Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في الطريقة المختبر لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا

Published: May 15, 2014 doi: 10.3791/51468
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Department of Urology, Weill Cornell Medical College

Summary

يصف تقريرنا طريقة فريدة لتصور وتحليل التفاعلات CTC / المفوضية الأوروبية في سرطان البروستاتا في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية.

Abstract

ورم خبيث هو العملية التي الخلايا السرطانية من الورم تسليط intravasate الوعائية الدموية الابتدائي والجهاز الليمفاوي، وبالتالي، الوصول إلى يتسرب وتشكيل مكانة ثانوية. وتسرب الخلايا السرطانية من الدم الأوعية الدموية يمكن دراستها باستخدام الخلايا البطانية (ECS) والخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من خطوط مختلفة من الخلايا. وأجريت الدراسات الأولية باستخدام ظروف ثابتة ولكنها قد تم توثيقه جيدا أن ECS تتصرف بشكل مختلف في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. لذلك، يتم استخدامها حاليا مختلف التجمعات غرفة التدفق لدراسة التفاعلات الخلايا السرطانية مع ECS. المجالس الحالية غرفة التدفق تقديم نتائج قابلة للتكرار سواء باستخدام خطوط مختلفة من الخلايا أو السوائل في مختلف ظروف إجهاد القص. ومع ذلك، لمراقبة ودراسة التفاعلات مع خلايا نادرة مثل الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي)، يطلب من بعض التغييرات التي ينبغي إدخالها على التجمع التقليدي غرفة التدفق. التدرجيهي السكان الخلية نادرة بين الملايين من خلايا الدم. وبالتالي، فمن الصعب الحصول على السكان نقية من التدرجي. تلوث التدرجي مع أنواع مختلفة من الخلايا التي توجد عادة في التداول أمر لا مفر منه باستخدام تقنيات تخصيب الحاضر أو ​​استنزاف. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة فريدة من نوعها لتسمية تعميم خلايا سرطان البروستاتا fluorescently ودراسة تفاعلاتها مع ECS في نظام غرفة التدفق الذاتي تجميعها. هذه التقنية يمكن تطبيقها كذلك لمراقبة التفاعلات بين التدرجي البروستاتا وأي بروتين من الفائدة.

Introduction

ورم خبيث معقد عملية متعددة الخطوات التي لا تزال غير مفهومة تماما. وقد تبين محور يجند E-selectin/selectin للعب دورا هاما في الورم ورم خبيث من خلال تعزيز التفاعلات الأولية لاصقة بين بطانة الأوعية الدموية والخلايا السرطانية 1،2. البطانية (E)-selectin هو بروتين عبر الغشاء الذي أعرب عنه تنشيط الخلايا البطانية، في حين يتم التعبير عن مختلف يجند selectin E (ق) من قبل الخلايا السرطانية 3. وقد استخدمت العديد من النهج بنجاح في المختبر لنموذج التفاعلات يجند E-selectin/selectin بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية (ECS) 1. لدراسة هذه التفاعلات، يجري استخدام أنظمة مختلفة لمحاكاة غرفة تدفق الدم الأوعية الدموية. بين تدفق المجالس الغرفة، ويستخدم بشكل روتيني موازية لوحة غرفة تدفق (PPFC) بالتزامن مع ECS باعتباره محاكاة في المختبر في ظروف إجهاد القص الجسم الحي الطراز. في هذاتزرع الأسلوب، ECS على طبق 35 ملم وبعد تحقيق أحادي الطبقة، هي التي تعلق ECS إلى PPFC ويتم تنفيذ تجارب إجهاد القص القائمة.

ومع ذلك، PPFC وغيرها من النظم الحالية تقديم الكثير من القيود لدراسة التفاعلات لاصقة بين الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي) المستمدة من المرضى وECS، في المقام الأول، لأن التدرجي هي نادرة السكان من الخلايا، تسلط من الورم الرئيسي، تعميم بين الملايين من خلايا الدم (1 CTC في 10 9 خلايا الدم) 4. وبالتالي، على عكس العرض غير محدود من خطوط الخلايا المستزرعة، التهم CTC منخفضة تؤدي إلى عدد قليل جدا ونادرة التفاعلات CTC / EC، تتطلب المناسبة عرض القناة تدفق لتسجيل لتحليل التفاعلات التشغيل. بالإضافة إلى ذلك، منذ المريض التدرجي المستمدة من السكان نجس، لذلك لا بد من وضع علامة تحديد لتتبع التدرجي بشكل خاص. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتحديد سرطان البروستاتا (PCA) CTخدمات العملاء من خلال الاستفادة من حقيقة أن جميع هذه التدرجي التعبير عن مستضد البروستات محددة غشاء (PSMA) على سطح الخلية الخاصة بهم 5،6. في هذا التقرير، استخدمنا خط الخلايا السرطانية في البروستاتا، MDA PCa2b (MDA)، للتدليل على فائدة محتملة من النظام الجديد لدينا لدراسة البروستاتا CTC التفاعل مع ECS، في نهاية المطاف إلى فهم آلية الانبثاث.

