Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

Summary

Notre rapport décrit une méthode unique pour visualiser et analyser les interactions CTC / CE dans le cancer de la prostate dans des conditions d'écoulement physiologiques.

Abstract

La métastase est un processus dans lequel les cellules tumorales perdent de la tumeur primaire intravasate vasculaire sanguin et du système lymphatique, de ce fait, l'accès à s'extravaser et former un créneau secondaire. L'extravasation de cellules tumorales à partir du système vasculaire sanguin peut être étudiée en utilisant des cellules endotheliales (EC) et des cellules tumorales obtenues à partir de différentes lignées cellulaires. Les premières études ont été menées dans des conditions statiques, mais il a été bien documenté que les CE se comporter différemment dans des conditions d'écoulement physiologiques. Par conséquent, les différents ensembles de chambre de débit sont actuellement utilisés pour l'étude des interactions de cellules cancéreuses avec les EC. Ensembles de chambre de flux actuels offrent des résultats reproductibles en utilisant soit des lignées cellulaires différentes ou de fluide à différentes conditions de stress de cisaillement. Toutefois, à observer et à étudier les interactions avec les cellules rares telles que des cellules tumorales circulantes (CTC), certaines modifications doivent être apportées à l'ensemble de la chambre de flux classique. CTCsont une population de cellules rares parmi des millions de cellules sanguines. Par conséquent, il est difficile d'obtenir une population pure de CTC. Contamination des CTC avec différents types de cellules qui se trouvent normalement dans la circulation est inévitable en utilisant enrichissement présents ou techniques d'épuisement. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode unique de cellules de cancer de la prostate par fluorescence de l'étiquette de circulation et d'étudier leurs interactions avec les CE dans un système de chambre de circulation auto-assemblée. Cette technique peut être en outre appliqué à observer les interactions entre les CTC de la prostate et de toute protéine d'intérêt.

Introduction

Métastase est un processus complexe en plusieurs étapes qui reste mal compris. L'axe de ligand E-selectin/selectin a été montré pour jouer un rôle important dans la métastase de la tumeur en favorisant les interactions adhésives primaires entre l'endothélium vasculaire et les cellules cancéreuses ^1,2. Endothéliale (E)-sélectine est une protéine transmembranaire exprimée par les cellules endothéliales activées, tandis que les différents ligand (s) E-sélectine est exprimée par les cellules tumorales ^3. De nombreuses approches in vitro ont été utilisés avec succès pour modéliser les interactions de ligands E-selectin/selectin entre les cellules tumorales et les cellules endotheliales (EC) ^1. Pour étudier ces interactions, les différents systèmes de chambres d'écoulement sont utilisées pour simuler le système vasculaire sanguin. Parmi les ensembles de la chambre d'écoulement, la chambre d'écoulement à plaques parallèles (FPNC), en liaison avec les EC est couramment utilisé comme modèle in vitro simulant vivo dans des conditions de contrainte de cisaillement. Dans ceProcédé, les EC sont cultivées sur une boîte de 35 mm, et après la réalisation d'une monocouche, les EC sont fixés à la FPNC et expériences basées contrainte de cisaillement sont effectuées.

Cependant, PPFC et autres systèmes actuels présentent de nombreuses limites à l'étude des interactions adhésives entre les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients et EC, principalement parce que les CTC sont une population rare de cellules, remise de la tumeur primaire, circulant parmi des millions de cellules sanguines (1 CTC par 10 ⁹ cellules sanguines) ^4. Ainsi, contrairement à l'offre illimitée de lignées cellulaires en culture, un faible nombre de CTC conduisent à très peu et rares interactions CTC / CE, nécessitant la bonne largeur de canal d'écoulement d'enregistrer les interactions pour l'analyse de la lecture. En outre, depuis patients CTC dérivés sont une population impur, donc un marqueur d'identification est nécessaire pour suivre les CTC en particulier. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle méthode pour identifier le cancer de la prostate (CaP) CTCs en profitant du fait que la quasi-totalité de ces CTC expriment l'antigène de membrane spécifique de la prostate (PSMA) sur leur surface cellulaire ^5,6. Dans ce rapport, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer de la prostate, MDA PCa2b (MDA), afin de démontrer l'utilité potentielle de notre nouveau système à étudier la prostate interactions CCT avec les CE, finalement à comprendre le mécanisme de métastases.

