Summary
我们描述诱导中性粒细胞肺部炎症通过挑战脂多糖雾化通过雾化，建模急性肺损伤的方法。此外，基本的手术技术对于肺隔离，气管插管和支气管肺泡灌洗也有所说明。
Abstract
急性肺损伤（ALI）是一种严重的疾病，特点是肺泡中性粒细胞，用有限的治疗方法，死亡率高。 ALI的实验模型是提高我们对疾病发病机制的认识键。脂多糖（LPS）的革兰氏阳性菌引起得出中性粒细胞炎症的气道和小鼠的肺实质。有效的肺输送诸如LPS化合物，然而，难以实现。在这里所描述的方法中，肺递送在小鼠中通过挑战气溶胶绿脓杆菌脂多糖实现。溶解的LPS气溶胶由连接到压缩空气喷雾器。小鼠暴露于LPS气溶胶在一个有机玻璃盒子的连续流动10分钟，随后2分钟调理气溶胶被中断之后。气管插管和随后的支气管肺泡灌洗，接着福尔马林灌注在下一步进行，这允许无菌的p表征ulmonary炎症。雾化脂多糖产生肺部炎症特征在于肺泡中性粒细胞，在支气管肺泡灌洗和组织学评估检测。这种技术可以被设置在一个小的费用少用具及需要最少的培训和专门知识。曝光系统因此可以常规进行在任何实验室，有潜力，以提高我们的肺病理学的理解。
Introduction
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌1细胞壁成分。挑战LPS是急性肺损伤，特点是急性嗜中性粒细胞炎症和水肿2综合征的证据充分的模式。此外，肺中性白细胞增多也是慢性阻塞性肺疾病（COPD）3，和在人类中LPS刺激的一个标志已被用于模拟COPD恶化4。因此，LPS暴露的实验模型在临床上有关和有价值的工具来理解人类的病理。
的肺递送这里描述雾化脂多糖的目标是产生在导通和呼吸道，一个中性的炎症反应，无全身参与。的LPS攻击的几种技术已如前所述。静脉内注射LPS是最常用的给药途径。虽然这种技术是方便，T他主损伤是对内皮，与肺上皮以下中性粒细胞迁移至肺二次破坏。静脉内给药也诱导全身性炎症2，它可以在动物模型复杂化的临床图像。全身性炎症是相不与气管内给药观察到。这种技术，但是，是劳动密集型的，并且需要麻醉剂以及相当训练5,6。此外，肺部沉积通过施用这条路线是依赖于呼吸7。因此，肺部沉积由所需的帧内气管施用和可变沉积在气道可以观察到麻醉深度的影响。与此相反，肺递送用气雾脂多糖需要最少的培训，并且可以容易地实现对大量的动物几乎没有或个人5,8之间不存在差异。最近的研究证实，气雾剂递送优于对于沉积的气管内的路线，并有更多的相关剂量的LPS诱导中性粒细胞炎症与这种模式8。
以前的研究已经表明，挑战气溶胶假单胞菌假单胞菌 LPS产生的气道内腔和肺实质，包括肺泡腔9,10的显着的炎症反应。炎症的特征在于嗜中性粒细胞和肺水肿的存在的优势，因此可以用来解决急性肺损伤的发病机制和增益有助于疾病病理机制的进一步了解。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物研究批准了北斯德哥尔摩动物福利伦理委员会。在实验过程中符合瑞典法律进行的。
1.生成一个LPS气溶胶
- 溶解0.5克纯化P.假单胞菌内毒素在50ml无菌盐水中以温和搅拌并验证溶解。稀释1毫升9毫升无菌盐水溶解的LPS，以1毫克/毫升的最终浓度。防止光用铝箔并储存在-20℃。
- 解冻溶解的LPS在黑暗中在室温下以及在使用之前立即混合。
- 在通风II级生物危害罩中，插入一个红色入口进入喷雾器，并通过由制造商（审查方案呈递的实验装置图1）所提供的管道连接到雾化器的加压室内空气。
注意：适当的个人防护装备，包括一个半面罩可重复使用的respirat或具有微粒过滤器，护目镜，手套和防护服应该曝光的过程中被使用。