منهجيتنا يمكن تطبيقها على مختلف التجارب القائمة على محاكاة القص في نظام الأوعية الدموية فيفو 7-9. بالإضافة إلى دراسة التفاعلات PCA CTC / EC، ونظام غرفة التدفق الحالي يمكن تكييفها بسهولة لتحليل خلايا الدم المحيطية أو تفاعلات الخلايا السرطانية 'مع ECS. سهولة تفكيك وإعادة تجميع للغرفة التدفق، وهي شريحة مجهرية الثالث (0.1) (ويشار إليه فيما بعد ب شريحة مجهرية)، ويسمح زراعة ECS تحت نضح وتحفيز ECS مع السيتوكينات المختلفة للحث على العلاقات العامةotein التعبير. الى جانب ذلك، مثقف ECS، البروتينات المؤتلف مثل E-وف selectin يمكن أن تطلى على شريحة مجهرية والتفاعل مع الخلايا السرطانية يمكن ملاحظتها تحت ظروف تدفق الصفحي 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التثقيف HUVECs على Microslides لرصد التفاعلات CTC-البطانية

  1. تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وشطف أول شريحة مجهرية، عرض قناة من 1 ملم مع برنامج تلفزيوني. بلطف معطف شريحة مجهرية مع 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل فبرونيكتين (المنحلة في برنامج تلفزيوني) باستخدام حقنة 1 مل يور للانغلاق.
  2. تغطية شريحة مجهرية مع غطاء والحفاظ عليه داخل غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة. الاستغناء بطء السائل في شريحة مجهرية يمنع تشكيل فقاعة في القناة.
  3. يروي 200 ميكرولتر من الحارة (37 درجة مئوية) HUVEC النمو المتوسطة (M199 وسائل الإعلام، 1M HEPES، 20٪ FBS، 5 ملغ / مل الهيبارين، وعامل نمو الخلايا البطانية 100 ميكروغرام / مل، والجلوتامين L-) على شريحة مجهرية واحتضان ل 20 دقيقة في RT. خلال نضح، وإعداد تعليق خلية HUVEC.
  4. شطف HUVECs مع برنامج تلفزيوني وإضافة 0.05٪ التربسين EDTA-لمدة 1-2 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في 2 HUVECs المتوسطة النمو مل في 180 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. قياس تركيز الخلية باستخدام neubaعدادة الكريات اتحاد الاذاعات الأوروبية وإعداد 10 7 HUVEC cells/100 ميكرولتر النمو المتوسط. ثم، وإزالة بعناية متوسطة من مدخل لشريحة مجهرية باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر.
  6. جلب شريحة مجهرية لمستوى العين واستخدام 1 مل حقنة ليور للانغلاق، يروي بلطف 200 ميكرولتر من تركيز استعداد للHUVECs في القناة. الحذر مطلوب في هذه الخطوة لمنع تشكيل فقاعة. إذا ظهرت فقاعات، والحفاظ على perfusing لفترة أطول قليلا حتى فقاعات دخول قناة منفذ.
  7. وضع حجم مساو (~ 80 ميكرولتر) من وسائل الإعلام HUVEC في كل من مدخل ومخرج للشريحة مجهرية. هذا يمنع تدفق الخلايا في أي من الاتجاهين.
  8. تغطية شريحة وابقائه في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 1.5 ساعة.

