה המלא של microslide מכיל HUVECs.
- חבר את הערוץ לשקע עם המחבר המחובר לצינורות. שים את הצינור לתוך צלחת או 15 צינור חרוטי מיליליטר לאסוף את הזרימה דרך.
- התחל infusiעל דרך microslide ב10 μl / min. שים לב ליחסי הגומלין בין תאי אנדותל ותאי מד"א שכותרתו או CTCs שכותרתו נגזר מחולים תחת מסנן 488 ננומטר במיקרוסקופ epifluorescence.
- להתחיל להקליט את הניסוי כקטעי וידאו קצר 30 שניות. במהלך ניתוח השמעה, למדוד את המהירות מתגלגלת. מהירות רולינג נמדדה על ידי חלוקת המרחק שעובר התאים לאורך זמן.
6. Immunostaining של Microslide
- הסר את המדיה מהכניסה והיציאה של microslide לאחר מרוסס תאי מד"א על IL-מגורה 1β HUVECs 10 דקות.
- באמצעות קצה 200-μl, לשים חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל סידן ומגנזיום לתוך המפרצון של microslide למשך 5 דקות. הטה את microslide באמצעות המכסה שלה כאבזר על הספסל. שמור microslide בעמדה מוטה לכל incubations במהלך immunostaining.
- תקן HUVECs ידי מרוסס פורמלדהיד 2% חמים לתוך המפרצון
- הוספת Triton-X 100 (0.1%) BSA 5% ב-PBS עבור 10 דקות ב RT.
- יש לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם BSA 5% ב-PBS למשך 30 דקות.
- דגירה עם עז נוגדן ראשוני נגד VE-cadherin (1:100) ב2.5% O BSA / N ב 4 ° C.
- למחרת, לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. הוסף נוגדן אנטי עז 647 חמור משנית ל45 דקות. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- לדגור על RT עם נוגדנים מצומדות אנושיים J591-alexa488 במשך שעה 1.
- לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. להוסיף DAPI למשך 5 דקות. לשטוף עם מים מזוקקים למשך 5 דקות.
- הוסף PBS (או Mowiol עבור אחסון לטווח ארוך). דמיין microslide תחת מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את תרבות O / N של monolayer של ECs על microslide. Scalings באיור 1A מראה כי של microslide 100% גלויים באמצעות אובייקטיבי 5X תוך 70% גלויים באמצעות מטרת 10X (איור 1). עבור אינטראקציות E-selectin בתיווך, תאים מתגלגלים בקצוות אינם נחשבים שהופך יותר מ -70% מmicroslide זמינים להקלטת וידאו וניתוח השמעה. מניסיוננו, בתחילה הרכבה הגדרה זו צריכה קצת פרקטיקה לתרבות monolayer של ECs תחת מאמץ גזירה. לאחר הקמת צמיחת EC על microslide, אנחנו שכותרתו מד"א, תאי סרטן ערמונית. הספציפיות של J591-488 נוגדן אנטי PSMA נבדקו באמצעות תאי מד"א זינקו בדם תורם בריא ושכותרתו עם שכותרתו fluorescently נוגדנים חד שבטיים אנטי PSMA J591-488. לא immunostaining PSMA נצפה בPBMCs (מידע לא מוצג). כדי לשלול את האפשרות שJ591-488 מחייבים ואלטע ההפנמהrs מתגלגל התנהגות, אנחנו שכותרתו תאי מד"א עם J591-488 והשווינו את ההתנהגות מתגלגלת עם תאי מד"א ללא תווית במאמצי גזירה הנעים 1-10 dyn / 2 סנטימטר. עלילת התיבה מציגה את התפלגות מהירויות גלגול של שני תאי מד"א ללא תווית וכותרתו J591-488 על IL-מגורה 1β ECs בתנאי לחץ גזירה שונים. לא נצפה הבדל משמעותי במהירויות מתגלגלות ב1 ו -5 dyn / 2 סנטימטר, p = 0.634 וp = 0.601, בהתאמה (איור 2). במאמץ גזירה גבוה יותר של 10 dyn / 2 סנטימטר, הבדל מובהק סטטיסטי נצפה בין מהירויות גלגול של תאי ללא תווית ומד"א שכותרת J591-488 (p <0.05). מחקרים קודמים מראים כי במאמץ גזירה גבוה יותר (> 3 dyn / 2 סנטימטר) תנאים, תאים סרטניים פחות לדבוק ומתגלגלים על ECs בהשוואה לתנאי לחץ גזירה נמוכים יותר 11,12. לכן, מחקרי ניתוח אינטראקציות בין תאים סרטניים וECs נערכים במאמצי גזירה נמוכים יותר. השלנו, הנתונים שלנו מצביעים על כך שיכול להיות מתויג CTCs עם J591-488 ושניאון תיוג של CTCs אינו משפיע על ההתנהגות מתגלגלת במגוון רחב של מאמץ גזירה באופן משמעותי. ראוי לציין, שלא לזהות כל אינטראקציות CTC / EC בהיעדר גירוי IL-1β של ECS (מידע לא מוצג). בנוסף, כהוכחת עיקרון, אנחנו גם כותרת CTCs המועשר מבודד מחולי CRPC עם J591-488 וperfused על IL-מגורה 1β ECS. וידאו תפור זמן מראה את הסוגים השונים של אינטראקציות בין הערמונית CTCs וECS (וידאו 1). הווידאו מראה שלושה סוגים של הידבקות אינטראקציות יציבה (CTCs לא לנתק גם לאחר 30 שניות), קשירה (CTCs לצרף ולצרף), ואין אינטראקציות. ניתן immunostained Microslides בקלות וניתן לקחת תמונות ניאון, כי יש לי microslides מאפיינים אופטיים דומים כמו coverglass העבה 1.5 מ"מ 7. איור 3 מציג את הידבקות משרד J591-488 האחוריים תאי מד"א שכותרתוזלוף אה על IL-מגורה 1β ECS.
