Summary
Ons verslag beschrijft een unieke methode om te visualiseren en te analyseren CTC / EG interacties bij prostaatkanker onder fysiologische stromingscondities.
Abstract
Metastase is een proces waarin tumorcellen werpen uit de primaire tumor intravasate bloedvatensysteem en lymfestelsel daardoor toegang tot extravasatie en vormen een secundaire niche. De extravasatie van tumorcellen uit het bloedvatensysteem kan worden bestudeerd door endotheelcellen (EC) en tumorcellen verkregen uit verschillende cellijnen. Initiële studies werden uitgevoerd met statische omstandigheden, maar het is goed gedocumenteerd dat EC zich anders gedragen onder fysiologische stroomomstandigheden. Daarom worden verschillende samenstellingen stroom kamer momenteel gebruikt voor het bestuderen kankercel interacties met EC. Huidige stromingskamer assemblages bieden reproduceerbare resultaten met behulp van verschillende cellijnen of vloeistof op verschillende shear stress omstandigheden. Echter, te observeren en te bestuderen interacties met zeldzame cellen, zoals circulerende tumorcellen (CTCs), bepaalde wijzigingen moeten worden aangebracht in de conventionele stroom kamer samenstel. CTCeen zeldzame celpopulatie tussen miljoenen bloedcellen. Bijgevolg is het moeilijk om een zuivere populatie van CTCs vinden. Verontreiniging van CTCs met verschillende soorten cellen die normaal in de circulatie onvermijdelijk middels onderhavige verrijking of depletie technieken. In dit rapport beschrijven we een unieke methode om fluorescent label circulerende prostaatkankercellen en studie van hun interactie met EC in een zelf-geassembleerde stromingskamer systeem. Deze techniek kan verder worden toegepast op interacties tussen prostaat CTCs en een eiwit van belang in acht.
Introduction
Metastase is een complexe multi-step proces dat nog slecht begrepen. De E-selectin/selectin ligand as is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen bij tumor metastase bevorderen primaire bindingsinteracties tussen het vasculaire endotheel en kankercellen 1,2. Endotheliale (E)-selectine is een transmembraan eiwit door geactiveerde endotheelcellen tot expressie, terwijl de andere E-selectine ligand (en) tot expressie door tumorcellen 3. Talloze in vitro benaderingen succes toegepast model E-selectin/selectin ligand interacties tussen tumorcellen en endotheelcellen (EC) 1. Om deze interacties te bestuderen worden verschillende stromingskamer systemen worden gebruikt voor het simuleren van bloed vaatstelsel. Onder stroom kamer samenstellen wordt parallelle plaat stroming kamer (PPFC) in combinatie met EC routinematig gebruikt als een in vitro model simuleert in vivo shear stress omstandigheden. In dezemethode, EC's worden gekweekt op een 35-mm schotel en na het bereiken van een monolaag, worden EC's verbonden aan de PPFC en shear stress gebaseerde experimenten worden uitgevoerd.
Echter, PPFC en andere huidige systemen presenteren veel beperkingen aan het bestuderen lijm interacties tussen circulerende tumorcellen (CTC's) afkomstig van patiënten en EC, vooral omdat CTC zijn een zeldzame populatie van cellen, vergoten is van de primaire tumor, circuleren onder de miljoenen bloedcellen (1 CTC per 10 9 bloedcellen) 4. Vandaar dat, in tegenstelling tot onbeperkt aanbod van gekweekte cellijnen, laag CTC tellingen leiden tot zeer weinig en zeldzame CTC / EG interacties, die een goede doorstroming kanaalbreedte om de interacties voor het afspelen analyse op te nemen. Bovendien, aangezien de patiënt afgeleid CTC zijn een onzuivere bevolking, dus een identificatie marker is vereist om CTC's volgen in het bijzonder. Om dit probleem op te lossen, een nieuwe methode om prostaatkanker te identificeren (PCA) CT ontwikkelden weCs door te profiteren van het feit dat vrijwel al deze CTCs expressie prostaat-specifiek membraan antigeen (PSMA) op hun celoppervlak 5,6. In dit rapport, gebruikten we de prostaatkanker cellijn, MDA PCa2b (MDA), om het potentieel nut van ons nieuwe systeem aan prostate CTC interacties te bestuderen met EC's te tonen, uiteindelijk tot het mechanisme van metastase begrijpen.
De methodologie kan worden toegepast voor verschillende shear gebaseerde experimenten gesimuleerd in vivo vasculaire systeem 7-9. Naast onderzoeken PCa CTC / EG interacties kan de stroom kamer systeem eenvoudig worden aangepast voor het analyseren van perifeer bloed mononucleaire cellen of interacties tumorcellen met EC. Het gemak van het demonteren en monteren van de stroom kamer, een microglaasje III (0.1) (hierna aangeduid als microglaasje), laat kweken EC onder perfusie en het stimuleren van EC met verschillende cytokinen aan pr te inducerenotein expressie. Daarnaast gekweekte EC, recombinante eiwitten zoals E-en P-selectine worden aangebracht op het microscoopglaasje en interacties met tumorcellen kan worden waargenomen onder laminaire stroomomstandigheden 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweken HUVECs op microslides voor het waarnemen van CTC-endotheel interacties
- Onder de weefselkweek kap, eerste spoel de microglaasje, kanaal breedte van 1 mm met PBS. Voorzichtig jas de microscoopglaasje met 200 gl 50 ug / ml fibronectine (opgelost in PBS) met een 1-ml Luer-lock spuit.
- Bedek de microglaasje met het deksel en bewaar deze in de weefselkweek kap gedurende 30 minuten. Langzame afgifte van de vloeistof in het microscoopglaasje voorkomt belvorming in het kanaal.
- Perfuseren 200 pl warm (37 ° C) HUVEC groeimedium (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml heparine, 100 ug / ml endotheelcel groeifactor en L-glutamine) via microscoopglaasje en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de perfusie, bereiden HUVEC celsuspensie.
- Spoel HUVECs met PBS en voeg 0,05% trypsine-EDTA gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer HUVEC in 2 ml kweekmedium bij 180 xg gedurende 5 minuten.
- Meet de cel concentratie met behulp van een neubaUER hemocytometer en bereiden 10 7 HUVEC cellen/100 pi groeimedium. Verwijder dan voorzichtig het medium van de inlaat van de microglaasje gebruik van een 200-ul pipet tip.
- Breng de microglaasje op ooghoogte en met behulp van een 1-ml Luer-lock spuit voorzichtig perfuse 200 ul van bereide concentratie van HUVECs in het kanaal. Voorzichtigheid is vereist bij deze stap om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Als de bellen verschijnen, houden perfunderen voor een iets langere tijd voordat bubbels voer het afvoerkanaal.
- Plaats een gelijk volume (~ 80 pi) van HUVEC media zowel inlaat en uitlaat van de microscoopglaasje. Dit voorkomt dat de stroom van cellen in beide richtingen.
- Bedek de glijbaan en bewaar het in de incubator (37 ° C) gedurende 1,5 uur.
2. Voorbereiding van Flow Kamer Assembly for Overnight HUVEC Cultuur op een microplaatje
- Plaats een steriele 20 ml spuit, vrouwelijke en mannelijke Luer koppelingen, slangen en een injectiepomp in de incubator voor 15 kmn.
- Voor minimaal dood volume, gebruik maken van de buis met inwendige diameter van 0,04 inch. Kleinere buisdiameter voorkomt de vorming van luchtbellen.
- Vul het 20-ml spuit met warm (37 ° C) HUVEC medium (12 ml). Bevestig de slang met de connectoren op de injectiespuit. Speel de bellen. Sluit dit samenstel aan de microglaasje.
- Volledig vullen de inlaat van de microglaasje met HUVEC media. Breng de gevulde 20 ml spuit bevestigd aan de connector naast het microscoopglaasje. Zachtjes sluit de connector aan de microglaasje.
- Breng de set-up in de couveuse en sluit deze aan op de injectiepomp, vastgesteld op 10 pl / min afschuifsnelheid. Laat de cellen O / N in de incubator bij 37 ° C.
- De volgende dag, demonteer de set-up door het verwijderen van de connector verbonden aan de inlaat van de microglaasje.
- E-selectine expressie op EC upregulate, bereid vers kweekmedium dat IL-1β bij 10 ng / ml in 4 ml medium. Zuig de media in een 10-ml spuit. Verwijder thij media van de inlaat van het microscoopglaasje en de injectiespuit aansluiten op de dia.
- Stel de injectiepomp bij 10 pl / min afschuifsnelheid 4 uur in de incubator.
3. Voorbereiding van de Anti-PSMA (J591-488) gelabelde prostaatkankercellen
- Tijdens IL-1β incubatie van HUVECs, bereiden anti-PSMA J591-Alexa488 gelabelde prostaatkanker cellen. Voeg 0,05% trypsine-EDTA MDA cellen gedurende 1 minuut. Laat de cellen niet blootgesteld aan trypsine gedurende langere tijd als het kan invloed hebben op de aanwezig op het celoppervlak glycopeptiden. Enzym vrije cel dissociatie reagens kan worden gebruikt in plaats van trypsine. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer MDA cel pellet in 1 ml H / H buffer (Hanks gebalanceerde zout solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl2). Voeg anti-PSMA J591-Alexa488 antilichaam bij 20 ug / ml gedurende 30 min bij RT op een donkere plaats. Resuspendeer de cellen tijdens de incubatie.
- Na 30 min centrifugeren de cel oplossing bij 800 xg gedurende 5 minuten. Aspitarief en resuspendeer de pellet in 1 ml H / H buffer. Tel de gemerkte MDA cellen en breng de uiteindelijke concentratie 1x10 6 cellen / ml. Vul een spuit van 5 ml met J591-488 gelabelde MDA cellen en verwijder de bubbels.
4. Voorbereiding van de Anti-PSMA (J591-488) gelabelde CTC Verrijkt van prostaatkanker Patiënten
- Verzamel 7,5 ml bloed van patiënten met prostaatkanker in een blauwe dop buis (met natriumcitraat). Voorzichtig verdunnen bloed 1:01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
- Voeg 5,3 ml Ficoll-Paque plus in een 50 ml conische buis. Laag verdunde bloed bovenop de Ficoll-Paque. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 minuten.
- Grondlaag alle buizen of uiteinden in contact met CTCs met 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl2 (R / S buffer) aspecifieke binding van CTCs aan de oppervlakken te voorkomen. Handhaaf 4 ° C temperatuur van media en buffers die in contact met CTCs.
- Verzamel het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) fractiemet CTCs van de interface in een 50 ml conische buis met 30 ml R / S buffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 8 minuten.
- Resuspendeer de pellet en opnieuw wassen R / S buffer bij 400 xg gedurende 8 minuten. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in H / H buffer. Voeg anti-PSMA J591-488 antilichaam bij 20 ug / ml gedurende 30 min bij RT op een donkere plaats.
- Na 30 min gecentrifugeerd PBMC bevattende J591-488 gemerkte CTCs bij 800 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in H / H buffer. Vul een 1 ml injectiespuit (vooraf bekleed met R / S buffer) met het monster.
Voorbereiding 5. Microscoop, spuitpomp en Flow Kamer Vergadering
- Zet de omgekeerde microscoop en stel de Kohler verlichting op 10X objectief. Breng de spuitpomp op hetzelfde niveau als de monstertafel van de microscoop en zet deze op 1 dyn / cm 2 afschuifspanning (~ 10 ul / min).
- Open de Zeiss AxioVision software. Selecteer de doelstelling op het computerscherm. Maak een nieuwemap onder de optie tools in de software.
- Open de optie slimme experimenten in AxioVision en de instellingen aanpassen om de korte 30 seconden video's opnemen gedurende 30 minuten.
- Voor live-tl video, stelt u de afbeelding opties-12 msec Exposure, 2 x 2 bin, 5 Gain. Deze parameters helpen bij het bereiken van video's in de buurt van de video frame rate (~ 23 frames per seconde) met de Zeiss MRM camera.
- Om de volledige breedte van de stroom kanaal te visualiseren op 10 X doelstelling op het computerscherm, gebruik dan een C-mount adapter (0,63 xf/60 mm Interface).
- Schakel de kwiklamp.
- Plaats de spuit en de connector die de cellen op de spuitpomp.
- Breng IL-1β gestimuleerde HUVEC uit de incubator. Bevestig de zender aan de gevulde inlaatkanaal van de microglaasje met HUVECs.
- Sluit het uitlaatkanaal met de aansluiting aan de buis. Leg de slang in een schaal of 15 ml conische buis om de stroom door te verzamelen.
- Start de infusiverder door het microscoopglaasje op 10 pl / min. Let op de interacties tussen endotheliale cellen en MDA gemerkte cellen of gelabelde CTCs afkomstig van patiënten onder 488 nm-filter op de epifluorescentie microscoop.
- Start de opname het experiment als 30 sec korte video's. Tijdens het afspelen analyse, het meten van de rollende snelheid. Rolling snelheid wordt gemeten door de afstand die de cellen in de tijd te delen.
6. Immunokleuring van het microplaatje
- Verwijder het medium uit de inlaat en uitlaat van het microscoopglaasje na perfusie MDA cellen op IL-1β-gestimuleerde HUVEC gedurende 10 minuten.
- Met een 200-ul tip, zet warm (37 ° C) PBS dat calcium en magnesium in de inlaat van het microscoopglaasje gedurende 5 minuten. Kantel de microglaasje met behulp van de deksel als een prop op de bank. Houd de microglaasje in een gekantelde positie voor alle incubaties tijdens immunostaining.
- Fix HUVECs door perfunderen warme 2% formaldehyde in de inlaat
- Add triton X-100 (0,1%) in 5% BSA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Twee keer spoelen met PBS gedurende 5 minuten elk. Blok met 5% BSA in PBS gedurende 30 minuten.
- Incubeer met primair antilichaam geit anti-VE-cadherine (1:100) in 2,5% BSA O / N bij 4 ° C.
- De volgende dag, twee keer wassen met PBS gedurende 5 minuten elk. Voeg secundaire ezel anti-geit 647 antilichaam gedurende 45 minuten. Tweemaal wassen met PBS gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer bij kamertemperatuur met gehumaniseerde J591 Alexa488-geconjugeerd antilichaam gedurende 1 uur.
- Tweemaal wassen met PBS gedurende 5 minuten elk. Voeg DAPI gedurende 5 minuten. Wassen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Voeg PBS (of Mowiol voor opslag op lange termijn). Visualiseer de microglaasje onder de confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een O / N kweek van een monolaag van EC op het microscoopglaasje. De schaling in Figuur 1A toont dat 100% van het microscoopglaasje zichtbaar met 5X doelstelling bij 70% zichtbaar met een 10x objectief (Figuur 1B). Voor E-selectine gemedieerde interacties worden cellen rollen aan de randen niet als die meer dan 70% van het microscoopglaasje beschikbaar voor video-opname en weergave analyse maakt. In onze ervaring, in eerste instantie deze set-up montage moet wat oefening om de cultuur van een monolaag van EC onder shear stress. Na vaststelling EC groei op microscoopglaasje, we gelabeld MDA, prostaatkankercellen. De specificiteit van J591-488 anti-PSMA antilichaam werd getest met MDA cellen spiked gezonde donorbloed en gelabeld met fluorescent gemerkt anti-PSMA J591-488 monoklonale antilichaam. Geen PSMA immunokleuring werd waargenomen in PBMC (gegevens niet getoond). Om uit te sluiten dat de J591-488 binding en internalisatie alters rollen gedrag, we gelabeld MDA cellen met J591-488 en vergeleek de rolgedrag met ongelabelde MDA cellen op schuifspanningen variërend van 1-10 dyn / cm 2. De box plot toont de verdeling van de rollen snelheden van zowel gelabelde en J591-488-gemerkte MDA cellen op IL-1β-gestimuleerde EC bij verschillende shear stress condities. Geen significant verschil werd waargenomen in de rollende snelheden 1 en 5 dyn / cm 2, p = 0,634 en p = 0,601, respectievelijk (Figuur 2). Bij hogere afschuifspanning van 10 dyn / cm 2, werd een statistisch significant verschil waargenomen tussen de rollen snelheden van gelabelde en J591-488-gemerkte MDA cellen (p <0,05). Eerdere studies tonen aan dat bij hogere schuifspanning (> 3 dyn / cm 2) omstandigheden minder tumorcellen hechten en roll on EC vergeleken met de lagere shear stress