2. إعداد تدفق الجمعية غرفة ليلة وضحاها HUVEC الثقافة على شريحة مجهرية

  1. وضع حقنة معقمة 20 مل، وموصلات يور الإناث والذكور، وأنابيب، وضخ حقنة في الحاضنة لمدة 15 ميلن.
  2. الحد الأدنى من حجم القتلى، واستخدام أنابيب مع قطرها الداخلي 0.04 بوصة. أصغر قطرها أنابيب يمنع تشكيل فقاعة.
  3. ملء حقنة 20 مل مع دافئ (37 درجة مئوية) HUVEC وسائل الإعلام (12 مل). إرفاق أنابيب مع موصلات على حقنة. إزالة الفقاعات. ربط هذا التجمع إلى شريحة مجهرية.
  4. ملء تماما مدخل لشريحة مجهرية مع وسائل الإعلام HUVEC. جلب شغل حقنة 20 مل تعلق على موصل بجانب شريحة مجهرية. نعلق بلطف موصل إلى شريحة مجهرية.
  5. جلب مجموعة المتابعة في الحاضنة وتوصيله إلى ضخ حقنة، الغروب في 10 ميكرولتر / دقيقة معدل القص. ترك الخلايا O / N في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  6. اليوم التالي، تفكيك مجموعة المتابعة عن طريق إزالة موصل تعلق على مدخل لشريحة مجهرية.
  7. لupregulate-E selectin التعبير على ECS، وإعداد متوسطة النمو الطازجة التي تحتوي على IL-1β في 10 نانوغرام / مل 4 مل في وسائل الإعلام. نضح في وسائل الإعلام حقنة 10 مل. إزالة روقال انه وسائل الاعلام من مدخل لشريحة مجهرية وتوصيل حقنة إلى الشريحة.
  8. تعيين ضخ حقنة في 10 ميكرولتر / دقيقة معدل القص لمدة 4 ساعة في الحاضنة.

3. إعداد مكافحة PSMA (J591-488) إعتبر خلايا سرطان البروستاتا

  1. خلال IL-1β حضانة HUVECs، وإعداد مكافحة PSMA J591-alexa488 صفت الخلايا محكمة التحكيم الدائمة. إضافة 0.05٪ التربسين EDTA-MDA إلى الخلايا لمدة 1 دقيقة. لا تعرض الخلايا إلى التربسين لمرات أطول لأنها يمكن أن تؤثر على glycopeptides موجودة على سطح الخلية. ويمكن أيضا انزيم تفارق الخلية الحرة كاشف أن تستخدم بدلا من التربسين. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. في resuspend MDA بيليه خلية في 1 مل H / H العازلة (هانكس الملح متوازن solution/0.1٪ HSA/10 ملي HEPES / 1 مم CaCl 2). إضافة مضادة للPSMA-J591 alexa488 الأجسام المضادة في 20 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة في RT في مكان مظلم. resuspend الخلايا أثناء الحضانة.
  3. بعد 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي حل الخلية في 800 x ج لمدة 5 دقائق. ASPIمعدل و resuspend بيليه في 1 مل H / H العازلة. عد الخلايا MDA وصفت وجعل تركيز النهائي لالخلايا 1x10 6 / مل. ملء حقنة 5 مل مع J591-488 الخلايا MDA وصفت وإزالة الفقاعات.

4. إعداد مكافحة PSMA (J591-488) وصفت التدرجي المخصب من PCA المرضى

  1. جمع 7.5 ملليتر دم من مرضى سرطان البروستاتا في أنبوب الغطاء الأزرق (التي تحتوي على سترات الصوديوم). تمييع الدم برفق 01:01 في 0.1٪ BSA / 1 ملم EDTA / PBS.
  2. إضافة 5.3 مل Ficoll-paque زائد في أنبوب مخروطي 50 مل. طبقة مخففة الدم على رأس ficoll-paque. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة.
  3. ما قبل معطف جميع الأنابيب أو نصائح القادمة في اتصال مع التدرجي مع 2٪ FBS/RPMI-1640 / 1 مم CaCl 2/4 ملم MgCl 2 (R / S العازلة) لمنع غير محددة وملزمة من التدرجي إلى السطوح. 4 الحفاظ على درجة حرارة ° C وسائل الإعلام ومخازن القادمة في اتصال مع التدرجي.
  4. جمع المحيطية وحيدات النوى الدم الخلية (PBMCs) جزءتحتوي التدرجي من واجهة في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل أخرى R / S العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق.
  5. resuspend الكرية ويغسل مرة أخرى في R / S عازلة في 400 x ج لمدة 8 دقائق. بعد الطرد المركزي، resuspend وبيليه في H / H العازلة. إضافة مضادة للPSMA J591-488 الضد في 20 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة في RT في مكان مظلم.
  6. بعد 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي والتي تحتوي على PBMCs J591-488 التدرجي وصفت في 800 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في H / H العازلة. ملء حقنة 1 مل (المغلفة مسبقا مع R / S العازلة) مع العينة.