Notre méthodologie peut être appliquée à diverses expériences de cisaillement en fonction de simulation dans le système vasculaire in vivo ^7-9. Outre l'examen des interactions PCa CTC / CE, le système de chambre de passage du courant pourrait être facilement adapté pour l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique ou des interactions des cellules tumorales avec les EC. La facilité de démontage et remontage de la chambre d'écoulement, une microplaque III ^(0,1) (ci-après dénommé microlame), permet la culture EC sous perfusion et stimulant EC avec différentes cytokines pour induire protein expression. En outre, les EC cultivées, des protéines recombinantes telles que E-et P-sélectine peuvent être revêtus sur la microplaque et les interactions avec les cellules tumorales peut être observé dans des conditions d'écoulement laminaire ^10.

Protocol

1. HUVEC en culture sur microplaques pour Interactions observation CTC-endothéliales

1. Sous le capot de la culture de tissus, d'abord rincer la microplaque, largeur de canal de 1 mm avec du PBS. Manteau doucement la microplaque avec 200 pi de 50 pg / ml de fibronectine (dissous dans du PBS) en utilisant une seringue de 1 ml de type Luer-lock.
2. Couvrir la microplaque avec le couvercle et garder à l'intérieur de la culture de tissus capot pendant 30 min. Distribution lente du liquide dans la microplaque empêche la formation de bulles dans le canal.
3. Perfuser 200 ul de (37 ° C) Agent chaud HUVEC de croissance (milieu M199, 1 M de HEPES, 20% de FBS, 5 mg / ml d'héparine, 100 ug / ml de facteur de croissance des cellules endothéliales, et la L-glutamine) au-dessus de la microplaque et incuber pendant 20 min à température ambiante. Au cours de la perfusion, de préparer la suspension de cellules HUVEC.
4. Rincer HUVEC avec du PBS et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA pendant 1-2 min à température ambiante. Centrifugeuse HUVEC dans 2 ml de milieu de croissance à 180 xg pendant 5 min.
5. Mesurer la concentration des cellules en utilisant un Neubauer hémocytomètre et préparer 10 ⁷ cellules HUVEC cellules/100 ul de milieu de croissance. Puis, enlevez délicatement le milieu de l'entrée de la microplaque à l'aide d'une pipette 200 pl.
6. Apportez la microplaque au niveau des yeux et en utilisant un 1 ml luer-lock seringue, perfuser doucement 200 pi de concentration prêt de HUVEC dans le canal. La prudence est requise à cette étape pour éviter la formation de bulles. Si des bulles apparaissent, garder la perfusion pendant une durée légèrement plus longue jusqu'à ce que les bulles pénètrent dans le canal de sortie.
7. Mettre un volume égal (~ 80 pi) de support HUVEC dans l'entrée et à la sortie de la microplaque. Cela empêche le flux de cellules dans les deux sens.
8. Recouvrir la lame et le maintenir dans l'incubateur (37 ° C) pendant 1,5 heure.

2. Préparation des flux Assemblée Chambre pour une nuit HUVEC Culture sur un Microslide

1. Placez une seringue stérile de 20 ml, connecteurs Luer mâles et femelles, des tubes, et une pompe à seringue dans l'incubateur pendant 15 kmn.
2. Pour le volume mort minimal, utiliser le tuyau d'un diamètre intérieur de 0,04 pouces. Plus petit diamètre du tube empêche la formation de bulles.
3. Remplir la seringue de 20 ml au chaud (37 ° C) des cellules HUVEC médias (12 ml). Fixez le tube avec les connecteurs sur la seringue. Retirer les bulles. Connectez cette assemblée à la microplaque.
4. Remplir complètement l'entrée de la microplaque avec les médias HUVEC. Amener le rempli de 20 ml seringue fixée au connecteur côté de la microplaque. Attacher doucement le connecteur de la microplaque.
5. Apportez la mise en place dans l'incubateur et le connecter à la pompe seringue, fixé à 10 taux de cisaillement pi / min. Laisser les cellules O / N dans l'incubateur à 37 ° C.
6. Le jour suivant, démonter la mise en place en retirant le connecteur fixé à l'entrée de la microplaque.
7. Pour réguler positivement l'expression E-sélectine sur les CE, préparer le milieu de croissance frais contenant de l'IL-1β à 10 ng / ml dans 4 ml de milieu. Aspirer les médias dans une seringue de 10 ml. Retirer til médias de l'entrée de la microplaque et connecter la seringue à la diapositive.
8. Réglez la pompe seringue à 10 pi / min vitesse de cisaillement pendant 4 heures dans l'incubateur.

