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मरीजों और मानव endothelial कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्रोस्टेट परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के बीच ई selectin की मध्यस्थता मुलाकातों का निरीक्षण करने के लिए इन विट्रो विधि में

Published: May 15, 2014 doi: 10.3791/51468
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Department of Urology, Weill Cornell Medical College

Summary

हमारी रिपोर्ट शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में प्रोस्टेट कैंसर में सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक अनूठा तरीका वर्णन करता है.

Abstract

मेटास्टेसिस ट्यूमर कोशिकाओं एक माध्यमिक आला बह निकलना और के लिए फार्म का उपयोग हो रहा है, जिससे प्राथमिक ट्यूमर intravasate रक्त नाड़ी और लसीका प्रणाली से शेड जिसमें एक प्रक्रिया है. रक्त नाड़ी तंत्र से ट्यूमर कोशिकाओं की परिस्त्राव विभिन्न सेल लाइनों से प्राप्त endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) और ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. प्रारंभिक अध्ययन स्थिर शर्तों का उपयोग किया गया है, लेकिन यह अच्छी तरह से ईसीएस शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत अलग ढंग से व्यवहार कि प्रलेखित किया गया है. इसलिए, विभिन्न प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं वर्तमान में ईसीएस के साथ कैंसर सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. वर्तमान प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं अलग कतरनी तनाव की स्थिति में विभिन्न सेल लाइनों या तरल पदार्थ का उपयोग प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करते हैं. हालांकि, निरीक्षण और इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी के रूप में दुर्लभ कोशिकाओं के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए, कुछ परिवर्तन पारंपरिक प्रवाह चैम्बर विधानसभा के लिए किए जाने की आवश्यकता है. CTCsरक्त कोशिकाओं के लाखों लोगों के बीच एक दुर्लभ सेल आबादी हैं. नतीजतन, यह CTCs की एक शुद्ध आबादी को प्राप्त करना कठिन है. सामान्य रूप से प्रचलन में पाया कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ CTCs की संदूषण मौजूद संवर्धन या कमी तकनीक का उपयोग अनिवार्य है. वर्तमान रिपोर्ट में, हम fluorescently लेबल परिसंचारी प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को एक अनोखी विधि का वर्णन है और एक आत्म इकट्ठे प्रवाह चैम्बर प्रणाली में ईसीएस के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन. इस तकनीक को आगे प्रोस्टेट CTCs और ब्याज की किसी भी प्रोटीन के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

मेटास्टेसिस खराब समझ बनी हुई है कि एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है. E-selectin/selectin ligand अक्ष संवहनी endothelium और कैंसर कोशिकाओं 1,2 के बीच प्राथमिक चिपकने वाला बातचीत को बढ़ावा देने के द्वारा ट्यूमर मेटास्टेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. अलग ई selectin ligand (ओं) ट्यूमर कोशिकाओं 3 द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, जबकि endothelial (ई) selectin के सक्रिय endothelial कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक transmembrane प्रोटीन है. कई में इन विट्रो दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ट्यूमर कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच E-selectin/selectin ligand बातचीत (ईसीएस) 1 मॉडल के लिए नियोजित किया गया है. इन संबंधों का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न प्रवाह चैम्बर सिस्टम रक्त नाड़ी तंत्र अनुकरण करने के लिए नियोजित किया जा रहा है. प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं के अलावा, ईसीएस के साथ संयोजन के रूप में समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर (PPFC) नियमित विवो कतरनी तनाव की स्थिति में अनुकरण इन विट्रो मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस मेंविधि, ईसीएस एक 35 मिमी पकवान पर हो रहे हैं और एक monolayer को प्राप्त करने के बाद, ईसीएस PPFC से जुड़े होते हैं और कतरनी तनाव आधारित प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं.

हालांकि, PPFC और अन्य मौजूदा सिस्टम रोगियों और ईसी से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs), परिसंचारी के बीच चिपकने वाला बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई सीमाएं उपस्थित मुख्य रूप से, CTCs रक्त कोशिकाओं के लाखों लोगों के बीच घूम, प्राथमिक ट्यूमर से शेड कोशिकाओं के एक दुर्लभ आबादी, क्योंकि (1 सीटीसी 9 रक्त कोशिकाओं 10 प्रति) 4. इसलिए, सभ्य सेल लाइनों की असीमित की आपूर्ति के विपरीत, कम सीटीसी मायने रखता प्लेबैक के विश्लेषण के लिए बातचीत रिकॉर्ड करने के लिए उचित प्रवाह चैनल चौड़ाई की आवश्यकता होती है, बहुत कुछ और दुर्लभ सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत करने के लिए नेतृत्व. रोगी व्युत्पन्न CTCs एक अशुद्ध जनसंख्या के बाद से ही, इसलिए एक पहचान मार्कर विशिष्ट में CTCs ट्रैक करने के लिए आवश्यक है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम (पीसीए) सीटी प्रोस्टेट कैंसर की पहचान करने के लिए एक नई विधि विकसितसीएस लगभग सभी इन CTCs की उनके कोशिका की सतह 5,6 पर प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली (PSMA) व्यक्त तथ्य यह है कि का लाभ लेने के द्वारा. इस रिपोर्ट में, हम अंत में मेटास्टेसिस के तंत्र को समझने की, ईसीएस के साथ प्रोस्टेट सीटीसी बातचीत का अध्ययन करने के लिए हमारी नई प्रणाली की संभावित उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन, एमडीए PCa2b (एमडीए) का इस्तेमाल किया.

हमारी कार्यप्रणाली विवो नाड़ी तंत्र 7-9 में अनुकरण विभिन्न कतरनी आधारित प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है. पीसीए सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत की जांच के अलावा, वर्तमान प्रवाह चैम्बर प्रणाली को आसानी से परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं का विश्लेषण या ईसीएस के साथ ट्यूमर कोशिकाओं 'बातचीत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. disassembling और प्रवाह कक्ष के reassembling में आसानी, एक microslide III (0.1) (इसके बाद microslide के रूप में कहा गया है), छिड़काव और जनसंपर्क के लिए प्रेरित करने के लिए विभिन्न साइटोकिन्स साथ ईसीएस उत्तेजक तहत संवर्धन ईसी की अनुमति देता हैअभिव्यक्ति otein. इसके अलावा, सुसंस्कृत ईसीएस, जैसे ई और पी selectin पुनः संयोजक प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ microslide और बातचीत पर लेपित किया जा सकता है लामिना का प्रवाह की स्थिति 10 के नीचे देखा जा सकता है.

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Protocol

अवलोकन सीटीसी endothelial बातचीत के लिए Microslides पर 1. संवर्धन HUVECs

  1. टिशू कल्चर हुड के तहत, प्रथम, पीबीएस के साथ 1 मिमी के चैनल चौड़ाई microslide कुल्ला. धीरे कोट 50 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin (पीबीएस में भंग) एक 1 एमएल luer ताला सिरिंज का उपयोग कर के 200 μl के साथ microslide.
  2. ढक्कन के साथ microslide कवर और 30 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड के अंदर रहते हैं. Microslide में तरल का धीरे वितरण चैनल में बुलबुला गठन से बचाता है.
  3. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) HUVEC मध्यम विकास के 200 μl छिड़कना (M199 मीडिया, 1M HEPES, 20% FBS, 5 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल endothelial सेल वृद्धि कारक, और एल glutamine) microslide पर और के लिए सेते आरटी पर 20 मिनट. छिड़काव के दौरान, HUVEC सेल निलंबन तैयार करते हैं.
  4. पीबीएस के साथ HUVECs कुल्ला और आरटी पर 1-2 मिनट के लिए 0.05% trypsin EDTA जोड़ें. 5 मिनट के लिए 180 XG पर 2 मिलीलीटर मध्यम विकास में अपकेंद्रित्र HUVECs.
  5. एक neuba का उपयोग सेल एकाग्रता उपायuer hemocytometer और मध्यम विकास μl 10 7 HUVEC cells/100 तैयार करते हैं. फिर, ध्यान से एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग microslide के प्रवेश से मध्यम निकालें.
  6. आँख के स्तर को microslide और एक 1 एमएल luer ताला सिरिंज का उपयोग कर ले आओ, धीरे चैनल में HUVECs के लिए तैयार एकाग्रता के 200 μl छिड़कना. सावधानी बुलबुला बनने से रोकने के लिए इस कदम पर आवश्यक है. बुलबुले दिखाई देते हैं, बुलबुले आउटलेट चैनल में प्रवेश जब तक एक थोड़ा लंबा समय के लिए perfusing रखना.
  7. इनलेट और microslide के आउटलेट दोनों में HUVEC मीडिया के एक बराबर मात्रा (~ 80 μl) रखो. यह या तो दिशा में कोशिकाओं के प्रवाह को रोकता है.
  8. स्लाइड कवर और यह 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में (37 डिग्री सेल्सियस) में रहते हैं.

एक Microslide पर रातों रात HUVEC संस्कृति के लिए प्रवाह चैम्बर विधानसभा के 2. तैयारी

  1. 15 मील के लिए इनक्यूबेटर में एक बाँझ 20 मिलीलीटर सिरिंज, महिला और पुरुष Luer कनेक्टर्स, ट्यूबिंग, और एक सिरिंज पंप रखेंएन.
  2. कम से कम मृत मात्रा के लिए, 0.04 इंच का भीतरी व्यास के साथ ट्यूबिंग का उपयोग करें. छोटे ट्यूबिंग व्यास बुलबुला गठन से बचाता है.
  3. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) HUVEC मीडिया (12 एमएल) के साथ 20 मिलीलीटर सिरिंज भरें. सिरिंज पर कनेक्टर के साथ ट्यूबिंग देते हैं. बुलबुले निकालें. Microslide को इस विधानसभा जोड़ने.
  4. पूरी तरह से HUVEC मीडिया के साथ microslide के इनलेट भरें. अगले microslide लिए कनेक्टर से जुड़ी भरा 20 मिलीलीटर सिरिंज ले आओ. धीरे microslide लिए कनेक्टर देते हैं.
  5. इनक्यूबेटर में सेट अप लाने और इसे 10 μl / मिनट कतरनी दर पर सेट सिरिंज पंप, से कनेक्ट करें. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं हे / एन छोड़ दो
  6. अगले दिन, microslide के प्रवेश से जुड़ी कनेक्टर को हटाने के द्वारा सेट अप जुदा.
  7. ईसीएस पर ई selectin अभिव्यक्ति upregulate करने के लिए, 4 एमएल मीडिया में / एमएल एनजी 10 में आईएल 1β युक्त ताजा मध्यम विकास तैयार करते हैं. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में मीडिया aspirate. टी निकालेंवह microslide के प्रवेश से मीडिया और स्लाइड के लिए सिरिंज कनेक्ट.
  8. इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए 10 μl / मिनट कतरनी दर पर सिरिंज पंप सेट.

3. विरोधी PSMA की तैयारी (J591-488) नामक प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं

  1. HUVECs के आईएल 1β ऊष्मायन के दौरान विरोधी PSMA J591-alexa488 लेबल पीसीए कोशिकाओं को तैयार. 1 मिनट के लिए एमडीए कोशिकाओं को 0.05% trypsin EDTA जोड़ें. यह कोशिका की सतह पर मौजूद glycopeptides प्रभावित कर सकते हैं के रूप में लंबे समय तक बार के लिए trypsin के लिए कोशिकाओं का खुलासा नहीं करते. एनजाइम फ्री सेल हदबंदी अभिकर्मक भी बजाय trypsin के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र.
  2. 1 मिलीलीटर एच / एच बफर (हैंक्स संतुलित नमक solution/0.1% HSA/10 मिमी HEPES / 1 मिमी 2 CaCl) में एमडीए सेल गोली Resuspend. एक अंधेरी जगह में आरटी पर 30 मिनट के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी PSMA J591-alexa488 एंटीबॉडी जोड़ें. ऊष्मायन के दौरान कोशिकाओं Resuspend.
  3. 30 मिनट के बाद 5 मिनट के लिए 800 XG पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र. ASPIदर और 1 एमएल एच / एच बफर में गोली resuspend. लेबल एमडीए कक्षों की गणना और 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल अंतिम एकाग्रता लाने. J591-488 लेबल एमडीए कोशिकाओं के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज भरें और बुलबुले को दूर.

4. पीसीए मरीजों से विरोधी PSMA (J591-488) नामक CTCs समृद्ध की तैयारी

  1. (सोडियम साइट्रेट युक्त) एक नीले रंग की टोपी ट्यूब में प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों से 7.5 मिलीलीटर रक्त ले लीजिए. धीरे 0.1% बीएसए / 1 मिमी EDTA / पीबीएस में रक्त 01:01 पतला.
  2. 5.3 मिलीलीटर Ficoll Paque प्लस एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें. परत Ficoll-Paque के शीर्ष पर खून पतला. 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  3. पूर्व कोट सभी ट्यूबों या सुझावों 2% FBS/RPMI-1640 / 1 मिमी CaCl 2/4 मिमी 2 MgCl सतहों को CTCs की गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए (आर / एस बफर) के साथ CTCs के साथ संपर्क में आ रहे हैं. CTCs के साथ संपर्क में आने के मीडिया और buffers के 4 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखें.
  4. परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMCs) अंश लीजिए30 मिलीलीटर आर / एस बफर युक्त एक और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इंटरफ़ेस से CTCs युक्त. 8 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. गोली Resuspend और 8 मिनट के लिए 400 XG पर आर / एस बफर में फिर से धो लो. Centrifugation के बाद, एच / एच बफर में गोली resuspend. एक अंधेरी जगह में आरटी पर 30 मिनट के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी PSMA J591-488 एंटीबॉडी जोड़ें.
  6. 30 मिनट के बाद 5 मिनट के लिए 800 XG पर J591-488 लेबल CTCs युक्त PBMCs अपकेंद्रित्र. एच / एच बफर में Resuspend. नमूने के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज (आर / एस बफर के साथ पूर्व में लिपटे) भरें.

5. माइक्रोस्कोप की तैयारी, सिरिंज पंप और प्रवाह चैम्बर विधानसभा

  1. उलटा माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और 10X उद्देश्य पर Kohler रोशनी निर्धारित किया है. माइक्रोस्कोप का नमूना मंच के रूप में एक ही स्तर पर सिरिंज पंप लाओ और 1 dyn के / 2 सेमी कतरनी तनाव (~ 10 μl / मिनट) पर यह निर्धारित किया है.
  2. Zeiss AxioVision सॉफ्टवेयर खोलें. कंप्यूटर स्क्रीन पर उद्देश्य का चयन करें. एक नया बनाएँसॉफ्टवेयर में उपकरण विकल्प के तहत फ़ोल्डर.
  3. AxioVision में स्मार्ट प्रयोगों विकल्प खुला और 30 मिनट के लिए कम 30 सेकंड के वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए सेटिंग्स समायोजित.
  4. लाइव फ्लोरोसेंट वीडियो के लिए, छवि विकल्प-12 मिसे एक्सपोजर, 2 एक्स 2 बिन, 5 लाभ निर्धारित. इन मानकों जीस MRM कैमरे के साथ वीडियो फ्रेम दर (~ प्रति सेकंड 23 फ्रेम) के करीब वीडियो को प्राप्त करने में मदद करते हैं.
  5. , कंप्यूटर स्क्रीन पर 10 एक्स उद्देश्य में प्रवाह चैनल की पूरी चौड़ाई कल्पना एक C-माउंट एडाप्टर (0.63 xf/60 मिमी इंटरफेस) का उपयोग करें.
  6. पारा दीपक पर स्विच करें.
  7. सिरिंज पंप पर सिरिंज और कोशिकाओं से युक्त कनेक्टर रखें.
  8. लाओ आईएल 1β इनक्यूबेटर से HUVECs को प्रेरित किया. HUVECs युक्त microslide का भरा इनलेट चैनल को योजक संलग्न.
  9. ट्यूबिंग से जुड़ी कनेक्टर के साथ आउटलेट चैनल कनेक्ट. के माध्यम से प्रवाह को इकट्ठा करने के लिए एक डिश या 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ट्यूबिंग रखो.
  10. Infusi प्रारंभ10 μl / मिनट पर microslide माध्यम पर. Endothelial कोशिकाओं और लेबल एमडीए कोशिकाओं या epifluorescence खुर्दबीन पर 488 एनएम फिल्टर के तहत रोगियों से ली गई लेबल CTCs के बीच मुलाकातों का निरीक्षण.
  11. 30 सेकंड कम वीडियो के रूप में प्रयोग शुरू रिकॉर्डिंग. प्लेबैक विश्लेषण के दौरान, रोलिंग वेग को मापने. रोलिंग वेग समय के साथ कोशिकाओं द्वारा तय की गई दूरी विभाजित करके मापा जाता है.

Microslide की 6. Immunostaining

  1. 10 मिनट के लिए आईएल 1β उत्तेजित HUVECs पर एमडीए कोशिकाओं perfusing बाद microslide के इनलेट और आउटलेट से मीडिया निकालें.
  2. एक 200 μl टिप का उपयोग करना, 5 मिनट के लिए microslide के इनलेट में कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस डाल दिया. बेंच पर एक आधार के रूप में अपनी ढक्कन का उपयोग microslide झुकाएँ. Immunostaining के दौरान सभी incubations के लिए एक झुका स्थिति में microslide रखें.
  3. इनलेट में गर्म 2% formaldehyde perfusing द्वारा HUVECs फिक्स
  4. आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 5% BSA में ट्राइटन-X 100 (0.1%) में जोड़ें.
  5. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला. 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% BSA के साथ ब्लॉक.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी बकरी के साथ सेते विरोधी VE-cadherin (1:100) 2.5% बीएसए हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस पर
  7. अगले दिन, 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोने. 45 मिनट के लिए माध्यमिक गधा विरोधी बकरी 647 एंटीबॉडी जोड़ें. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं.
  8. 1 घंटे के लिए humanized J591-alexa488 संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ आरटी पर सेते हैं.
  9. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं. 5 मिनट के लिए DAPI जोड़ें. 5 मिनट के लिए आसुत जल से धो लें.
  10. पीबीएस जोड़ें (या लंबी अवधि के भंडारण के लिए Mowiol). Confocal खुर्दबीन के नीचे microslide कल्पना.

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Representative Results

चित्रा 1 microslide पर ईसी की एक monolayer की एक हे / एन संस्कृति को दर्शाता है. चित्रा 1 ए पर scalings microslide की 100% से 70% एक 10X उद्देश्य (चित्रा 1 बी) का उपयोग करते हुए दिखाई दे रही है, जबकि 5X उद्देश्य का उपयोग दिख रहा है कि पता चलता है. ई selectin मध्यस्थता बातचीत के लिए, किनारों पर रोलिंग कोशिकाओं वीडियो रिकॉर्डिंग और प्लेबैक के विश्लेषण के लिए microslide के 70% से अधिक उपलब्ध बनाता है जो नहीं माना जाता है. हमारे अनुभव में, शुरू में इस व्यवस्था को विधानसभा संस्कृति को कतरनी तनाव में ईसीएस के एक monolayer कुछ अभ्यास की जरूरत है. Microslide पर चुनाव आयोग विकास की स्थापना के बाद, हम, प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को एमडीए लेबल. J591-488 विरोधी PSMA एंटीबॉडी की विशिष्टता स्वस्थ दाता रक्त में नुकीला और विरोधी PSMA J591-488 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लेबल fluorescently के साथ लेबल एमडीए कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. कोई PSMA immunostaining PBMCs (नहीं दिखाया डेटा) में मनाया गया. J591-488 बंधन और internalization Alte कि संभावना को खारिज करने के लिएरुपये व्यवहार रोलिंग, हम J591-488 के साथ एमडीए कोशिकाओं लेबल और 1-10 dyn के / 2 सेमी से लेकर कतरनी तनाव में unlabeled एमडीए कोशिकाओं के साथ रोलिंग व्यवहार की तुलना में. बॉक्स साजिश अलग कतरनी तनाव की स्थिति में आईएल 1β उत्तेजित ईसीएस पर दोनों unlabeled और J591-488-लेबल एमडीए कोशिकाओं के रोलिंग वेग के वितरण से पता चलता है. कोई महत्वपूर्ण अंतर 1 पर रोलिंग वेग में मनाया गया था और क्रमश: 5 dyn के / 2 सेमी, पी = .634 और पी = .601, चित्रा (2). 10 dyn के / 2 सेमी की उच्च कतरनी तनाव में, एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर unlabeled के रोलिंग वेग और J591-488-लेबल एमडीए कोशिकाओं (पी <0.05) के बीच मनाया गया. पिछले अध्ययनों उच्च कतरनी तनाव (> 3 dyn के / 2 सेमी) की स्थिति में, कम ट्यूमर कोशिकाओं पालन करना और कम कतरनी तनाव की स्थिति 11,12 की तुलना में ईसीएस पर रोल बताते हैं कि. इसलिए, ट्यूमर कोशिकाओं और ईसी के बीच बातचीत का विश्लेषण पढ़ाई कम कतरनी तनाव में आयोजित की जाती हैं. गुहमें, हमारे डेटा CTCs J591-488 और CTCs की कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग काफी कतरनी तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला पर रोलिंग व्यवहार को प्रभावित नहीं करता है के साथ लेबल किया जा सकता है. ध्यान से, हम ईसीएस (नहीं दिखाया डेटा) के आईएल 1β उत्तेजना के अभाव में किसी भी सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत का पता नहीं चला. इसके अलावा, सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, हम भी J591-488 के साथ सीआरपीसी रोगियों से अलग और आईएल 1β उत्तेजित ईसीएस से अधिक perfused समृद्ध CTCs लेबल. एक समय सिले वीडियो प्रोस्टेट CTCs और ईसी के बीच बातचीत का विभिन्न प्रकार से पता चलता है (वीडियो) 1. वीडियो (CTCs भी 30 सेकंड के बाद अलग नहीं किया था) बातचीत स्थिर आसंजन के तीन प्रकार से पता चलता है, tethering (CTCs देते हैं और पुनः अनुलग्न), और कोई बातचीत. Microslides आसानी immunostained किया जा सकता है और microslides एक 1.5 मिमी मोटी coverglass 7 के रूप में इसी तरह की ऑप्टिकल विशेषताओं है क्योंकि फ्लोरोसेंट छवियों लिया जा सकता है. चित्रा 3 J591-488 लेबल एमडीए कोशिकाओं पिछाड़ी की फर्म आसंजन से पता चलता हैआईएल 1β उत्तेजित ईसीएस अधिक एर छिड़काव.

चित्रा 1
चित्रा 1:.. Microslide पर सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं की एक monolayer HUVECs सुसंस्कृत हे / एन 5X उद्देश्य पर कतरनी तनाव के तहत एक fibronectin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) लेपित microslide III (0.1) (1 dyn के / 2 सेमी) ए) पर थे (ईसी योजना NEOFLUAR 5X/0.16), सुसंस्कृत ईसीएस के साथ पूरा प्रवाह चैनल चौड़ाई मनाया गया. चैनल की चौड़ाई चैनल के 1,065.79 माइक्रोन मनाया गया, 10X उद्देश्य (योजना NEOFLUAR 10X/0.3 Ph1) में 1,545.95 माइक्रोन. बी) होना मापा गया था. इस ईसीएस microslide पर ओ / एन संवर्धित किया जा सकता है और microslide के 70% 10x बढ़ाई पर दिख रहा है कि पता चलता है. ve एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के rsion.

चित्रा 2
ईसीएस पर एमडीए कोशिकाओं के चित्रा 2. रोलिंग वेग microslide पर सुसंस्कृत. एक लाख unlabeled और J591-488 लेबल एमडीए कोशिकाओं आईएल 1β उत्तेजित HUVECs अधिक perfused थे. Microslide पर विभिन्न क्षेत्रों में दस वीडियो 1,5 में दर्ज की गई, और 10 dyn के / 2 सेमी गया. कतरनी तनाव गणना निर्माता द्वारा प्रदान किया गया. रोलिंग वेग के लिए ऑफ़लाइन विश्लेषण किया गया था. एन = रोलिंग वेग माप के लिए गिना कोशिकाओं की संख्या. बॉक्स भूखंड रोलिंग वेग और J591-488 लेबल और unlabeled एमडीए की कोशिकाओं के बीच बीच का मतभेद के वितरण से पता चलता है. पी <0.05, Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण. हलकों outliers का प्रतिनिधित्व करते हैं. छठी यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण EW.

चित्रा 3
Microslide पर ईसीएस के साथ बातचीत के दौरान एमडीए कोशिकाओं के चित्रा 3. Immunostaining. एक लाख एमडीए कोशिकाओं 1 dyn के / 2 सेमी कतरनी तनाव में आईएल 1β उत्तेजित HUVECs अधिक perfused थे. छिड़काव के बाद, immunostaining microslide पर प्रदर्शन किया गया था. पीले तीर मजबूती ईसीएस का पालन एमडीए कोशिकाओं दिखा. PSMA = लाल, = ग्रीन, DAPI = ब्लू cadherin के VE. मर्ज किए गए छवि सभी रंगों को दर्शाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 1. आईएल 1β उत्तेजित HUVECs और एक प्रोस्टेट कैंसर रोगी से समृद्ध विरोधी PSMA J591-488-लेबल CTCs के बीच बातचीत दिखा वीडियो. एक monolayer ओच HUVECs एक रोगी से समृद्ध CTCs युक्त microslide III (0.1) और विरोधी PSMA J591-488-लेबल परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) पर सुसंस्कृत था / 2 सेमी 1 dyn पर HUVECs पर perfused किया गया था. छिड़काव के दौरान, कम 30 सेकंड के वीडियो microslide पर विभिन्न क्षेत्रों में दर्ज किया गया. वीडियो के अधिग्रहण के समय नीचे बाएँ कोने पर दिखाया गया है. विभिन्न लघु वीडियो इस वीडियो को संकलित करने के लिए एक साथ सिले थे. 02:16:36 पर, एक गैर बातचीत सीटीसी देखने के ऊपरी बाएँ क्षेत्र में प्रवेश करती है; 02:19:16 पर, एक और गैर बातचीत सीटीसी देखने के बाएँ कोने क्षेत्र में प्रवेश करती है; 02:23:12 में, देखने के शीर्ष मध्य क्षेत्र में एक stably पालन सीटीसी में देखा जाता है. 02:38:09 पर, एक stably पालन सीटीसी देखा है देखने के क्षेत्र के सही पक्ष पर देखा जाता है. इस वीडियो के रूप में अच्छी तरह से PBMCs की बातचीत को दिखाने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट चैनल दोनों का उपयोग कर लिया गया था. 02:40:18 पर, stably पालन CTCs देखने के शीर्ष मध्य क्षेत्र में मनाया गया. इस वीडियो उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग कर लिया गया थाऔर फ्लोरोसेंट चैनल PBMCs में रोलिंग व्यवहार दिखाने के लिए. 02:51:49 माध्यम 02:51:39 से, एक सीटीसी प्रदर्शन tethering व्यवहार देखने के नीचे क्षेत्र में मनाया गया. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

कारण रक्त कोशिकाओं के बीच CTCs की कम संख्या के कारण, यह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के रूप में CTCs अलग करने के लिए मुश्किल है. सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत का अध्ययन करने के लिए, CTCs की दुर्लभ और अशुद्ध आबादी दो प्रमुख चुनौतियों बन गया है: रक्त कोशिकाओं के बीच CTCs की एक) पहचान; ख) सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत का अवलोकन.

रक्त कोशिकाओं के बीच प्रोस्टेट CTCs की पहचान करने के पहले सीमा पार, हम लगभग सभी प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं PSMA 6 व्यक्त तथ्य यह है कि का फायदा उठाया. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी J591-488 पीसीए CTCs पूर्व vivo लेबल और सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत 13 के लिए अध्ययन किया जा सकता सुझाव है कि बाध्यकारी सेल सतह निम्नलिखित भाँति है. एंटीबॉडी और अधिक से अधिक immunofluorescence के इष्टतम internalization के लिए, हम 30 मिनट या 1 घंटे के लिए या तो 4 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस या तो एंटीबॉडी के साथ एमडीए कोशिकाओं incubated. हम अधिकतम immunofluorescence पर देखा गया है कि मनाया30 मिनट (डेटा) नहीं दिखाया और प्रोस्टेट कोशिकाओं की Immunofluorescent लेबलिंग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस unlabeled प्रोस्टेट कोशिकाओं के साथ तुलना रोलिंग व्यवहार को प्रभावित नहीं किया.