5. إعداد المجهر، مضخة المحاقن وتدفق الجمعية غرفة

  1. بدوره على مجهر مقلوب وتعيين الإضاءة كولر في 10X الهدف. جلب ضخ حقنة في نفس مستوى المرحلة عينة من المجهر وضعه في 1 داين / سم 2 إجهاد القص (~ 10 ميكرولتر / دقيقة).
  2. افتح البرنامج زايس Axiovision. تحديد الهدف على شاشة الكمبيوتر. إنشاء لجنة جديدةمجلد تحت خيار الأدوات في البرنامج.
  3. فتح الخيار التجارب الذكية في Axiovision وضبط الإعدادات لتسجيل مقاطع الفيديو القصيرة 30 ثانية لمدة 30 دقيقة.
  4. للفيديو الفلورسنت الحية، وتعيين الخيارات-12 صورة ميللي ثانية التعرض، 2 × 2 بن، 5 صعود. هذه المعايير يساعد في تحقيق أشرطة الفيديو على مقربة من معدل إطار الفيديو (~ 23 لقطة في الثانية) مع الكاميرا زايس MRM.
  5. لتصور العرض الكامل للقناة تدفق في 10 X الهدف على شاشة الكمبيوتر، واستخدام محول C-جبل (0.63 ملم واجهة xf/60).
  6. التبديل على مصباح الزئبق.
  7. وضع حقنة والموصل التي تحتوي على الخلايا على ضخ حقنة.
  8. جلب IL-1β حفز HUVECs من الحاضنة. إرفاق موصل إلى مدخل قناة شغل من شريحة مجهرية تحتوي على HUVECs.
  9. ربط قناة منفذ مع موصل تعلق على الأنابيب. وضع أنابيب في طبق أو 15 مل أنبوب مخروطي لجمع تدفق من خلال.
  10. بدء infusiعلى طريق شريحة مجهرية في 10 ميكرولتر / دقيقة. مراقبة التفاعلات بين الخلايا البطانية وخلايا MDA المسمى أو المسمى التدرجي المستمدة من المرضى تحت التصفية 488 نانومتر على المجهر epifluorescence.
  11. بدء تسجيل التجربة إلى 30 ثانية أشرطة الفيديو القصيرة. خلال تحليل التشغيل، وقياس سرعة المتداول. يتم قياس سرعة المتداول عن طريق قسمة المسافة التي تقطعها الخلايا مع مرور الوقت.