图1：用于产生气溶胶的实验装置的示意图介绍的喷雾器的入口连接到空气供给。雾化器的出口经由15.9毫米管和空气过滤器，和空气供给第一连接至流量计在2千巴的压力被调整为5.0升/米。出口是下一个连接到有机玻璃盒子装有可拆卸盖和5毫米的孔，以防止压力积聚。
- 经由空气过滤器的雾化器的出口连接到一个质量流量计。质量流量计连接到电源供应。
- 调节空气供给到5升/分钟，压力保持在1.0-2.0巴。
- 取下质量流量计和切断气源。
- 雾化器的出口连接到15.9毫米的管道，它分叉并连接两个有机玻璃盒子的尺寸：150×163 X205毫米，配有可移动的盖子。每个框应该有一个5毫米的孔中的一侧相对的所述入口，以防止压力积聚。
- 将多达5只小鼠中的每个有机玻璃盒，并关闭盖子。
- 打开雾化器和填充插入至少4毫升LPS溶解在无菌生理盐水或车辆单独（无菌生理盐水，音量不得超过8毫升）。重新连接的入口空气供应。
- 允许气雾剂流入封闭有机玻璃盒子10分钟。持续监测动物。确保气源仍紧紧地固定在雾化器的入口。
- 切断气源。用盖子封闭，让动物保持在有机玻璃盒子2分钟。
- 打开盖子，并允许气雾剂以分散，并返回动物吨他的笼子。如果动物出现湿的，放置在一个加热垫设置为低热量的笼，以防止体温过低。
- 连续监测动物的第30分钟，此后每隔2小时，第6小时。动物应表现出中和雾化过程后正常呼吸模式和活性。
2.支气管肺泡灌洗（BAL）
- 在试验终点，深深地麻醉动物用异氟醚的效果建议您机构的兽医人员。捏后爪以检查撤退反射，以确保麻醉足够的深度来进行大手术。喷洒下来，用70％的乙醇的动物的毛皮。
- 打开用剪刀腹部，并切断主动脉抽血动物。将一块组织在腹部吸收血液。
- Follwing安乐死，用剪刀单前后下调至暴露胸部。抬起左肋通过胸骨的前尖端和使用剪刀刺穿隔膜在最腹侧点，而不切入任何肺叶。通过在前后方向上的两个切口（会议下颚下方）打开胸腔。
- 轻轻拉开使用镊子肋骨，切喉下面的气管。
- 抬起用钳子气管和通过切割连接所述瓣到胸腔的韧带，以及由脂肪和心脏组织轻轻拉动取出肺。
- 插入聚乙烯管（内径0.58毫米;外径：0.965毫米）进气管，并固定管与丝线的字符串。
- 打结的multilobe（四裂片右肺）用丝线。
- 插入23号针插入聚乙烯管，慢慢加入250μl冰冷的无菌PBS注入用1ml注射器的单叶。
- 仔细挖掘肺30次，并收集通过注射器的液体。用200微升PBS重复上述步骤（约300微升PBS应该从450微升的总注射量的单瓣恢复）。
- 置于冰上的支气管肺泡灌洗液（BALF），或立即列举BAL细胞。计数细胞与heamocytometer，使用特克溶液染色细胞11。通过细胞数与染色溶液的稀释因子和heamocytometer的计数字段内的体积乘以计算总细胞数。
- 其他地方11所描述的细胞离心细胞准备差分细胞计数。
肺组织的3福尔马林固定的组织学评估
- 取出multilobe和管理单元冻结干冰。储存在-80℃。
- 装入60毫升注射器与柱塞上的金属支座除去。填用10％福尔马林到注射器20厘米的实验台以上，较20厘米的恒定压力的高度。
- 连接23号针通过塑料管与阀来控制福尔马林的流量固定在气管60毫升注射器的。
- 吹进所述肺叶用福尔马林进行5分钟。断开针并与来自气管的聚乙烯管中取出在一起，同时拉动丝线上以关闭气管与保留在肺中的压力。
- 淹没在福尔马林的肺叶，并在4℃下固定24小时。
- 洗固定的组织3次进行至少20分钟，用70％的乙醇，和脱水二甲苯通过以下方案（每1小时）：
- 3倍70％的乙醇
- 3倍的95％乙醇
- 3×100％的乙醇
- 3倍二甲苯
- 1X（液体）石蜡
- 嵌入脱水组织中的石蜡，切成4-5微米的部分，和染色用苏木精和曙红，以允许进行组织学评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
挑战雾化P.假单胞菌内毒素通常会产生在气道管腔和肺泡空间，在早期和晚期时间点的特征在于，中性粒细胞为主的显着的炎症反应。
雾化LPS诱导肺中性粒细胞增多
C57BL / 6BY和BALB / c小鼠暴露于雾化P.铜绿假单胞菌 LPS或单独的车辆和中性粒细胞列举BALF。对C57BL暴露于与车辆产生的烟雾/ 6BY小鼠的BALF细胞总数仅是通常大约或低于200,000个细胞，并将细胞包括95-100％的单核细胞，只有很少的淋巴细胞（0.5-5％），和BALF中没有嗜中性粒细胞（ 图2A-C）。 6小时后，小鼠的挑战与雾化LPS展览支气管肺泡灌洗液中增加细胞总数，通常> 50万细胞。细胞浸润保持24小时后高。支气管肺泡灌洗液中的细胞轮廓转向APredominance中性粒细胞（80-95％）以下的LPS曝光（ 图2B和C）。
图2：肺中性白细胞增多的C57BL / 6BY小鼠攻击用1mg / ml的气雾化脂多糖的C57BL / 6BY小鼠暴露于1mg / ml的雾化P.假单胞菌 LPS或载体（盐水，白色条）单独进行10分钟。支气管肺泡灌洗（BAL）中的在6小时或24小时后进行，并且白细胞列举BAL液（BALF）。（A）的总细胞数目（TCN），（B）的嗜中性粒细胞，和（C）的单核细胞（MNC）支气管肺泡灌洗液。使用未配对t检验显著差异进行了分析。 N = 3-4，*表示P <0.05，**表示P <0.01。
支气管肺泡灌洗液中的同比增长在炎性细胞LPS-挑战BALB / c小鼠观察（ 图3A 图3B和C）。
图3：在攻击用1mg / ml的气雾化LPS BALB / c小鼠肺中性白细胞增多的BALB / c小鼠暴露于1mg / ml的雾化P.假单胞菌 LPS或载体（盐水，白色条）单独进行10分钟。支气管肺泡灌洗（BAL）中的在6小时或24小时后进行，并且白细胞列举BAL液（BALF）。（A）的总细胞数目（TCN），（B）的嗜中性粒细胞，和（C）的单核细胞（MNC）支气管肺泡灌洗液。使用未配对t检验显著差异进行了分析。 N = 3，**表示P <0.01，***表示P <0.001。
类似的炎症细胞的轮廓 ð肺中性白细胞增多观察用5毫克/毫升的LPS（ 图4A-C）的雾化和脂多糖的鼻内递送，如先前报道12,13。
图4：在攻击用5毫克/毫升的LPS气溶胶BALB / c小鼠肺中性白细胞增多的BALB / c小鼠暴露于5毫克/毫升雾化P.假单胞菌 LPS或载体（盐水，白色条）单独进行10分钟。支气管肺泡灌洗（BAL）中的24小时后进行，并且白细胞列举BAL液（BALF）。（A）的总细胞数目（TCN），（B）的嗜中性粒细胞，和（C）的单核细胞（MNC）BALF中。使用未配对t检验显著差异进行了分析。 n = 3时，***表示P <0.001。
中性粒细胞在LPS-挑战肺本地化
ontent“>嗜中性粒细胞在上皮粘膜下层观察到的，以及周围的LPS攻击小鼠（ 图5）的传导气道和血管的空间。分散中性粒细胞的实质和肺泡区域也进行检测。
图5：嗜中性粒细胞在LPS攻击小鼠肺本地化福尔马林固定肺组织的从（A）的苏木精和曙红染色的C57BL /暴露于单独车辆或（B）的 1毫克6BY只小鼠/ ml的气雾化LPS 6小时后处死或（C）24小时。箭头表示嗜中性粒细胞。律师表示200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
精矿支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞趋化因子的ATION
在LPS攻击小鼠的BALF中的总蛋白含量相比增加的小鼠暴露于盐水（ 图6）。此外，嗜中性粒细胞化学引诱物的趋化因子（CXC基序）配体（CXCL）1和CXCL2的表达在LPS攻击小鼠10（ 图7A和B）都增加。
图6：增加总蛋白质浓度在支气管肺泡灌洗液脂多糖攻击的C57BL / 6BY小鼠（BALF）在BALF中的总蛋白质含量的挑战，以1毫克/毫升雾化LPS或暴露于载体（盐水，白色条）小鼠的独显通过分光光度分析测定。使用未配对t检验显著差异进行了分析。 N = 3-4，**表示P <0.01。
图7：我ncreased CXCL1和CXCL2表达支气管肺泡灌洗液脂多糖质疑小鼠（BALF）的（A）CXCL1和（B）CXCL2小鼠BALF面临的挑战是1毫克/毫升雾化LPS表达或暴露的车辆。 （生理盐水，白条）通过ELISA单独量化。使用未配对t检验显著差异进行了分析。 N = 3。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
雾化LPS产生的气道炎症反应，在上皮粘膜下层特征在于嗜中性粒细胞，围绕传导气道，以及肺泡空格的空格。这是，与增加的总蛋白含量BALF中，表示血浆渗漏，有代表性的急性肺损伤的病理在一起。作为脂多糖诱导无菌炎症，反应是独立的适应性免疫应答的，并且有限制的相关性细菌感染。该技术可能，但是，被用于通过排除适应性免疫应答来剖析炎症机制。
虽然该方法是简单和容易地适用于不同的回答科学问题，雾化器和管道的选择是至关重要的。 LPS和所得中性白细胞增多的沉积必须具有入口，喷雾器和油管比这里所描述的其它验证。此外，如不常见鼠标ST降雨可能会显示不同的响应LPS，最佳剂量LPS应为每一株被确定。此外，用气雾LPS产生的中性粒细胞炎症是LPS诱导的鼻内递送炎症可比，由他人12,13观察到。尽管鼻内给药容易进行，该方法需要麻醉，并且可能引入微生物菌群鼻腔到肺，如鼻腔不是无菌的，并且该技术需要大量的车辆。
除了相关性急性肺损伤，该技术可以进一步发展为包括用气雾脂多糖多重挑战。该方法可因此被用于研究致病机制在COPD的慢性炎症，其与持续中性粒细胞14相关联，连同再次发生细菌感染或永久微生物定植
挑战与雾化LPS可设立一个小的费用有几家电和需要很少的培训。此外，该技术因此可常规进行大规模在任何实验室，与个人之间很少或没有变化，并因此优于肺递送的其他途径。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
亚伯拉罕鲁斯已收到来自勃林格殷格翰，阿斯利康公司研发和阿斯利康研发一个研究资助旅费补助讲师费。马格努斯北是阿斯利康公司研发的全职员工，并已获得研究经费来自阿斯利康研发。约翰·格鲁内瓦尔德和托芙伯格是由阿斯利康研发资金无关的研究项目的合作研究者。
Acknowledgments
我们要感谢克斯廷Thim（阿斯利康，瑞典隆德）贝尼塔·达尔伯格和安德斯·埃克伦德博士（Karolinska研究所，斯德哥尔摩，瑞典）以及马丁Stampfli博士（麦克马斯特大学，汉密尔顿，ON，加拿大）的熟练援助和专家的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