3. Préparation de l'anti-PSMA (J591-488) a marqué des cellules de cancer de la prostate

1. Au cours de l'IL-1β incubation de HUVEC, préparer anti-PSMA J591-Alexa488 a marqué des cellules APC. Ajouter 0,05% de trypsine-EDTA à des cellules MDA pendant 1 min. Ne pas exposer les cellules à la trypsine pour des temps plus longs car il peut affecter les glycopeptides présents à la surface cellulaire. Enzyme réactif de dissociation cellulaire libre peut également être utilisé à la place de la trypsine. Centrifuger à 200 g pendant 5 min.
2. Remettre en suspension cellulaire MDA culot dans 1 ml de H / H tampon (% du sel de Hanks équilibrée HSA/10 mM HEPES / 1 mM de _CaCl2). Ajouter anticorps J591-Alexa488 anti-PSMA à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre. Remettre en suspension les cellules pendant l'incubation.
3. Après 30 minutes, centrifuger la solution de cellules à 800 xg pendant 5 min. Aspitaux et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon H / H. Compter les cellules MDA étiquetés et porter la concentration finale de 1x10 ⁶ cellules / ml. Remplir une seringue de 5 ml avec J591-488 cellules MDA étiquetés et éliminer les bulles.

4. Préparation des anti-PSMA (J591-488) Étiqueté CTC enrichi de CaP patients

1. Recueillir 7,5 ml de sang de patients atteints de cancer de la prostate dans un tube à bouchon bleu (contenant du citrate de sodium). Diluer doucement 1h01 de sang dans 0,1% de BSA / EDTA 1 mM / PBS.
2. Ajouter 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus dans un tube conique de 50 ml. Couche diluée sang sur le dessus du Ficoll-Paque. Centrifuger à 400 g pendant 30 min.
3. Pré-manteau tous les tubes ou embouts venant en contact avec les CTC avec 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM de CaCl _2/4 mM de MgCl ₂ (R / S tampon) pour empêcher une liaison non spécifique des CTC aux surfaces. Maintenir 4 ° C la température des médias et des tampons à venir en contact avec les CTC.
4. Recueillir la cellule périphérique mononucléées du sang (PBMC) de fractionCTC contenant de l'interface dans un autre tube conique de 50 ml contenant 30 ml de tampon R / S. Centrifuger à 400 g pendant 8 min.
5. Reprendre le culot et laver de nouveau dans un tampon R / S à 400 g pendant 8 min. Après centrifugation, remettre le culot dans un tampon H / H. Ajouter anti-PSMA J591-488 anticorps à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre.
6. Après 30 minutes, centrifuger les PBMC contenant J591-488 CTC marqués à 800 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans un tampon H / H. Remplir une seringue de 1 ml (pré-revêtu avec du tampon R / S) avec l'échantillon.