6. المناعية للشريحة مجهرية

  1. إزالة وسائل الإعلام من مدخل ومخرج للشريحة مجهرية بعد perfusing الخلايا MDA على IL-حفز 1β HUVECs لمدة 10 دقيقة.
  2. باستخدام تلميح 200 ميكرولتر، وطرح دافئ (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم في مدخل لشريحة مجهرية لمدة 5 دقائق. إمالة شريحة مجهرية باستخدام غطاء لها كدعامة على مقاعد البدلاء. الحفاظ على شريحة مجهرية في موقف يميل لجميع حضانات خلال المناعية.
  3. إصلاح HUVECs بواسطة perfusing الحارة 2٪ الفورمالديهايد في مدخل
  4. إضافة تريتون X-100 (0.1٪) في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. منع مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
  6. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية الماعز المضادة للVE كادهيرين (1:100) في 2.5٪ BSA O / N عند 4 درجة مئوية.
  7. اليوم التالي، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. إضافة حمار الثانوية المضادة للماعز 647 الضد لمدة 45 دقيقة. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. احتضان عند RT-J591 مع أنسنة alexa488 الضد مترافق لمدة 1 ساعة.
  9. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. إضافة دابي لمدة 5 دقائق. يغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  10. إضافة برنامج تلفزيوني (أو mowiol للتخزين طويل الأجل). تصور شريحة مجهرية تحت المجهر متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 ثقافة O / N من أحادي الطبقة من ECS على شريحة مجهرية. وقشور على الشكل 1A تبين أن 100٪ من شريحة مجهرية غير مرئية باستخدام الهدف 5X بينما 70٪ غير مرئية باستخدام الهدف 10X (الشكل 1B). لE-selectin بوساطة التفاعلات، لا تعتبر خلايا المتداول عند الحواف مما يجعل أكثر من 70٪ من شريحة مجهرية المتاحة لتسجيل الفيديو والتحليل التشغيل. في تجربتنا، في البداية هذه الجمعية انشاء يحتاج إلى بعض الممارسات للثقافة أحادي الطبقة من ECS تحت إجهاد القص. بعد تأسيس النمو EC على شريحة مجهرية، ونحن وصفت نجمة داود الحمراء، وخلايا سرطان البروستاتا. تم اختبار خصوصية J591-488 المضادة للPSMA الأجسام المضادة باستخدام الخلايا MDA ارتفعت في الدم متبرع سليم والمسمى مع fluorescently المسمى مكافحة PSMA J591-488 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. لم يلاحظ أي PSMA المناعية في PBMCs (لا تظهر البيانات). لاستبعاد احتمال أن J591-488 ملزمة واستيعاب العبوة البديلةالتمرير المتداول السلوك، ونحن وصفت الخلايا MDA مع J591-488 ومقارنة سلوك المتداول مع الخلايا MDA غير المسماة في اجهادات القص تتراوح بين 1-10 داين / سم 2. يظهر مربع مؤامرة توزيع السرعات المتداول من كل من الخلايا MDA غير المسماة وJ591-488 المسمى على IL-حفز 1β ECS في مختلف ظروف إجهاد القص. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في السرعات المتداول في 1 و 5 داين / سم 2، ص = 0.634 و p = 0.601، على التوالي (الشكل 2). في إجهاد القص أعلى من 10 داين / سم 2، لوحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين السرعات المتداول من غير المسماة والخلايا MDA-J591 488 المسمى (ع <0.05). تظهر دراسات سابقة أن في أعلى إجهاد القص (> 3 داين / سم 2) الظروف، والخلايا السرطانية أقل التمسك ولفة على ECS مقارنة مع انخفاض ظروف إجهاد القص 11،12. لذلك، يتم إجراء دراسات تحليل التفاعلات بين الخلايا السرطانية وECS عند أقل اجهادات القص. اللنا، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن التدرجي يمكن أن توصف مع J591-488 والتي وضع العلامات الفلورية من التدرجي لا تؤثر تأثيرا كبيرا على سلوك المتداول في مجموعة واسعة من إجهاد القص. من المذكرة، لم نكن الكشف عن أي تفاعلات CTC / EC في غياب التحفيز IL-1β من ECS (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، كدليل على المبدأ، ونحن أيضا وصفت التدرجي المخصب المعزولة من المرضى قانون الإجراءات الجنائية مع J591-488 و IL-perfused على حفز 1β ECS. شريط فيديو يظهر مخيط الوقت أنواع مختلفة من التفاعلات بين البروستاتا التدرجي وECS (فيديو 1). ويظهر شريط الفيديو ثلاثة أنواع من التفاعلات مستقرة التصاق (التدرجي لم يفصل حتى بعد 30 ثانية)، الربط (التدرجي نعلق وأعد)، وليس التفاعلات. Microslides يمكن immunostained بسهولة ويمكن التقاط صور الفلورسنت لأن microslides لها خصائص البصرية مماثلة ل1.5 ملم ساترة سميكة 7. الشكل 3 يبين التصاق شركة من J591-488 المسمى MDA الخلايا الخلفإيه التروية أكثر من IL-حفز 1β ECS.