איור 1:. Monolayer של תאי אנדותל בתרבית על microslide HUVECs היה O התרבותי / N על פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) microslide המצופה III (0.1) תחת מאמץ גזירה (1 dyn / 2 סנטימטר)) במטרת 5X. (EC תכנית Neofluar 5X/0.16), רוחב ערוץ הזרימה להשלים עם ECs התרבותי נצפה. רוחב הערוץ נמדד להיות 1,545.95 מיקרומטר. ב ') ב10X אובייקטיבי (תכנית Neofluar 10X/0.3 PH1), 1,065.79 מיקרומטר של הערוץ נצפה. הדבר מצביע על כך ECs יכול להיות מתורבת O / N על microslide ו70% מmicroslide נראים בהגדלה 10x. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר ישrsion של נתון זה.
איור 2. מהירות רולינג של תאי מד"א על ECs תרבית על microslide. אחת מיליון תאי מד"א שכותרת ללא תווית וJ591-488 היו perfused על IL-מגורה 1β HUVECs. עשרה קטעי וידאו בתחומים שונים בmicroslide נרשמו ב1,5, ו10 dyn / 2 סנטימטר. חישובי מאמץ גזירה סופקו על ידי היצרן. ניתוח לא מקוון עבור המהירות מתגלגלת בוצע. n = מספר התאים נספרו למדידות מהירות מתגלגלות. עלילת התיבה מציגה את התפלגות מהירויות גלגול וההבדלים בין חציון J591-488 תאי מד"א שכותרת וללא תווית. p <0.05, בדיקת סכום דרגת Wilcoxon. העיגולים מייצגים את כל החריגות. אנא לחץ כאן כדי VIEW גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Immunostaining של תאי מד"א אינטראקציה עם ECs על microslide. אחת מיליון תאי מד"א היו perfused על IL-מגורה 1β HUVECs בdyn 1/2 סנטימטר מאמץ גזירה. לאחר זלוף, immunostaining בוצע על microslide. ראשי החץ הצהובים מראים תאי מד"א דבקו בתקיפות לECS. PSMA = אדום, VE-cadherin = ירוק, DAPI = כחול. התמונה הממוזגת מציגה את כל הצבעים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו 1. וידאו המראה את האינטראקציות בין HUVECs מגורה-IL-1β וCTCs כותרת J591-488 אנטי PSMA מועשר מחולת סרטן ערמונית. O monolayerו HUVECs היה בתרבית על microslide III (0.1) והתאים אנטי PSMA כותרת J591-488 היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) המכיל CTCs מועשר ממטופל היה perfused על HUVECs בdyn 1/2 סנטימטר. במהלך זלוף, קטעי וידאו שניות קצרים 30 נרשמו, בתחומים שונים בmicroslide. זמן הרכישה של הווידאו מוצג בפינה השמאלית התחתונה. קטעי וידאו קצרים שונים היו מאוחה להדר בסרטון זה. ב02:16:36, CTC ללא אינטראקציה נכנס לשדה השמאלי העליון של תצוגה; ב2:19:16, עוד CTC ללא אינטראקציה נכנס לשדה הפינה השמאלי של תצוגה; ב02:23:12, CTC דבק ביציבות בתחום אמצע החלק העליון של תצוגה ראה. ב02:38:09, CTC דבק ביציבות הוא ראה בצד ימין של שדה הראייה הוא ראה. סרטון זה צולם באמצעות שני בהיר שדה וערוץ ניאון כדי להראות אינטראקציות של PBMCs גם כן. ב02:40:18, CTCs דבק ביציבות נצפו בתחום אמצע החלק העליון של תצוגה. סרטון זה צולם באמצעות בהיר שדהוערוץ ניאון כדי להראות את ההתנהגות מתגלגלת בPBMCs. מ2:51:39 דרך 2:51:49, CTC קשירת התנהגות בתערוכה נצפתה בשדה התחתון של תצוגה. לחץ כאן לצפייה בוידאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל המספר הנמוך של CTCs בין תאי דם, קשה לבודד CTCs כאוכלוסייה טהורה של תאים. כדי לחקור אינטראקציות CTC / EC, האוכלוסייה נדירה וטמאה של CTCs מציבה שני אתגרים מרכזיים: א) זיהוי של CTCs בין תאי דם; ב) תצפית של אינטראקציות CTC / EC.
כדי להתגבר על המגבלה הראשונה של זיהוי CTCs ערמונית בקרב תאי דם, שנצלנו את העובדה שכמעט כל תאים סרטניים בערמונית להביע PSMA 6. נוגדן חד שבטי J591-488 מופנמים הבא על פני קרום תא מחייב המצביע על כך PCA CTCs יכול להיות מתויג vivo לשעבר ולמד לאינטראקציות CTC / EC 13. להפנמה אופטימלית של הנוגדן וimmunofluorescence המקסימאלי, אנו הודגרו תאי מד"א עם הנוגדן באו 4 ° C או 37 מעלות צלזיוס למשך שני 30 דקות או 1 שעה. הבחנו כי immunofluorescence המרבי נצפה בC ° 37 ל30 דקות (מידע לא מוצג) וסימון immunofluorescent של תאי ערמונית לא השפיע על ההתנהגות מתגלגלת בהשוואה לתאי ערמונית ללא תווית.
כדי להתגבר על המגבלה השנייה, בדקנו מכלולי תא זרימה שונים כגון PPFC, מערכת מיקרופלואידיקה Bioflux, ו7 Microslides. PPFC הפך עמוד התווך לבחון אינטראקציות ויקוציטים ותאים סרטניים עם ECs בתנאי זרימה פיסיולוגיים 9. מערכת זרימה זו פועלת היטב כדי לחקור אינטראקציות של מספר הגדול של תאים, כגון שורות תאי הסרטן, אך לא אידיאלי להתבונן ולחקור את יחסי הגומלין בין תאים נדירים כגון CTCs נגזר מטופל וECS. CTCs, להיות תאים נדירים, יכול לקיים אינטראקציה עם ECs באופן אקראי בכל מקום בערוץ הזרימה, ולכן, הקלטה של הרוחב המלא של ערוץ הזרימה נדרשת להתבונן ולנתח את אינטראקציות אירוע נדירות בין CTCs / ECs במהלך ניתוח השמעה. הרוחב דואר של אטם silastic משמש בPPFC (2.5 מ"מ) אינו מספק שדה מלא של תצוגה תחת 10x אובייקטיבי. אמנם, בהגדלה נמוכה יותר מאשר אובייקטיבי 10X, הוא הופך להיות קשה להתבונן אינטראקציות CTC / EC בצורה ברורה. בנוסף, נפח מת נמוך בצינורות חיבור הוא חיוני כדי למנוע השמנה של CTCs בצינורות חיבור. יש צינורות חיבור silastic מסופקים עם PPFC הסטנדרטי קוטר פנימי רחב (0.16 פנימה). אדרבא, מערכת מיקרופלואידיקה Bioflux מספקת שדה מלא של תצוגה תחת אובייקטיבי 20X והוא שימושי בלימוד-Induced שינויי גזירה בECs 14, לעומת זאת, תאי הסרטן להתחיל להתיישב בבארות קאמריות המובילות לזרימה לא אחידה. מיקרופלואידיקה Bioflux שימושי בלימוד-Induced שינויי גזירה בECS, לעומת זאת, הוא מבחינה טכנית מסורבל לשימוש. יש תא הזרימה שלנו עצמי התאספו באמצעות microslide רוחב צר ערוץ (1 מ"מ) מרוחב הערוץ הסטנדרטי בPPFC, המאפשר יותר תצפיותאזור tional. כמו כן, ECS בתרבית תחת זלוף בזרימת דם פיסיולוגי microslide לדמות, שלא כמו Ganguly et al. 7, מחקרים שבם ECs גדלים על microslides (עם רוחב ערוץ רחב יותר) בתנאים סטטיים. הנפח המת בתוך צינורות חיבור הוא ירד באמצעות צינור חיבור עם קוטר פנימי של 0.02 פנימה ביחד, תיוג immunofluorescent של תאים סרטניים בערמונית, רוחב ערוץ זרימה תקין, וקוטר פנימי קטן יותר של צינורות חיבור מאפשר לזהות CTCs ערמונית ו לבחון יחסי הגומלין שלהם עם ECS.
יש כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול, לעומת זאת, עם טיפול הולם הניסויים יכולים לפעול בצורה חלקה. מניעה של בועות היא קריטית עבור כל ניסויים המבוסס על זרימה. מניסיוננו, באמצעות חם (37 מעלות צלזיוס) מדיום גידול, מחברים, ומזרק מונע היווצרות של בועות על ידי צמצום הבדלי הטמפרטורה. בaddition, יש להיזהר בעת חיבור המזרק עם microslide. שני המחבר המצורף למזרק והמפרצון של microslide צריך להיות מלא עד אפס המקום, ובכך, למנוע כל היווצרות בועה. אחת המגבלות של הטכניקה הוא שמאז ערוץ microslide הוא מ"מ 45 x 1 (רוחב x אורך), זה יכול להחזיק רק 4.5 μl של מדיום גידול. לכן, microslide לא יכול לשמש לתרבות סטטי ודורש זלוף המתמשך של מדיום גידול כדי למנוע החמצה ושמירה על אספקה תקינה של חומרי הזנה לHUVECs. עם זאת, אספקה רציפה של מדיום יכולה להיות מושגת בקלות על ידי שימוש במשאבת מזרק מחוברת לmicroslide בחממה. תוך העשרת CTCs מחולים בסרטן הערמונית, יש להיזהר מראש מעיל כל צינורות, טיפים, טפטפות, ומזרקים שבאו במגע עם CTCs עם חיץ R / S כדי למנוע הלא ספציפי מחייב. בנוסף, כל צעדי צנטריפוגה צפיפות לאחר Ficoll-Paque, דוארדגירה נוגדן xcept J591-488, צריכה להתנהל על 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה של CTCs.
הטכניקה שלנו היא ייחודית בהשוואה לשיטות שונות להבנת ביולוגיה של CTC. הדו"ח הנוכחי מתאר immunolabeling ניאון קיימא של CTCs ערמונית המאפשר אחד כדי לבחון את המאפיינים הפונקציונליים של CTCs ערמונית, חוץ מזה רק את המאפיינים פנוטיפי. בנוסף, בשיטה המתוארת דורשת נמוך מדגם / מגיב נפח מאשר שיטות אחרות מה שהופך את מערכת אידיאלית ללימודי immunofluorescence. המתודולוגיה שלנו מספקת פלטפורמה ייחודית כדי לחקור אינטראקציות בין CTCs הערמונית נובע מחולים וECS, ובכך, מסייע להבין את המנגנונים מעורבים בהתפתחות של גרורות בסרטן ערמונית. טכניקה זו יש את הפוטנציאל עבור יישומים מרובים הכרוכים בלימודי זרימה מבוססות גזירה, כגון תאי תאי אינטראקציות 8, אינטראקציות תא חלבון 15 16, ו- Induced שינויי גזירה ב14 ECS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר בנדר הוא ממציא על פטנטים המוקצים לקורנל Research Foundation ("CRF") לנוגדן J591 בשימוש במאמר זה. ד"ר בנדר הוא יועץ ולבעלי מניות BZL ביולוגי, החברה שבה לפטנטים שמורשים על ידי CRF למחקר ופיתוח נוספים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מתכנית משרד ההגנה-ערמונית חקר הסרטן (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 מהמכון הלאומי לסרטן, ורוברט McCooey המין והשתן אונקולוגיה קרן המחקר. ברצוננו להודות לד"ר Annarita ורנצו (מחלקה לפתולוגיה) על מתן נוגדני VE-cadherin, וד"ר מרקו Seandel (מחלקה לכירורגיה) למתן HUVECs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