omstandigheden 11,12. Daarom zijn studies naar interacties tussen tumorcellen en EC uitgevoerd bij lage schuifspanning. Thons, onze gegevens blijkt dat CTC met J591-488 en dat fluorescentielabelling van CTC heeft de rollende gedrag op een breed scala van shear stress geen significante invloed kan worden bestempeld. Van de nota, hebben we geen CTC / EG interacties te detecteren in de afwezigheid van IL-1β stimulatie van EC (gegevens niet getoond). Bovendien, als een proof of principle, we ook het label verrijkt CTC geïsoleerd van CRPC patiënten met J591-488 en doorbloed dan IL-1β-gestimuleerde EC. Een eenmalige gestikte video toont de verschillende wisselwerkingen tussen prostate CTCs en EC (Video 1). De video toont drie soorten interactie-stabiele hechting (CTC's niet los, zelfs na 30 sec), tethering (CTC bevestigen en weer vast), en geen interacties. Microslides kan gemakkelijk immunologisch en fluorescerende beelden kunnen worden genomen, omdat de microslides vergelijkbare optische eigenschappen als een 1,5-mm dekglaasje 7. Figuur 3 toont de stevige adhesie van J591-488 gelabelde cellen MDA after perfusie dan IL-1β-gestimuleerde EC.
Figuur 1:. Een monolaag van endotheelcellen gekweekt op het microscoopglaasje HUVEC's werden gekweekt O / N op fibronectine (50 ug / ml) bekleed microscoopglaasje III (0,1) onder schuifspanning (1 dyn / cm 2) A) op 5x doelstelling. (EG Plan Neofluar 5X/0.16), volledige stroom kanaalbreedte met gekweekte EC werd waargenomen. De breedte van het kanaal werd gemeten tot 1,545.95 um B.) Zijn op 10X objectief (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 micrometer van het kanaal werd waargenomen. Dit suggereert dat de EC kan worden gekweekt O / N op de microglaasje en 70% van de microglaasje is zichtbaar bij een vergroting van 10x. Klik hier voor een grotere weergave version van dit cijfer.
Figuur 2. Rolling snelheid van MDA cellen op EC gekweekt op het microscoopglaasje. Een miljoen gelabelde en J591-488 gemerkte MDA cellen werden geperfuseerd via IL-1β-gestimuleerde HUVEC. Tien video's bij verschillende velden op de microglaasje werden opgenomen op 1,5, en 10 dyn / cm 2. Shear stress berekeningen werden verstrekt door de fabrikant. Offline analyse voor het rollen snelheid werd uitgevoerd. n = aantal cellen geteld voor het rollen snelheidsmetingen. Boxplot toont de verdeling van de rollen snelheden en mediane verschillen tussen J591-488 gelabelde en ongelabelde MDA cellen. p <0,05, Wilcoxon rank sum test. De cirkels stellen de uitschieters. Klik hier om view een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3. Immunokleuring van MDA cellen interactie met EC op het microscoopglaasje. Een miljoen MDA cellen werden geperfuseerd via IL-1β-gestimuleerde HUVEC 1 dyn / cm 2 schuifspanning. Na perfusie werd uitgevoerd immunokleuring op microscoopglaasje. De gele pijlen tonen MDA cellen stevig gehecht aan de EC. PSMA = Rood, VE-cadherine = Groen, DAPI = Blauw. De samengevoegde afbeelding toont alle kleuren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Video 1. Een video waarin de interacties tussen IL-1β-gestimuleerde HUVECs en anti-PSMA J591-488-gelabelde CTC verrijkt uit een patiënt met prostaatkanker. A monolaag of HUVEC werd gekweekt op het microscoopglaasje III (0,1) en anti-PSMA J591-488-gelabelde perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) die CTCs verrijkt een patiënt werd geperfuseerd op HUVEC 1 dyn / cm 2. Tijdens de perfusie, werden korte 30 seconden video's opgenomen, op verschillende velden op de microglaasje. De overname tijd van de video wordt getoond op de linker onderhoek. Verschillende korte video's werden aan elkaar genaaid om deze video te compileren. Op 2:16:36, een niet-interagerende CTC gaat de linkerbovenhoek gezichtsveld; op 2:19:16, een andere niet-interactie CTC komt in de linkerhoek gezichtsveld; op 2:23:12, een stabiel gehandeld CTC in de top midden gezichtsveld wordt gezien. Op 02:38:09, wordt een stabiel gehandeld CTC te zien op de rechterkant van het gezichtsveld wordt gezien. Deze video is gemaakt met behulp van zowel bright-field en tl-kanaal naar de interacties van PBMC's tonen ook. Op 02:40:18, werden stabiel gehandeld CTC's waargenomen in de top midden gezichtsveld. Deze video is gemaakt met behulp van bright-fielden tl-kanaal naar de rolgedrag in PBMCs tonen. Van 02:51:39 door 2:51:49, werd een CTC vertonen tethering gedrag waargenomen in de bodem gezichtsveld. Klik hier om de video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege het lage aantal CTCs tussen bloedcellen, is het moeilijk om CTCs isoleren als een zuivere populatie cellen. Om CTC / EG interacties te bestuderen, de zeldzame en onzuivere bevolking van CTC brengt twee grote uitdagingen: a) identificatie van CTCs onder bloedcellen; b) Waarneming van CTC / EG interacties.
De eerste beperking identificeren prostate CTCs tussen bloedcellen overwinnen, hebben we gebruik van het feit dat vrijwel alle prostaat tumorcellen PSMA 6. Monoklonaal antilichaam J591-488 wordt geïnternaliseerd volgende celoppervlak binding suggereert dat prostaatkanker CTC ex vivo kunnen worden geëtiketteerd en bestudeerd voor CTC / EG interacties 13. Voor optimale internalisatie van het antilichaam en maximale immunofluorescentie, we MDA cellen geïncubeerd met het antilichaam op ofwel 4 ° C of 37 ° C gedurende ofwel 30 min en 1 uur. We vonden dat maximum immunofluorescentie werd waargenomen bij37 ° C gedurende 30 min (gegevens niet getoond) en immunofluorescente labeling van prostaatcellen beïnvloedde de rolgedrag tegenover ongelabelde prostaatcellen.
Om de tweede beperking te omzeilen, testten we verschillende stromingskamer assemblages zoals PPFC, BioFlux microfluidics systeem, en microslides 7. De PPFC is uitgegroeid tot een steunpilaar voor leukocyten en tumorcel interacties met EC onderzoekt onder fysiologische stromingscondities 9. Deze stroom systeem werkt goed interacties van grote aantallen cellen zoals kanker cellijnen studie, maar niet ideaal te observeren en de wisselwerking tussen zeldzame cellen zoals patiënt afgeleide CTCs en EC. CTCs, dat zeldzame cellen, kunnen interageren met EC willekeurig op elke locatie in het stromingskanaal, daarom wordt de opname van de volledige breedte van het stromingskanaal vereist om het zeldzame geval interacties tussen CTCs / EC observeren bij weergave analyseer. The breedte van de silastic pakking in de PPFC (2.5 mm) geeft geen volledig beeld onder 10x objectief. Terwijl bij een lagere vergroting dan 10X objectief, wordt het moeilijk om duidelijk te kunnen zien CTC / EG interacties. Bovendien, een klein dood volume in de verbindingsleidingen is essentieel voor het opsluiten van CTC in het verbinden van buizen te voorkomen. De silastic verbindingsbuizen voorzien standaard PPFC een breed binnendiameter (0.16 inch). Integendeel, BioFlux microfluïdische systeem biedt volledige gezichtsveld onder 20X objectief en is nuttig bij het bestuderen van afschuiving geïnduceerde veranderingen in de EC 14 echter kankercellen beginnen vestigen in de kamer putjes leidt tot niet-uniforme stroming. BioFlux microfluidics is nuttig bij het bestuderen van afschuiving geïnduceerde veranderingen in de EC, echter technisch omslachtig om te gebruiken. Onze zelf-geassembleerde stromingskamer behulp microglaasje heeft een smal kanaal breedte (1 mm) dan de standaard kanaalbreedte in PPFC, waardoor er meer observatiestionele omgeving. Ook EC's worden gekweekt onder perfusie in microglaasje simuleren fysiologische bloedstroom, in tegenstelling tot Ganguly et al.. 7, studies waar EC's worden geteeld op microslides (met bredere kanaal breedte) in statische omstandigheden. Het dode volume in de verbindingsleidingen wordt verminderd door een verbindingsbuis met binnendiameter van 0,02 inch Tezamen immunofluorescentie labeling van prostaat tumorcellen, goede doorstroming kanaalbreedte en kleinere binnendiameter van de verbindingsbuizen kan men prostaat CTCs identificeren en hun interacties waarnemen met EC.
Er zijn maar weinig kritische stappen in het protocol, echter, met de juiste zorg van de experimenten kan verlopen. Preventie van bellen is cruciaal voor elke flow-based experimenten. In onze ervaring, het gebruik van warme (37 ° C) groeimedium, connectoren, en spuit voorkomt de vorming van luchtbellen door het verlagen van de temperatuur verschillen. In addition, moet erop worden gelet, terwijl het aansluiten van de spuit met de microglaasje. Zowel de connector aan de spuit en de inlaat van het microscoopglaasje worden tot de rand gevuld daardoor voorkomen van belvorming. Een van de beperkingen van de techniek is dat aangezien het microscoopglaasje kanaal 45 x 1 mm (lengte x breedte), kan alleen vasthouden 4,5 pl groeimedium. Daarom kan microscoopglaasje niet voor statische kweek en vereist continue perfusie groeimedium verzuring voorkomen en handhaven van de juiste toevoer van voedingsstoffen voor HUVEC. Echter, continue aanvoer drager gemakkelijk worden bereikt met een injectiepomp aangesloten op de microscoopglaasje in de incubator. Terwijl het verrijken van CTCs van patiënten met prostaatkanker, moet ervoor worden gezorgd voor een pre-coat alle buizen, tips, pipetten en injectiespuiten in contact komt met CTC met R / S buffer niet-specifieke binding te voorkomen. Bovendien, alle stappen na Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt centrifugatie, eBehoudens andersluidende J591-488-antilichaam incubatie worden uitgevoerd bij 4 ° C tot de afbraak van CTCs voorkomen.
Onze techniek is uniek in vergelijking met andere methoden begrijpen CTC biologie. Het huidige rapport beschrijft levensvatbare fluorescerende immunolabeling van prostaat CTC's waarmee men rekening met de functionele kenmerken van de prostaat CTC, dan alleen de fenotypische eigenschappen. Bovendien is de beschreven methode vereist een laag volume monster / reagens dan andere methoden, waardoor het een ideaal systeem voor immunofluorescentie studies. De methode biedt een uniek platform interacties tussen prostate CTCs afkomstig van patiënten en EC bestuderen, dus, waardoor de bij de ontwikkeling van prostaatkanker metastasen mechanismen te begrijpen. Deze techniek heeft het potentieel voor meerdere toepassingen waarbij schuifstroom gebaseerde studies, zoals cel-cel interacties 8, cel-eiwit interacties 15 16, en-shear geïnduceerde veranderingen in EC 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Bander is de uitvinder van octrooien die zijn toegewezen aan Cornell Research Foundation ("CRF") voor de J591 antilichaam gebruikt in dit artikel. Dr Bander is een consultant en eigenaar van voorraad in BZL Biologics, de vennootschap die de octrooien zijn in licentie door CRF voor verder onderzoek en ontwikkeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Ministerie van Defensie-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 van het National Cancer Institute, en de Robert McCooey Genitourinary Fonds voor Onderzoek van de Oncologie. We willen graag Dr Annarita Lorenzo (Afdeling Pathologie) bedanken voor VE-cadherine antilichamen, en dr. Marco Seandel (Afdeling Heelkunde) voor het verstrekken van HUVECs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