الشكل 1
الشكل 1: A أحادي الطبقة من الخلايا البطانية مثقف على شريحة مجهرية كانت HUVECs يا مثقف / N على فبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل) شريحة مجهرية المغلفة الثالث (0.1) تحت إجهاد القص (1 داين / سم 2) A) في الهدف 5X. (خطة EC Neofluar 5X/0.16)، لوحظ كاملة عرض القناة تدفق مع مثقف ECS. تم قياس عرض القناة لتكون 1،545.95 ميكرون. B) في 10X الهدف (خطة Neofluar 10X/0.3 PH1)، لوحظ 1،065.79 ميكرون للقناة. هذا يشير إلى أن ECS يمكن تربيتها O / N على شريحة مجهرية و 70٪ من شريحة مجهرية غير مرئية في التكبير 10X. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. سرعة المتداول من الخلايا MDA على ECS مثقف على شريحة مجهرية. تم perfused احد مليون خلية MDA المسمى غير المسماة وJ591-488 أكثر من IL-حفز 1β HUVECs. وسجلت عشرة أشرطة الفيديو في مختلف المجالات على شريحة مجهرية في 1،5، و 10 داين / سم 2. وقدمت الحسابات إجهاد القص من قبل الشركة المصنعة. تم إجراء التحليل حاليا لسرعة المتداول. n = عدد الخلايا يحسب بالنسبة للقياسات السرعة المتداول. يظهر مربع مؤامرة توزيع السرعات المتداول والاختلاف بين متوسط ​​J591-488 الخلايا MDA وصفت وغير المسماة. ع <0.05، يلكوكسون اختبار مجموع رتبة. تمثل الدوائر والقيم المتطرفة. يرجى النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. المناعية للخلايا MDA التفاعل مع ECS على شريحة مجهرية. تم perfused احد مليون خلية MDA أكثر من IL-حفز 1β HUVECs في 1 داين / سم 2 القص الإجهاد. بعد التروية، تم تنفيذ المناعية على شريحة مجهرية. تظهر رؤوس سهام الصفراء الخلايا MDA الالتزام بحزم ECS. PSMA = الأحمر، VE كادهيرين = الأخضر، الأزرق = دابي. يظهر الصورة المدمجة كل الألوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1. شريط فيديو يظهر التفاعلات بين HUVECs حفز IL-1β ومكافحة PSMA التدرجي J591-488 المسمى التخصيب من مريض سرطان البروستاتا. أحادي الطبقة سكان و HUVECs مثقف على شريحة مجهرية الثالث (0.1) والمضادة للخلايا وحيدات النوى PSMA الدم المحيطي J591-488 المسمى (PBMCs) التي تحتوي على التدرجي المخصب من مريض كان perfused على HUVECs في 1 داين / سم 2. خلال التروية، وسجلت 30 أشرطة الفيديو القصيرة ثانية، في مختلف المجالات على شريحة مجهرية. يظهر اكتساب الوقت من شريط الفيديو على أسفل الزاوية اليسرى. وقد مخيط أشرطة الفيديو القصيرة مختلفة معا لتجميع هذا الفيديو. في 2:16:36، ورابع كلوريد الكربون غير التفاعل يدخل مجال اليسرى العليا من الرأي؛ في 2:19:16، وآخر غير التفاعل-CTC يدخل مجال الزاوية اليسرى من الرأي؛ في 2:23:12، ينظر إلى لجنة مكافحة الإرهاب تلتزم بثبات في مجال المتوسطة أعلى من العرض. في 2:38:09، ينظر إلى لجنة مكافحة الإرهاب الالتزام ثابت على الجانب الأيمن من مجال الرؤية وينظر. وقد اتخذ هذا الفيديو باستخدام كل مشرق الميدان وقناة الفلورسنت لإظهار تفاعلات PBMCs كذلك. في 2:40:18، لوحظت التدرجي الالتزام ثابت في مجال المتوسطة أعلى من العرض. وقد اتخذ هذا الفيديو باستخدام مشرق الميدانوقناة الفلورسنت لإظهار السلوك المتداول في PBMCs. من خلال 2:51:39 2:51:49، لوحظ وجود لجنة مكافحة الإرهاب واظهار السلوك في مجال الربط السفلي من طريقة العرض. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد خلايا الدم بين التدرجي، فمن الصعب عزل التدرجي كما يبلغ عدد سكانها نقية من الخلايا. من أجل دراسة التفاعلات CTC / EC، السكان النادرة ونجس من التدرجي يطرح تحديين رئيسيين: أ) تحديد التدرجي بين خلايا الدم؛ ب) مراقبة التفاعلات CTC / EC.

للتغلب على القيد الأول لتحديد التدرجي البروستاتا بين خلايا الدم، اتخذنا الاستفادة من حقيقة أن جميع الخلايا السرطانية في البروستاتا التعبير عن PSMA 6. والمنضوية الأضداد وحيدة النسيلة J591-488 التالي سطح الخلية ملزم مما يوحي بأن PCA التدرجي يمكن أن توصف فيفو السابقين ودرست لجنة مكافحة الإرهاب التفاعلات / EC 13. لاستيعاب الأمثل للأجسام المضادة والمناعي القصوى، ونحن حضنت الخلايا MDA مع الأجسام المضادة إما في 4 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو إما 1 ساعة. لاحظنا أن الحد الأقصى المناعي لوحظ فيلم 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (لا تظهر البيانات) ووضع العلامات مناعي للخلايا البروستاتا لا يؤثر على سلوك المتداول مقارنة مع خلايا البروستاتا غير المسماة.

