Summary
O nosso relatório descreve um método único para visualizar e analisar as interações CTC / CE no câncer de próstata em condições de fluxo fisiológicos.
Abstract
A metástase é um processo em que as células tumorais derramado a partir do tumor primário intravasate vascular arterial e do sistema linfático, assim, ganhar acesso ao extravasamento e formar um nicho secundário. A extravasão de células de tumor a partir do sistema vascular de sangue podem ser estudados utilizando células endoteliais (ECs) e as células tumorais obtidas a partir de diferentes linhas celulares. Os estudos iniciais foram realizados usando condições estáticas, mas tem sido bem documentado que os CEs se comportar de forma diferente sob condições de fluxo fisiológico. Portanto, diferentes conjuntos de câmara de fluxo estão sendo usados para estudar as interações de células de câncer com ECs. Montagens atuais câmara de fluxo oferecem resultados reproduzíveis, seja através de diferentes linhagens celulares ou fluidos em diferentes condições de estresse de cisalhamento. No entanto, para observar e estudar as interações com células raras, tais como células tumorais (CTCs) circulando, algumas alterações são necessárias a serem feitas para a montagem de câmara de fluxo convencional. CTCssão uma população de células raras entre os milhões de células sanguíneas. Por conseguinte, é difícil a obtenção de uma população pura do CTC. Contaminação de CTCs com diferentes tipos de células normalmente encontradas na circulação é inevitável o uso presente enriquecimento ou técnicas de depleção. No presente relatório, nós descrevemos um método único para rótulo circulando células cancerosas da próstata fluorescente e estudar as suas interacções com os ECs em um sistema de câmara de fluxo auto-montados. Esta técnica pode ser aplicada ainda para observar as interações entre CTCs próstata e qualquer proteína de interesse.
Introduction
A metástase é um processo multi-passo complexo que permanece pouco compreendido. O eixo ligando E-selectin/selectin tem mostrado desempenhar um papel importante na metástase de tumores através da promoção de interacções adesivas primárias entre o endotélio vascular e nas células cancerosas 1,2. Endotelial (E)-selectina é uma proteína transmembranar expressa por células endoteliais activadas, enquanto ligando diferente (s) de E-selectina é expressa por células de tumor 3. Numerosas abordagens in vitro têm sido utilizados com sucesso para modelar as interacções ligando E-selectin/selectin entre células tumorais e células endoteliais (ECs) 1. Para estudar essas interações, diferentes sistemas de câmara de fluxo estão sendo empregados para simular sistema vascular sanguíneo. Entre os conjuntos de câmara de fluxo, o fluxo de placas paralelas câmara (PPFC) em conjunto com ECs é rotineiramente utilizado como um modelo in vitro simulando em condições de estresse de cisalhamento in vivo. Nestemétodo, ECs são cultivadas numa placa de 35 mm e depois de atingir uma monocamada, ECs estão ligados ao PPFC e experiências baseadas tensão de cisalhamento são executados.
No entanto, PPFC e outros sistemas actuais apresentam muitas limitações para estudar as interacções adesivas entre as células tumorais (CTCs) derivadas de doentes e CEs, circula principalmente, porque CTC são uma população rara de células, verter a partir do tumor primário, que circula entre os milhões de células sanguíneas (1 CTC 10 9 por células do sangue) 4. Assim, ao contrário de oferta ilimitada de linhas de células cultivadas, baixa contagem CTC levar para muito poucos e raros interações CTC / CE, requerendo a largura do canal fluxo adequado para gravar as interações para análise de reprodução. Além disso, uma vez que pacientes CTC derivados são uma população impuro, portanto, um marcador de identificação é necessária para controlar CTC em específico. Para resolver este problema, foi desenvolvido um novo método para identificar o câncer de próstata (CaP) CTCs tirando partido do facto de que praticamente todos estes CTC expressam antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) na sua superfície celular 5,6. Neste relatório, foi utilizada a linha de células de câncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demonstrar a utilidade potencial do nosso novo sistema para estudar as interações de próstata CTC com ECs, eventualmente, para entender o mecanismo de metástases.