5. Préparation du microscope, seringue et flux Assemblée Chambre

1. Allumez le microscope inversé et mettre l'éclairage Kohler à 10X objectif. Apportez la pompe de la seringue au même niveau que la scène du microscope de l'échantillon et le fixer à 1 dyn / cm ² cisaillement (~ 10 pi / min).
2. Ouvrez le logiciel Zeiss Axiovision. Sélectionnez l'objectif sur l'écran de l'ordinateur. Créer un nouveaudossier sous l'option des outils dans le logiciel.
3. Ouvrez l'option expériences intelligentes en Axiovision et ajuster les paramètres pour enregistrer de courtes vidéos de 30 sec pour 30 min.
4. Pour la vidéo en direct fluorescent, définissez les options-12 images ms exposition, 2 x 2 bin 5 Gain. Ces paramètres permettent à la réalisation de vidéos à proximité de la fréquence d'images vidéo (~ 23 images par seconde) avec l'appareil photo Zeiss MRM.
5. Pour visualiser toute la largeur du canal d'écoulement à 10 X objectif sur l'écran de l'ordinateur, utilisez un adaptateur de monture C (0,63 Interface xf/60 mm).
6. Allumez la lampe à mercure.
7. Placer la seringue et le connecteur contenant les cellules sur la pompe à seringue.
8. Apportez IL-1β stimulée HUVECs de l'incubateur. Branchez le connecteur sur le canal d'entrée rempli de la microplaque contenant HUVEC.
9. Connecter le canal de sortie avec le connecteur fixé à la tubulure. Mettre le tube dans une boîte de 15 ml ou tube conique pour recueillir le débit à travers.
10. Démarrez le infusià travers la microplaque à 10 pi / min. Observer les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules MDA marqués ou étiquetés CTC provenant de patients sous filtre 488 nm sur le microscope à épifluorescence.
11. Commencer à enregistrer l'expérience que de courtes vidéos de 30 sec. Lors de l'analyse de lecture, mesurer la vitesse de roulement. La vitesse de laminage est mesurée en divisant la distance parcourue par les cellules au cours du temps.

6. Immunocoloration du Microslide

1. Retirez le support de l'entrée et la sortie de la microplaque après perfusion, les cellules MDA sur IL-1β stimulée HUVEC pendant 10 min.
2. En utilisant une pointe de 200 ul, mettre au chaud (37 ° C) du PBS contenant du calcium et du magnésium dans l'entrée de la microplaque pendant 5 min. Inclinez la microplaque à l'aide de son couvercle comme un accessoire sur le banc. Gardez la microplaque dans une position inclinée pour tous les incubations pendant immunologique.
3. Fixer HUVEC par perfusion chaud 2% de formaldéhyde dans l'entrée
4. Ajouter triton X-100 (0,1%) dans 5% de BSA dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
5. Rincer deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Bloquer avec 5% de BSA dans du PBS pendant 30 min.
6. Incuber avec la chèvre d'anticorps primaire anti-VE-cadhérine (1:100) dans 2,5% de BSA O / N à 4 ° C.
7. Le lendemain, laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter âne secondaire anti-chèvre 647 anticorps pendant 45 min. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
8. Incuber à température ambiante avec l'anticorps humanisé conjugué J591-Alexa488 pendant 1 heure.
9. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter DAPI pendant 5 min. Laver avec de l'eau distillée pendant 5 minutes.
10. Ajouter PBS (ou MOWIOL pour le stockage à long terme). Visualisez la microplaque sous le microscope confocal.

Representative Results

La figure 1 montre une culture O / N d'une monocouche de EC sur la microplaque. Les battitures sur la figure 1A montre que 100% de la microplaque est visible à l'aide objectif 5X tandis que 70% est visible à l'aide d'un objectif 10X (figure 1B). Pour les interactions à médiation par la E-sélectine, les cellules de roulement sur les bords ne sont pas considérés ce qui rend plus de 70% de la microplaque disponible pour l'enregistrement vidéo et analyse de la lecture. Dans notre expérience, d'abord cet ensemble de set-up a besoin de la pratique à la culture d'une monocouche de EC sous la contrainte de cisaillement. Après avoir établi la croissance de la CE sur la microplaque, nous avons appelé MDA, les cellules cancéreuses de la prostate. La spécificité des anticorps J591-488 anti-PSMA a été testée en utilisant des cellules MDA enrichis dans le sang du donneur en bonne santé et marquées avec un anticorps marqué par fluorescence monoclonal anti-PSMA J591-488. Aucun immunomarquage PSMA a été observée dans les PBMC (données non présentées). Pour écarter la possibilité que la liaison J591-488 et de l'internalisation alters roulant comportement, nous avons appelé les cellules MDA avec J591-488 et comparé le comportement de roulement avec des cellules MDA non marquées à des contraintes de cisaillement allant de 1-10 dyn / cm ^2. La boîte à moustaches montre la distribution des vitesses de roulement des deux cellules MDA non marquées et J591-488-marqués sur l'IL-1β stimulée par les CE à différentes conditions de stress de cisaillement. Aucune différence significative n'a été observée dans les vitesses de laminage à 1 et 5 dyn / cm ^2, p = 0,634 et p = 0,601, respectivement (Figure 2). Au niveau de stress de cisaillement de 10 dyn / cm ^2, une différence statistiquement significative n'a été observée entre les vitesses de roulement de non marquée et les cellules MDA J591-488-marquées (p <0,05). Les études précédentes montrent que, à une contrainte de cisaillement plus élevée (> 3 dyn / cm ²⁾ sur les conditions, les cellules tumorales et adhèrent moins sur les EC rouleau inférieur par rapport à des conditions de stress de cisaillement ^11,12. Par conséquent, les études analysant les interactions entre les cellules tumorales et les EC sont effectués à des contraintes de cisaillement plus faibles. Thnous, nos données suggèrent que les CTC peuvent être étiquetés avec J591-488 et que le marquage fluorescent des CTC n'affecte pas significativement le comportement de roulement à un large éventail de la contrainte de cisaillement. Fait à noter, nous n'avons détecté aucun interactions CTC / CE en l'absence de stimulation de l'IL-1β de EC (données non présentées). En outre, comme une preuve de principe, nous pourrions aussi appeler CTC enrichies isolées chez des patients avec CRPC J591-488 et perfusés sur IL-1β stimulée par les CE. Une vidéo en temps-cousu montre les différents types d'interactions entre la prostate CTC et EC (vidéo 1). La vidéo montre trois types d'interactions-stables adhérence (CTC ne se détachent, même après 30 sec), modem (CTC attachent et rattacher), et aucune interaction. Microplaques peuvent être facilement immunocolorées et images fluorescentes peuvent être pris parce que les microplaques ont des caractéristiques optiques similaires à celles de 1,5 mm d'épaisseur lamelle ^7. Figure 3 montre l'adhésion ferme de J591-488 marqués MDA cellules arrièreer perfusion sur l'IL-1β stimulée par les CE.

Figure 1:. Une monocouche de cellules endothéliales cultivées sur la microplaque des cellules HUVEC ont été O cultivées / N sur une fibronectine (50 pg / ml) de la microplaque revêtue III ^(0,1) sous une contrainte de cisaillement (1 dyn / cm ²⁾ A) A objectif 5X. (Plan CE Neofluar 5X/0.16), la largeur totale du canal d'écoulement avec culture EC a été observée. La largeur du canal a été mesurée à 1,545.95 um. B) À 10X objectif (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 um du canal a été observée. Ceci suggère que les CE peuvent être cultivées O / N sur la microplaque et 70% de la microplaque est visible à un grossissement de 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 2. Vitesse de roulement des cellules MDA sur EC cultivé sur la microplaque. Un million de cellules MDA marqués non étiquetés et J591-488 ont été perfusés sur IL-1β stimulée HUVEC. Dix vidéos à différents champs de la microplaque ont été enregistrés à 1,5, et 10 dyn / cm ^2. Calcul de la contrainte de cisaillement ont été fournies par le fabricant. Analyse hors ligne pour la vitesse de roulement a été effectué. n = nombre de cellules comptées pour les mesures de la vitesse de laminage. Box graphique montre la distribution des vitesses de roulement et les différences médianes entre J591-488 cellules MDA étiquetés et non étiquetés. p <0,05, test de Wilcoxon somme de rang. Les cercles représentent les valeurs aberrantes. S'il vous plaît cliquer ici pour view une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Immunocoloration de cellules MDA interaction avec les CE sur la microplaque. Un million de cellules MDA ont été perfusé sur IL-1β stimulée HUVECs à 1 dyn / cm ² contrainte de cisaillement. Après la perfusion, une immunocoloration a été réalisée sur la microplaque. Les flèches jaunes indiquent les cellules MDA fermement adhéré à la EC. PSMA = Rouge, VE-cadhérine = Vert, Bleu = DAPI. L'image fusionnée montre toutes les couleurs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1. Une vidéo montrant les interactions entre l'IL-1β HUVEC stimulées et anti-PSMA CTC J591-488-étiquetés enrichis d'un patient atteint de cancer de la prostate. Une monocouche of HUVEC a été cultivé sur la microplaque III ^(0,1) et les cellules anti-PSMA J591-488-étiquetés périphériques mononucléaires du sang périphérique (PBMC) contenant CTC enrichi d'un patient a été perfusé sur HUVEC à 1 dyn / cm ^2. Au cours de la perfusion, courts 30 vidéos sec ont été enregistrées, à différents champs de la microplaque. Le temps d'acquisition de la vidéo est affichée dans le coin en bas à gauche. Courtes vidéos différentes ont été cousues ensemble pour compiler cette vidéo. A 02:16:36, un CTC non-interaction entre dans le champ en haut à gauche de vue; à 02:19:16, un autre CTC non-interaction entre dans le champ de coin gauche de vue; à 02:23:12, une CCT stable adhéré dans le champ du milieu haut de la vue est perçu. A 02:38:09, un CTC stable adhéré est visible sur le côté droit du champ de vue est vu. Cette vidéo a été prise à l'aide à la fois à champ lumineux et canal de fluorescence pour montrer les interactions de CMSP ainsi. A 02:40:18, CTC stable adhéré ont été observées dans le champ du milieu haut de la vue. Cette vidéo a été prise à l'aide à champ lumineuxet canal de fluorescence pour montrer le comportement de roulement dans les CMSP. De 02:51:39 02:51:49 travers, une présentant un comportement d'attache de la CCT a été observée dans la zone inférieure de vue. Cliquez ici pour voir la vidéo.

Discussion

En raison du faible nombre de CTC parmi les cellules sanguines, il est difficile d'isoler les CTC comme une population pure de cellules. Afin d'étudier les interactions CTC / CE, la population rare et impure de CTC pose deux défis majeurs: a) Identification des CTC entre les cellules du sang; b) Observation des interactions CTC / CE.

Pour remédier à la première limitation d'identifier les CTC de la prostate chez les cellules du sang, nous avons profité du fait que pratiquement toutes les cellules tumorales de la prostate expriment PSMA ^6. Anticorps monoclonal J591-488 est internalisé suivant la surface cellulaire de liaison suggérant que CaP CTC peut être étiqueté ex vivo et des études d'interactions CTC / CE ^13. Pour l'internalisation de l'anticorps optimale et maximale immunofluorescence, nous avons incubé des cellules MDA avec l'anticorps à 4 ° C ou 37 ° C pendant 30 min ou soit 1 heure. Nous avons observé que immunofluorescence maximale a été observée à37 ° C pendant 30 minutes (données non montrées) et l'étiquetage d'immunofluorescence de cellules de la prostate n'a pas modifié le comportement au roulement par rapport à des cellules prostatiques non marqués.

Pour surmonter la seconde limitation, nous avons testé différents ensembles de musique de chambre de flux tels que PPFC, Bioflux système microfluidique, et microplaques ^7. Le PPFC est devenu un pilier à examiner les interactions des leucocytes et cellules tumorales avec les CE dans des conditions d'écoulement physiologiques ^9. Ce système de flux fonctionne bien pour étudier les interactions de grand nombre de cellules telles que des lignées de cellules de cancer, mais pas idéal pour observer et étudier les interactions entre les cellules rares tels que les CTC de dérivées de patients et ECS. CTC, étant des cellules rares, peut interagir avec les CE au hasard à n'importe quel endroit dans le canal d'écoulement, par conséquent, l'enregistrement de la totalité de la largeur du canal d'écoulement est tenu d'observer et d'analyser les interactions d'événements rares entre les CTC / EC lors de l'analyse de la lecture. Thlargeur e du joint silastique utilisée dans le PPFC (2,5 mm) ne fournit pas un champ de vision complet sous l'objectif 10x. Alors que, à un grossissement inférieur à l'objectif 10X, il devient difficile d'observer clairement les interactions CTC / CE. En outre, un faible volume mort dans les tubes de liaison est essentielle pour éviter le piégeage des CTC dans les tuyaux de raccordement. Les tubes silastiques raccordement fournis avec le PPFC norme ont un large diamètre intérieur (0,16 po). Au contraire, Bioflux système microfluidique offre plein champ de vision de l'objectif 20X et est utile pour l'étude des changements induits par cisaillement dans l'EC ^14, cependant, les cellules cancéreuses commencent s'installer dans les puits de la chambre menant à écoulement non-uniforme. Bioflux microfluidique est utile pour l'étude des changements induits par cisaillement dans l'EC, cependant, il est techniquement difficile à utiliser. Notre chambre d'écoulement auto-assemblés à l'aide microlame a une largeur de canal étroit (1 mm) à la largeur de canal standard en PPFC, permettant plus observationzone tional. En outre, les CE sont cultivées sous perfusion dans microlame simulant la circulation sanguine physiologique, contrairement Ganguly et al. ^7, les études où les CE sont cultivés sur microplaques (avec une largeur de canal plus large) dans des conditions statiques. Le volume mort à l'intérieur des tubes de liaison est réduite à l'aide d'un tube de liaison avec le diamètre intérieur de 0,02 pouce Collectivement, marquage par immunofluorescence des cellules tumorales de la prostate, de la largeur correcte de canal d'écoulement, et de plus petit diamètre intérieur des tubes de liaison permet d'identifier les CTC de la prostate et observer leurs interactions avec les CE.

Il ya quelques étapes critiques dans le protocole, cependant, avec des soins appropriés les expériences peuvent fonctionner correctement. Prévention des bulles est crucial pour toutes les expériences basées sur les flux. Dans notre expérience, en utilisant au chaud (37 ° C) du milieu de croissance, des connecteurs, et la seringue empêche la formation de bulles, en réduisant les écarts de température. En supplén, il faut prendre soin lors de la connexion de la seringue avec la microplaque. À la fois le connecteur raccordé à la seringue et l'orifice d'entrée de la microplaque doit être rempli à ras bord, de ce fait, éviter toute formation de bulles. L'une des limitations de la technique est que, depuis le canal de microplaque est 45 x 1 mm (hauteur x largeur), il ne peut tenir 4,5 ul de milieu de croissance. Par conséquent, microlame ne peut être utilisé pour la culture statique et nécessite une perfusion continue de milieu de croissance pour éviter l'acidification et de maintenir l'approvisionnement des nutriments pour HUVEC. Cependant, l'approvisionnement continu du milieu peut être aisément réalisé en utilisant une pompe à seringue reliée à la microplaque dans l'incubateur. Tout en enrichissant CTC de patients atteints de cancer de la prostate, il faut prendre soin d'effectuer une pré-couche tous les tubes, des conseils, des pipettes, des seringues et à venir en contact avec les CTC avec le tampon R / S pour empêcher la liaison non spécifique. En outre, toutes les étapes après centrifugation Ficoll-Paque densité, eauf J591-488 anticorps incubation, doit être effectuée à 4 ° C afin d'éviter la dégradation de la CTC.

Notre technique est unique en comparaison de différentes méthodes de compréhension CTC biologie. Le présent rapport décrit immunomarquage fluorescent viable de CTC de la prostate qui permet d'observer les caractéristiques fonctionnelles du CTC de la prostate, d'ailleurs seulement les propriétés phénotypiques. En outre, la méthode décrite nécessite volume de l'échantillon / réactif faible que les autres méthodes qui en fait un système idéal pour les études d'immunofluorescence. Notre méthodologie fournit une plate-forme unique pour étudier les interactions entre les CTC de la prostate provenant de patients et EC, ainsi, aider à comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des métastases de cancer de la prostate. Cette technique a le potentiel pour de nombreuses applications impliquant des études de flux à base de cisaillement, tels que les interactions cellule-cellule ^8, interactions cellule-protéine ¹⁵ 16, et les changements induits par cisaillement dans EC ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02