للتغلب على القيد الثاني، ونحن اختبار مختلف التجمعات غرفة تدفق مثل PPFC، microfluidics نظام Bioflux، وMicroslides 7. أصبح PPFC الدعامة الأساسية لدراسة الكريات البيض والخلايا السرطانية التفاعل مع ECS ظل ظروف تدفق الفسيولوجية 9. هذا النظام يعمل بشكل جيد التدفق لدراسة التفاعلات بين عدد كبير من الخلايا مثل خطوط الخلايا السرطانية، ولكن ليست مثالية لمراقبة ودراسة التفاعلات بين الخلايا نادرة مثل التدرجي المشتقة من المريض وECS. التدرجي، ويجري خلايا نادرة، يمكن أن تتفاعل مع ECS بشكل عشوائي في أي مكان في قناة التدفق، وبالتالي، لا بد من تسجيل العرض الكامل للقناة تدفق لمراقبة وتحليل التفاعلات حدث نادر بين التدرجي / ECS خلال تحليل التشغيل. العرض (ه) من طوقا silastic المستخدمة في PPFC (2.5 ملم) لا يوفر حقل كامل من الرأي تحت 10X الهدف. بينما، في التكبير أقل من الهدف 10X، يصبح من الصعب أن نلاحظ بوضوح التفاعلات CTC / EC. بالإضافة إلى ذلك، حجم القتلى المنخفض في أنابيب يربط أمر ضروري لتجنب محاصرة من التدرجي في أنابيب التوصيل. أنابيب يربط silastic المتوفرة مع PPFC القياسية ويبلغ قطرها الداخلي اسعة (0.16 بوصة). على العكس من ذلك، يوفر النظام على microfluidics Bioflux حقل كامل من الرأي تحت الهدف 20X ومفيد في دراسة التغيرات التي يسببها القص في ECS 14، ومع ذلك، تبدأ الخلايا السرطانية يستقر في الآبار مما يؤدي إلى غرفة التدفق غير موحدة. على microfluidics Bioflux مفيد في دراسة التغيرات التي يسببها القص في ECS، ومع ذلك، فمن مرهقة تقنيا للاستخدام. لدينا غرفة التدفق الذاتي تجميعها باستخدام شريحة مجهرية لديها عرض القناة الضيقة (1 مم) من عرض قناة القياسية في PPFC، مما يسمح للمزيد من الأرصادمنطقة tional. أيضا، يتم تربيتها ECS تحت نضح في شريحة مجهرية محاكاة الفسيولوجية تدفق الدم، على عكس جانجولي وآخرون. 7، والدراسات التي تزرع فيها ECS على microslides (مع أوسع عرض القناة) في ظروف ثابتة. وانخفض حجم القتلى داخل أنابيب يربط باستخدام أنبوب يربط مع قطرها الداخلي 0.02 بوصة بشكل جماعي، ووضع العلامات مناعي للخلايا السرطانية في البروستاتا، مناسبة عرض القناة تدفق، وقطرها أصغر الداخلي للأنابيب يربط يسمح احد لتحديد التدرجي البروستاتا و مراقبة تفاعلها مع ECS.

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في البروتوكول، ولكن مع الرعاية المناسبة يمكن أن التجارب بسلاسة. منع الفقاعات أمر بالغ الأهمية لأي التجارب القائمة على التدفق. في تجربتنا، وذلك باستخدام دافئ (37 درجة مئوية) متوسطة النمو، والموصلات، وحقنة يمنع تشكيل فقاعات عن طريق الحد من الاختلافات في درجة الحرارة. في additioن، ينبغي توخي الحذر أثناء الاتصال المحقنة مع شريحة مجهرية. كلا ينبغي أن تملأ الموصل تعلق على حقنة ومدخل لشريحة مجهرية حتى أسنانها، وبالتالي، منع أي تشكيل فقاعة. واحدة من القيود المفروضة على تقنية هو أنه منذ القناة شريحة مجهرية هو 45 × 1 ملم (الطول × العرض)، فإنه يمكن أن تعقد سوى 4.5 ميكرولتر من النمو المتوسط. لذلك، شريحة مجهرية لا يمكن استخدامها لثقافة ساكنة ويتطلب نضح المستمر للنمو متوسطة لمنع تحمض والحفاظ على إمدادات مناسبة من المغذيات اللازمة للHUVECs. ومع ذلك، امدادات مستمرة من المتوسط ​​يمكن أن يتحقق بسهولة باستخدام ضخ حقنة متصلة شريحة مجهرية في الحاضنة. في حين إثراء التدرجي من مرضى سرطان البروستاتا، ينبغي الحرص إلى ما قبل معطف جميع الأنابيب، نصائح، الماصات، والمحاقن القادمة في اتصال مع التدرجي مع R / S عازلة لمنع غير محددة وملزمة. بالإضافة إلى ذلك، جميع الخطوات بعد ficoll-paque الطرد المركزي كثافة، والبريدxcept J591-488 الضد الحضانة، يجب أن تجرى في 4 درجات مئوية لمنع تدهور التدرجي.