दूसरी सीमा को पार करने के लिए, हम इस तरह के PPFC, BioFlux microfluidics प्रणाली, और Microslides रूप में 7 अलग प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं का परीक्षण किया. PPFC शारीरिक प्रवाह की स्थिति 9 के तहत ईसीएस के साथ ल्युकोसैट और ट्यूमर सेल बातचीत की जांच के लिए एक मुख्य आधार बन गया है. इस प्रवाह प्रणाली इस तरह के कैंसर कोशिका लाइनों के रूप में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की बातचीत का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन इस तरह के रोगी व्युत्पन्न CTCs और ईसी के रूप में दुर्लभ कोशिकाओं के बीच मुलाकातों का निरीक्षण और अध्ययन करने के लिए आदर्श नहीं. CTCs, दुर्लभ कोशिकाओं जा रहा है, इसलिए, प्रवाह चैनल की पूरी चौड़ाई की रिकॉर्डिंग प्लेबैक विश्लेषण के दौरान CTCs / ईसीएस के बीच दुर्लभ घटना मुलाकातों का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है, प्रवाह चैनल में किसी भी स्थान पर बेतरतीब ढंग से ईसीएस के साथ बातचीत कर सकते हैं. गुPPFC (2.5 मिमी) में इस्तेमाल किया Silastic गैस्केट की ई चौड़ाई 10x उद्देश्य के तहत देखने का एक पूरा क्षेत्र प्रदान नहीं करता है. जबकि, 10X उद्देश्य से एक कम बढ़ाई, यह स्पष्ट रूप से सीटीसी / चुनाव आयोग मुलाकातों का निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो जाता है. इसके अलावा, जोड़ने ट्यूबों में कम मृत मात्रा को जोड़ने ट्यूबों में CTCs की फँसाने बचने के लिए आवश्यक है. मानक PPFC के साथ प्रदान की Silastic जोड़ने ट्यूबों एक विस्तृत भीतरी व्यास (अंदर 0.16) है. इसके विपरीत, BioFlux microfluidics प्रणाली 20X उद्देश्य के तहत देखने का पूरा क्षेत्र प्रदान करता है और ईसी 14 में कतरनी प्रेरित परिवर्तनों का अध्ययन करने में उपयोगी है, हालांकि, कैंसर की कोशिकाओं को गैर वर्दी प्रवाह करने के लिए अग्रणी चैम्बर कुओं में बसने लगते हैं. BioFlux microfluidics हालांकि, इसका इस्तेमाल करने के लिए तकनीकी रूप से बोझिल है, ईसीएस में कतरनी प्रेरित परिवर्तनों का अध्ययन करने में उपयोगी है. Microslide का उपयोग हमारी आत्म इकट्ठे प्रवाह चैम्बर अधिक observa की अनुमति, PPFC में मानक चैनल चौड़ाई की तुलना में एक संकीर्ण चैनल चौड़ाई (1 मिमी) हैराष्ट्रीय क्षेत्र. इसके अलावा, ईसीएस, microslide अनुकरण शारीरिक रक्त प्रवाह में छिड़काव के तहत सुसंस्कृत हैं गांगुली के विपरीत एट अल. 7, ईसीएस स्थिर स्थिति में (व्यापक चैनल चौड़ाई के साथ) microslides पर हो रहे हैं, जहां पढ़ाई. जोड़ने ट्यूबों के अंदर मृत मात्रा सामूहिक रूप से, प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं की Immunofluorescent लेबलिंग, उचित प्रवाह चैनल चौड़ाई, और जोड़ने ट्यूबों के छोटे भीतरी व्यास अंदर 0.02 के भीतरी व्यास के साथ एक जोड़ने ट्यूब का उपयोग करके कम किया है एक प्रोस्टेट CTCs की पहचान करने की अनुमति देता है और ईसीएस के साथ उनकी बातचीत का पालन.

प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रयोगों को सुचारू रूप से चला सकते हैं उचित देखभाल के साथ, तथापि, वहाँ रहे हैं. बुलबुले की रोकथाम के किसी भी प्रवाह आधारित प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे अनुभव में, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मध्यम विकास, कनेक्टर्स, और सिरिंज का उपयोग कर तापमान मतभेदों को कम करने से बुलबुले के गठन से बचाता है. Additio मेंmicroslide साथ सिरिंज जोड़ने जबकि एन, ध्यान रखा जाना चाहिए. दोनों सिरिंज और microslide के प्रवेश से जुड़ी कनेक्टर किसी भी बुलबुला गठन को रोकने, जिससे सीमा से भरा जाना चाहिए. तकनीक की सीमाओं में से एक microslide चैनल 45 x 1 मिमी (लम्बाई x चौड़ाई) है के बाद से, यह केवल मध्यम विकास की 4.5 μl पकड़ कर सकते हैं. इसलिए, microslide स्थिर संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया और अम्लीकरण को रोकने और HUVECs के लिए पोषक तत्वों की समुचित आपूर्ति बनाए रखने के लिए मध्यम विकास के निरंतर छिड़काव की आवश्यकता नहीं किया जा सकता. हालांकि, मध्यम की सतत आपूर्ति आसानी इनक्यूबेटर में microslide से जुड़े एक सिरिंज पंप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों से CTCs को समृद्ध करते हैं, देखभाल पूर्व कोट करने के लिए लिया जाना चाहिए सभी ट्यूबों, टिप्स, pipettes, और गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए आर / एस बफर के साथ CTCs के साथ संपर्क में आने सीरिंज. इसके अलावा, सभी चरणों के बाद Ficoll-Paque घनत्व centrifugation, ईxcept J591-488 एंटीबॉडी ऊष्मायन, CTCs की गिरावट को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाना चाहिए.

हमारी तकनीक सीटीसी जीव विज्ञान को समझने के विभिन्न तरीकों की तुलना में अद्वितीय है. वर्तमान रिपोर्ट एक बस प्ररूपी गुणों के अलावा, प्रोस्टेट CTCs की कार्यात्मक विशेषताओं का निरीक्षण करने की अनुमति देता है जो प्रोस्टेट CTCs की व्यवहार्य फ्लोरोसेंट immunolabeling वर्णन करता है. इसके अलावा, वर्णित विधि यह immunofluorescence पढ़ाई के लिए एक आदर्श व्यवस्था के लिए अन्य तरीकों की तुलना में कम नमूना / अभिकर्मक मात्रा की आवश्यकता है. हमारी पद्धति इस प्रकार, प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस के विकास में शामिल तंत्र को समझने में मदद करने, रोगियों और ईसी से व्युत्पन्न प्रोस्टेट CTCs के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है. इस तकनीक को इस तरह के सेल सेल बातचीत 8, सेल, प्रोटीन बातचीत के रूप में 15 कतरनी प्रवाह आधारित अध्ययन से जुड़े कई अनुप्रयोगों के लिए क्षमता है 16, और ईसी 14 में कतरनी प्रेरित परिवर्तन.

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Disclosures

डॉ. Bander इस लेख में इस्तेमाल J591 एंटीबॉडी के लिए कॉर्नेल रिसर्च फाउंडेशन ("सीआरएफ") ​​को सौंपा है कि पेटेंट पर आविष्कारक है. डॉ. Bander के लिए एक सलाहकार है और BZL बायोलॉजिक्स, पेटेंट और अधिक अनुसंधान और विकास के लिए सीआरएफ द्वारा लाइसेंस दिया गया है, जो करने के लिए कंपनी में शेयर का मालिक है.

Acknowledgments

यह काम विभाग के डिफेंस, प्रोस्टेट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (W81XWH-12-1-0124) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, और रॉबर्ट McCooey Genitourinary कैंसर रिसर्च फंड से U54CA143876. हम HUVECs प्रदान करने के लिए VE-cadherin एंटीबॉडी उपलब्ध कराने के लिए डा. Annarita लोरेंजो (पैथोलॉजी विभाग) का शुक्रिया अदा करना, और डॉ. मार्को Seandel (सर्जरी विभाग) होगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microslide Ibidi 80331
Fibronectin Millipore FC010
Plastic tubing Cole Parmer EW-96115-08
Male Luer adapter GlycoTech 31-001
Female Luer adapter GlycoTech 31-001
Syringe pump Chemyx Inc Fusion 100
Luer-lock syringe BD Biosciences 309628
M199 medium Sigma M7653
Endothelial Mitogen Biomedical Technologies BT-203
HBSS Sigma H9269
Anti-PSMA J591-488 Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta Peprotech 200-01B
Trypsin Millipore SM-2002-C
Heparin Sigma H-3149
HUVECs Weill Cornell Medical College-Department of Surgery provided by Marco Seandel
VE-Cadherin Santa Cruz sc-5648
10x objective Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent Millipore S-004-C
RPMI-1640 Lonza 12-702-F
Ficoll-paque plus GE healthcare 17-1440-02

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References

  1. Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
  2. Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
  3. Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
  4. Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  5. Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
  6. Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
  7. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
  8. Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
  9. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
  10. Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
  11. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  12. Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
  13. Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
  14. Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
  15. Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
  16. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).

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चिकित्सा अंक 87 ई selectin मेटास्टेसिस Microslides परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं PSMA प्रोस्टेट कैंसर रोलिंग वेग immunostaining HUVECs मंडलों प्रवाह
मरीजों और मानव endothelial कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्रोस्टेट परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के बीच ई selectin की मध्यस्थता मुलाकातों का निरीक्षण करने के लिए <em>इन विट्रो</em> विधि <em>में</em>
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Gakhar, G., Bander, N. H., Nanus, D. M. In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (87), e51468, doi:10.3791/51468 (2014).

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