Nossa metodologia pode ser aplicada para vários experimentos de corte com base em simulação de sistema vivo vascular 7-9. Além de examinar as interações PCa CTC / CE, o atual sistema de câmara de fluxo pode ser facilmente adaptado para a análise de células mononucleares do sangue periférico ou células tumorais interações 'com ECs. A facilidade de desmontagem e remontagem da câmara de fluxo, um MicroSlide III (0,1) (doravante referida como MicroSlide), permite a cultura ECs sob perfusão e estimulando ECs com diferentes citocinas para induzir protein expressão. Além disso, em cultura células endoteliais, as proteínas recombinantes, tais como a L-e P-selectina podem ser revestidos na microlâmina e interacções com as células tumorais podem ser observados sob condições de escoamento laminar 10.
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Protocol
1. Cultivar HUVECs em Microslides para Interações Observing CTC-endoteliais
- Sob a capa de cultura de tecidos, primeiro lave o MicroSlide, a largura do canal de 1 mm com PBS. Suavemente revestimento a microlâmina com 200 mL de 50 ug / ml de fibronectina (dissolvida em PBS) utilizando uma seringa de 1 ml de bloqueio Luer.
- Cobrir a microlâmina com a tampa e mantê-lo dentro do capuz de cultura de tecidos durante 30 min. Distribuição lenta do líquido na microlâmina impede a formação de bolhas no canal.
- Perfundir 200 mL de água morna (37 ° C) HUVEC meio de crescimento (meio M199, 1M de HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crescimento de célula endotelial de 100 ug / ml, e L-glutamina) através da microlâmina e incubar 20 min à TA. Durante a perfusão, preparar a suspensão de células HUVEC.
- Lavar HUVECs com PBS e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA durante 1-2 minutos à temperatura ambiente. Centrífuga HUVECs em 2 ml de meio de crescimento a 180 xg durante 5 min.
- Medir a concentração de células utilizando um Neubahemocitômetro uer e preparar 10 7 HUVEC células/100 mL meio de crescimento. Em seguida, remover cuidadosamente o meio a partir da entrada da microlâmina com uma pipeta de ponta de 200 ul.
- Trazer o MicroSlide ao nível dos olhos e usando a 1 ml seringa Luer-lock, perfuse gentilmente 200 mL de concentração preparado de HUVECs para o canal. É necessário ter cuidado nesta etapa para evitar a formação de bolhas. Se as bolhas aparecem, manter perfusão por um tempo maior até que as bolhas entrar no canal de saída.
- Colocar um volume igual (~ 80 ul) de meios de HUVEC em tanto à entrada e à saída da microlâmina. Isto evita que o fluxo de células em ambas as direcções.
- Cobrir o corrediça e mantê-lo na incubadora (37 ° C) durante 1,5 horas.
2. Preparação de montagem de câmara de fluxo para Overnight Cultura HUVEC em um MicroSlide
- Coloque uma seringa estéril de 20 ml, conectores Luer femininos e masculinos, tubulação, e uma bomba de seringa na incubadora por 15 min.
- Para um volume morto mínimo, utilizar o tubo com diâmetro interno de 0,04 polegadas. Diâmetro da tubulação menor evita a formação de bolhas.
- Encher a seringa de 20 ml com água morna (37 ° C) meios de HUVEC (12 ml). Conecte o tubo com os conectores na seringa. Retirar as bolhas. Conecte este conjunto à MicroSlide.
- Terminado o preenchimento da entrada da MicroSlide com a mídia HUVEC. Traga a seringa cheia de 20 ml ligado ao conector do lado da microlâmina. Delicadamente, anexar o conector ao MicroSlide.
- Traga o set-up para a incubadora e conecte-o a bomba de seringa, fixada em 10 taxa de cisalhamento mL / min. Deixar as células S / N na incubadora a 37 ° C.
- No dia seguinte, desmontar o conjunto--se através da remoção do conector ligado à entrada da microlâmina.
- Para regular a expressão de E-selectina em células endoteliais, preparar o meio de crescimento fresco contendo IL-1β a 10 ng / ml em 4 ml de meio. Aspirar a mídia em uma seringa de 10 ml. Remover tque media a partir da entrada da microlâmina e ligar a seringa para a corrediça.
- Definir a bomba de seringa a 10 velocidade de corte ul / min durante 4 horas na incubadora.
3. Preparação de Anti-PSMA (J591-488) marcada células cancerosas da próstata
- Durante IL-1β incubação de HUVECs, preparar anti-PSMA J591-Alexa488 rotulado células APC. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA para células MDA durante 1 min. Não expor as células a tripsina para tempos mais longos, uma vez que pode afectar os glicopéptidos presente na superfície da célula. Reagente de dissociação de células livres de enzima também pode ser usado em vez de tripsina. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
- Ressuspender MDA sedimento celular em 1 ml de H / H tampão (Hanks sal equilibrada solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl2). Adicionar anticorpo anti-PSMA J591-Alexa488 a 20 ug / ml durante 30 minutos à temperatura ambiente num local escuro. Ressuspender as células durante a incubação.
- Depois de 30 minutos, centrifugar a solução de células a 800 xg durante 5 min. Aspitaxa e ressuspender o pellet em 1 ml de tampão de H / H. Contar as células MDA rotulados e trazer a concentração final de 1x10 6 células / ml. Encha uma seringa de 5 ml com J591-488 células MDA rotulados e remover as bolhas.
4. Preparação de Anti-PSMA (J591-488) marcada CTCs Enriched de CaP pacientes
- Recolha de 7,5 ml de sangue de pacientes com cancro da próstata num tubo de tampa azul (contendo citrato de sódio). Suavemente diluir 1:01 sangue em 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
- Adicionar 5,3 ml de Ficoll-Paque em mais de um tubo cónico de 50 ml. Camada diluído sangue no topo do Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 xg durante 30 min.
- Pré-revestimento de todos os tubos e pontas entram em contacto com os CTC com 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM de CaCl 2/4 mM de MgCl2 (tampão de R / S) para evitar a ligação não específica do CTC para as superfícies. Manter 4 ° C Temperatura de mídia e buffers em contacto com CTCs.
- Recolha de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) fracçãocontendo CTC a partir da interface de outro tubo cónico de 50 ml contendo 30 ml de tampão de I / S. Centrifugar a 400 xg durante 8 minutos.
- Ressuspender o sedimento e lavar novamente em tampão de R / S a 400 xg durante 8 minutos. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em tampão H / H. Adicionar anti-PSMA J591-488 de anticorpo a 20 ug / ml durante 30 minutos à temperatura ambiente num local escuro.
- Depois de 30 minutos, centrifugar os PBMC contendo J591-488 CTC rotulados a 800 xg durante 5 min. Ressuspender em tampão H / H. Encher uma seringa de 1 ml (pré-revestido com um tampão de R / S) com a amostra.
5. Preparação de microscópio, Bomba de Seringa e montagem de câmara de fluxo
- Ligue o microscópio invertido e definir a iluminação Kohler em 10X objetiva. Traga a bomba de seringa, ao mesmo nível como a fase da amostra do microscópio e ajustá-la em uma dines / cm 2 a tensão de cisalhamento (~ 10 mL / min).
- Abra o software Zeiss Axiovision. Selecione o objetivo na tela do computador. Criar um novopasta na opção ferramentas do software.
- Abra a opção experimentos inteligentes em Axiovision e ajustar as configurações para gravar 30 vídeos curtos SEC de 30 min.
- Para vídeo fluorescente ao vivo, defina as opções de imagem-12 ms exposição, 2 x 2 bin, 5 Gain. Estes parâmetros ajudar na obtenção de vídeos perto da taxa de quadros de vídeo (~ 23 quadros por segundo) com a câmera Zeiss MRM.
- Para visualizar toda a largura do canal de fluxo em 10 objetiva X na tela do computador, usar um adaptador C-mount (0,63 xf/60 mm Interface).
- Ligue a lâmpada de mercúrio.
- Colocar a seringa e o conector contendo as células sobre a bomba de seringa.
- Traga a IL-1β HUVECs estimuladas da incubadora. Ligue o conector para o canal de entrada cheia do MicroSlide contendo HUVECs.
- Conectar o canal de saída com o conector ligado ao tubo. Coloque o tubo em um prato ou 15 ml tubo cônico para coletar o fluxo através.
- Inicie o infusino meio da microlâmina a 10 ul / min. Observar as interacções entre as células endoteliais e células MDA marcados ou rotulados CTC derivadas de doentes com filtro de 488 nm sobre o microscópio de epifluorescência.
- Comece a gravar o experimento como 30 seg vídeos curtos. Durante a análise de reprodução, medir a velocidade de rolamento. Velocidade de rolamento é medida dividindo-se a distância percorrida pelas células ao longo do tempo.
6. Imunocoloração da microlâmina
- Remova a mídia da entrada e saída do MicroSlide após perfusão células MDA em IL-1β estimulada pela HUVECs por 10 min.
- Utilizando uma ponta de 200 mL, colocou quente (37 ° C) PBS contendo cálcio e magnésio para dentro da entrada da microlâmina, durante 5 min. Incline a MicroSlide usando sua tampa como um suporte no banco. Manter a microlâmina numa posição inclinada para todas as incubações durante a imunocoloração.
- Fix HUVECs irrigando quente 2% de formaldeído na entrada
- Adicionar Triton X-100 (0,1%) em 5% de BSA em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Bloco com 5% BSA em PBS durante 30 min.
- Incubar com anticorpo de cabra primário anti-VE-caderina (1:100) em BSA a 2,5% O / N a 4 ° C.
- No dia seguinte, lava-se duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Adicionar burro secundário anti-cabra 647 anticorpo por 45 min. Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada.
- Incubar à temperatura ambiente com anticorpo conjugado J591-Alexa488 humanizado durante 1 hora.
- Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Adicionar DAPI por 5 min. Lava-se com água destilada durante 5 minutos.
- Adicionar PBS (ou Mowiol para armazenamento a longo prazo). Visualize a MicroSlide sob o microscópio confocal.
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma cultura D / N de uma monocamada de células endoteliais na microlâmina. Os extrapolação da Figura 1A mostra que 100% da microlâmina é visível usando objectivo 5X, enquanto 70% é visível usando uma objectiva de 10X (Figura 1B). Para o E-selectina interacções mediadas, as células que rolam nas bordas não são considerados o que torna mais do que 70% da microlâmina disponível para gravação de vídeo e análise de reprodução. Em nossa experiência, inicialmente esta montagem de set-up precisa de um pouco de prática para a cultura de uma monocamada de células endoteliais sob tensão de cisalhamento. Depois de estabelecer o crescimento da CE sobre a MicroSlide, nós rotulado MDA, células cancerosas da próstata. A especificidade de J591-488 anticorpo anti-PSMA foi testado utilizando células MDA cravado no sangue do dador saudável e marcados com fluorescência marcado anticorpo monoclonal anti-PSMA J591-488. Não se observou imunocoloração de PSMA em PBMCs (dados não mostrados). Para descartar a possibilidade de que a ligação J591-488 e interiorização alters comportamento rolando, nós rotulados células MDA com J591-488 e comparou o comportamento de rolamento com células MDA não marcados em tensões de cisalhamento variando de 1-10 dyn / cm 2. O gráfico de caixa mostra a distribuição das velocidades de rolamento das duas células MDA não marcados e J591-488-rotulados de IL-1β estimulada pela ECs em diferentes condições de estresse de cisalhamento. Não foi observada diferença significativa nas velocidades de rolamento em 1 e 5 dines / cm 2, p = 0,634 e p = 0,601, respectivamente (Figura 2). Na maior tensão de cisalhamento de 10 dyn / cm 2, foi observada uma diferença estatisticamente significativa entre as velocidades de rolamento sem rótulo e células MDA J591-488-rotulados (p <0,05). Estudos anteriores mostram que a maior tensão de cisalhamento (> 3 dyn / cm 2) as condições, menos células tumorais aderir and roll em ECs comparação com menores condições de estresse de cisalhamento 11,12. Portanto, estudos que analisam as interações entre as células tumorais e ECs são realizados em tensões de cisalhamento mais baixas. Thnós, os nossos dados sugerem que CTC pode ser rotulado com J591-488 e que a marcação fluorescente dos CTC não afecta significativamente o comportamento de rolamento numa ampla gama de tensão de cisalhamento. É de notar, não detectamos qualquer interação CTC / CE, na ausência de IL-1β estimulação de ECs (dados não mostrados). Além disso, como uma prova de princípio, também rotulado CTCs enriquecidos isoladas de pacientes com CRPC J591-488 e perfundidos sobre IL-1β estimulada pela ECs. Um vídeo costurado em tempo mostra os diferentes tipos de interações entre próstata CTCs e ECs (Video 1). O vídeo mostra três tipos de interações estáveis adesão (CTCs não separar, mesmo depois de 30 segundos), tethering (CTCs anexar e recolocar), e sem interações. Microslides pode ser facilmente imunocoradas e imagens fluorescentes pode ser feita, porque as microslides ter características ópticas similares como um de 1,5 mm de espessura lamela 7. Figura 3 mostra a adesão firme de J591-488 marcadas células MDA réer perfusão sobre IL-1β estimulada pela ECs.
Figura 1:. Uma monocamada de células endoteliais cultivadas na microlâmina HUVECs foram cultivadas S / N em fibronectina (50 ug / ml) microlâmina revestida III (0.1) sob tensão de corte (1 dine / cm 2) A) Na objectiva 5X. (Plano CE Neofluar 5X/0.16), observou-se a largura do canal de fluxo completo com culta ECs. A largura do canal de medida foi de 1,545.95 mM. B) em 10x objectivo (Plano Neofluar 10X/0.3 Ph1), 1,065.79 mM do canal foi observada. Isto sugere que ECs podem ser cultivadas O / N no MicroSlide e 70% do MicroSlide é visível no aumento de 10x. Clique aqui para ver uma maior version desta figura.
Velocidade Figura 2. Rolamento das células MDA em ECs cultivadas no MicroSlide. Um milhão de células MDA rotulados não marcados e J591-488 foram perfundidos sobre IL-1β estimulada pela HUVECs. Dez vídeos em diferentes campos da MicroSlide foram registrados a 1,5, e 10 dyn / cm 2. Cálculos tensão de cisalhamento foram fornecidos pelo fabricante. Análise off-line para a velocidade de rolamento foi realizada. n = número de células contadas para as medições de velocidade de rolamento. Box plot mostra a distribuição das velocidades de rolamento e as diferenças de medianas entre J591-488 células MDA rotulados e não rotulados. p <0,05, teste de Wilcoxon. Os círculos representam os outliers. Clique aqui para view uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imunocoloração de células MDA interagindo com ECs na MicroSlide. Um milhão de células MDA foram perfundidos sobre IL-1β estimulada pela HUVECs em 1 dyn / cm 2 tensão de cisalhamento. Após a perfusão, a imunocoloração foi realizada na microlâmina. As setas amarelas mostram células MDA firmemente aderido à ECs. PSMA = Vermelho, VE-caderina = Verde, DAPI = Azul. A imagem mesclada mostra todas as cores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1. Um vídeo mostrando as interações entre HUVECs IL-1β estimulados e anti-PSMA CTCs J591-488-rotulados enriquecido a partir de um paciente com câncer de próstata. Uma monocamada of As HUVECs foram cultivadas na microlâmina III (0,1) e as células anti-PSMA J591-488-marcados mononucleares do sangue periférico (PBMC) contendo CTC enriquecido a partir de um paciente foi perfundido em HUVEC a 1 dine / cm 2. Durante a perfusão, 30 vídeos curtos seg foram registrados, em diferentes campos da MicroSlide. O tempo de aquisição do vídeo é mostrado no canto inferior esquerdo. Diferentes vídeos curtos foram costuradas para compilar este vídeo. Às 02:16:36, a CTC não interagindo entra no campo superior esquerdo da vista; em 02:19:16, outro CTC não interagindo entra em campo canto esquerdo de vista; em 2:23:12, um CTC estável aderiu no topo meio campo de visão é visto. No 2:38:09, um CTC de forma estável aderida é vista do lado direito do campo de visão é visto. Este vídeo foi feito usando tanto de campo claro e canal fluorescente para mostrar as interações de PBMC também. Às 02:40:18, CTCs estável aderiram foram observados no topo meio campo de visão. Este vídeo foi feito usando de campo claroe canal fluorescente para mostrar o comportamento do rolamento em PBMC. De 2:51:39 através 02:51:49, uma exibindo um comportamento tethering CTC foi observada no campo inferior de vista. Clique aqui para ver o vídeo.
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Discussion
Devido ao baixo número de CTCs entre as células do sangue, é difícil isolar CTCs como uma população pura de células. Para estudar interações CTC / CE, a população rara e impura de CTCs coloca dois desafios principais: a) Identificação de CTCs entre as células do sangue; b) Observação de interações CTC / CE.
Para superar a primeira limitação de identificar CTCs próstata entre as células do sangue, aproveitamos o fato de que praticamente todas as células tumorais da próstata expressar PSMA 6. Anticorpo monoclonal J591-488 é internalizado seguinte célula-superfície de ligação sugerindo que PCa CTCs podem ser rotulados ex vivo e estudado para interações CTC / CE 13. Para internalização óptima do anticorpo e imunofluorescência máxima, que incubadas células MDA com o anticorpo em cada 4 ° C ou 37 ° C durante 30 minutos ou 1 hora ou. Observou-se que a máxima foi observada em imunofluorescência37 ° C durante 30 minutos (dados não apresentados) e rotulagem de imunofluorescência das células da próstata não afectou o comportamento de rolamento em comparação com as células da próstata não marcados.
Para superar a segunda limitação, testamos diferentes montagens de câmara de fluxo, tais como PPFC, sistema de microfluídica BioFlux e Microslides 7. O PPFC tornou-se um dos pilares para examinar de leucócitos e de células tumorais interações com ECs em condições de fluxo fisiológicas 9. Este sistema de fluxo funciona bem para estudar as interações de grande número de células, tais como linhas celulares de cancro, mas não ideal para observar e estudar as interações entre células raras, como CTCs derivadas de pacientes e ECs. CTC, sendo as células raras, podem interagir com os CEs aleatoriamente em qualquer local no canal de fluxo, por conseguinte, a gravação de toda a largura do canal de escoamento é necessário observar e analisar as interacções entre os eventos raros CTC / ECs durante a análise de reprodução. The largura do anel de vedação de silastic utilizado no PPFC (2,5 mm) não fornece um campo de visão completo sob 10x objectivo. Enquanto que, com uma ampliação inferior objetiva de 10X, torna-se difícil de observar claramente interações CTC / CE. Além disso, o baixo volume morto nos tubos de ligação é essencial para evitar captura de CTCs nos tubos de ligação. Os tubos de ligação silásticos fornecidas com o padrão PPFC tem um diâmetro interno de largura (0,16 cm). Pelo contrário, o sistema de microfluidos BioFlux proporciona um campo de visão completo sob objectivo 20X e é útil no estudo de alterações induzidas por cisalhamento em ECs 14, no entanto, as células cancerosas começam assentar nos poços das câmaras que levam a fluxo não uniforme. Microfluidos BioFlux é útil no estudo de alterações induzidas por cisalhamento em ECs, porém, é tecnicamente complicado de usar. Nossa câmara de fluxo de auto-montagem utilizando microlâmina tem uma largura de canal estreito (1 mm) do que a largura do canal padrão em PPFC, permitindo mais observaçãoárea internacional. Além disso, ECs são cultivadas sob perfusão em MicroSlide simulando o fluxo sanguíneo fisiológico, ao contrário Ganguly 7 et al., Os estudos onde ECs são cultivadas em microslides (com largura de canal mais largo), em condições estáticas. O volume morto no interior dos tubos de ligação é reduzida por meio de um tubo de ligação com diâmetro interno de 0,02 cm Colectivamente, rotulagem de imunofluorescência de células de tumor da próstata, a largura do canal de fluxo adequada, e o diâmetro interno mais pequeno dos tubos de ligação permite identificar CTC próstata e observar suas interações com ECs.
Existem alguns passos críticos no protocolo, no entanto, com a devida atenção os experimentos podem ser executados sem problemas. Prevenção de bolhas é fundamental para todas as experiências baseadas no fluxo. Na nossa experiência, utilizando-se água morna (37 ° C), meio de crescimento, conectores, e seringa evita a formação de bolhas, reduzindo as diferenças de temperatura. Em adicion, cuidados devem ser tomados ao se conectar a seringa com a MicroSlide. Tanto o conector fixo à seringa e a entrada da microlâmina deve ser preenchido até a borda, assim, prevenir qualquer formação de espuma. Uma das limitações da técnica é que uma vez que o canal de microlâmina é 45 x 1 mm (comprimento x largura), que pode conter apenas 4,5 mL de meio de crescimento. Portanto, microlâmina não pode ser utilizado para cultura estática e requer perfusão contínua do meio de crescimento para evitar a acidificação e manutenção do fornecimento adequado de nutrientes para HUVEC. No entanto, o fornecimento contínuo de meio pode ser facilmente conseguido através de uma bomba de seringa ligado à microlâmina na incubadora. Enquanto enriquecendo CTCs de pacientes com câncer de próstata, o cuidado deve ser tomado para pré-coat todos os tubos, dicas, pipetas, seringas e em contacto com CTCs com tampão de R / S para evitar ligação não específica. Além disso, todos os passos de centrifugação de densidade de Ficoll-Paque, depois, eXCEPT J591-488 anticorpo incubação, deve ser realizada a 4 ° C para evitar a degradação do CTC.
Nossa técnica é única em comparação com diferentes métodos de compreensão da biologia CTC. O presente relatório descreve imunomarcação fluorescente viável de CTCs próstata que permite observar as características funcionais de CTCs da próstata, além de apenas as propriedades fenotípicas. Além disso, o método descrito requer um baixo volume de amostra / reagente do que outros métodos de fazer-se um sistema ideal para os estudos de imunofluorescência. Nossa metodologia proporciona uma plataforma única para estudar as interações entre CTCs próstata derivadas de pacientes e CEs, assim, ajudando a compreender os mecanismos envolvidos no desenvolvimento de metástases de câncer de próstata. Esta técnica tem o potencial para várias aplicações que envolvem estudos de fluxo de base de cisalhamento, tais como interações célula-célula 8, interações proteína-célula 15 16, e alterações induzidas por cisalhamento em ECs 14.
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Disclosures
Dr. Bander é o inventor de patentes que são atribuídos a Fundação de Pesquisa de Cornell ("CRF") para o anticorpo J591 utilizado neste artigo. Dr. Bander é consultor e possui ações em BZL Biologics, a empresa para a qual as patentes foram licenciadas pelo CRF para novas pesquisas e desenvolvimento.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Defesa, da próstata Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 do Instituto Nacional do Câncer, ea McCooey geniturinário Fundo de Investigação Oncológica Robert. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patologia) para a prestação de anticorpos VE-caderina, e Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirurgia) para a prestação de HUVECs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
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- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
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