أسلوبنا هي فريدة من نوعها بالمقارنة مع أساليب مختلفة فهم CTC علم الأحياء. ويصف هذا التقرير immunolabeling الفلورسنت قابلة للحياة التدرجي البروستاتا الذي يسمح احد لمراقبة الخصائص الوظيفية التدرجي البروستاتا، بالإضافة إلى مجرد خصائص المظهرية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الأسلوب هو موضح انخفاض حجم عينة / كاشف من الأساليب الأخرى مما يجعله نظام مثالي للدراسات المناعي. يوفر منهجية لدينا منصة فريدة من نوعها لدراسة التفاعلات بين التدرجي البروستاتا المستمدة من المرضى وECS، وبالتالي، مما يساعد على فهم الآليات التي تشارك في تطوير الانبثاث سرطان البروستاتا. هذه التقنية لديها القدرة لتطبيقات متعددة تشمل الدراسات القائمة على تدفق القص، مثل التفاعلات خلية خلية 8، التفاعلات الخلية البروتين 15 16، والتغيرات الناجمة عن القص في ECS 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور بندر هو مخترع على براءات الاختراع التي تم تعيينها لمؤسسة أبحاث كورنيل ("CRF") للأجسام المضادة J591 المستخدمة في هذه المقالة. الدكتور بندر هو مستشار لوتملك الأسهم في BZL الحيوية، وهي الشركة التي تم ترخيص براءات الاختراع التي كتبها CRF لمزيد من البحث والتطوير.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من وزارة الدفاع-البروستاتا برنامج أبحاث السرطان (W81XWH-12-1-0124)، U54CA143876 من المعهد الوطني للسرطان، وصندوق روبرت McCooey التناسلي الأورام البحوث. نود أن نشكر الدكتور Annarita لورنزو (قسم علم الأمراض) لتوفير الأجسام المضادة VE كادهيرين، والدكتور ماركو Seandel (قسم الجراحة) لتوفير HUVECs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microslide Ibidi 80331
Fibronectin Millipore FC010
Plastic tubing Cole Parmer EW-96115-08
Male Luer adapter GlycoTech 31-001
Female Luer adapter GlycoTech 31-001
Syringe pump Chemyx Inc Fusion 100
Luer-lock syringe BD Biosciences 309628
M199 medium Sigma M7653
Endothelial Mitogen Biomedical Technologies BT-203
HBSS Sigma H9269
Anti-PSMA J591-488 Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta Peprotech 200-01B
Trypsin Millipore SM-2002-C
Heparin Sigma H-3149
HUVECs Weill Cornell Medical College-Department of Surgery provided by Marco Seandel
VE-Cadherin Santa Cruz sc-5648
10x objective Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent Millipore S-004-C
RPMI-1640 Lonza 12-702-F
Ficoll-paque plus GE healthcare 17-1440-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
  2. Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
  3. Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
  4. Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  5. Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
  6. Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
  7. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
  8. Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
  9. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
  10. Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
  11. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  12. Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
  13. Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
  14. Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
  15. Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
  16. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).

Tags

الطب، العدد 87، E-selectin، الانبثاث، Microslides، تداول الخلايا السرطانية، PSMA، وسرطان البروستاتا، والسرعة المتداول، والمناعية، HUVECs، وتدفق غرف
<em>في</em> الطريقة <em>المختبر</em> لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gakhar, G., Bander, N. H., Nanus, D. … More

Gakhar, G., Bander, N. H., Nanus, D. M. In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (87), e51468, doi:10.3791/51468 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter