Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

Published: September 3, 2014 doi: 10.3791/51474
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

Summary

علينا أن نبرهن على أساس مقايسة على microfluidics لقياس الزمني للخلايا لعبور سلسلة من التشنج ميكرون النطاق.

Abstract

نحن هنا التفاصيل تصميم وتصنيع واستخدام جهاز ميكروفلويديك لتقييم التشوه من عدد كبير من الخلايا الفردية بطريقة فعالة. عادة، يمكن الحصول على البيانات الخاصة ب ~ 10 2 الخلايا داخل تجربة 1 ساعة. يتيح برنامج تحليل الصور آليا بعد تحليل التجربة كفاءة من بيانات الصورة، مما يتيح تجهيز أن يكتمل في غضون ساعات قليلة. هندسة الجهاز لدينا هي فريدة من نوعها في أن الخلايا يجب أن تشوه من خلال سلسلة من التشنج ميكرون النطاق، وبالتالي تمكين تشوه الأولي وتعتمد على الوقت للاسترخاء من الخلايا الفردية أن يعاير. ويتجلى مدى انطباق هذا الأسلوب لاللوكيميا البشري (HL-60) الخلايا. القيادة الخلايا لتشوه من خلال التشنج ميكرون النطاق باستخدام تدفق ضغط يحركها، نلاحظ أن البرولمفوسيت البشري (HL-60) خلايا تسد حظات انقباض الأول لفترة وسيطة من 9.3 ميللي ثانية قبل الركض بسرعة أكبر من خلال انقباض لاحقالأيونات مع الوقت عبور المتوسط ​​من 4.0 ميللي ثانية في انقباض. على النقيض من ذلك، جميع العابر حمض الريتينويك المعالجة (العدلات من نوع) HL-60 خلايا تسد انقباض الأول فقط 4.3 مللي ثانية قبل الركض من خلال التشنج اللاحقة مع الوقت عبور المتوسط ​​من 3.3 ميللي ثانية. هذه الطريقة يمكن توفير نظرة ثاقبة لطبيعة اللزجة من الخلايا، وتكشف في النهاية أصول الجزيئية من هذا السلوك.

Introduction

التغييرات في شكل الخلية هي الحاسمة في السياقات البيولوجية عديدة. على سبيل المثال، كريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء تشوه من خلال الشعيرات الدموية التي تكون أصغر من قطر الخاصة بهم 1. في ورم خبيث، يجب أن تشوه الخلايا السرطانية من خلال الثغرات الضيقة الخلالي وكذلك الأوعية الدموية متعرج والشبكات اللمفاوية البذور في مواقع الثانوية 2. للتحقيق في السلوك المادي للخلايا فردية، وأجهزة ميكروفلويديك تمثل منصة مثالية التي يمكن تخصيصها لدراسة مجموعة من السلوكيات الخلية بما في ذلك قدرتهم على الهجرة من خلال الثغرات الضيقة 3 وتشوه بشكل سلبي من خلال التشنج ميكرون النطاق 3- 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) أجهزة ميكروفلويديك شفافة بصريا، مما التشوهات الخلية المراد تصور باستخدام المجهر الضوئي وتحليلها باستخدام أدوات معالجة الصور الأساسية. وعلاوة على ذلك، صفائف التشنج يمكن تعريفها بدقة، مما يتيح تحليل خلايا متعددة في وقت واحد معالإنتاجية التي تتجاوز العديد من التقنيات القائمة 10،11.

هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل لبحث التشوه الخلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك في "خلية Deformer" PDMS. الجهاز مصمم بحيث خلايا المرور عبر التشنج متتابعة. هذه الهندسة هو شائع في سياقات الفسيولوجية، مثل الشعيرات الرئوية سرير 12. لقياس التشوه خلية، وقت العبور يوفر متري مريحة أن تقاس بسهولة والوقت اللازم للخلية الفردية لعبور خلال 4،6 انقباض واحد. للحفاظ على انخفاض الضغط المستمر عبر قنوات ضيقة أثناء العبور خلية، ونحن نستخدم تدفق ضغط يحركها. ويتضمن بروتوكول لدينا تعليمات مفصلة عن تصميم الجهاز وتصنيع وتشغيل الجهاز عن طريق ضغط يحركها تدفق وإعداد وتصوير من الخلايا، وكذلك معالجة الصور لقياس الوقت للخلايا لتشويه من خلال سلسلة من التشنج. ندرجكلا التصاميم جهاز ورمز معالجة البيانات كملفات رؤية تكميلية. على عينة تمثيلية من البيانات، وتبين لنا خلية العبور مرة من خلال سلسلة من التشنج بوصفها وظيفة من عدد من التشنج passaged. تحليل الجدول الزمني للخلايا لعبور الرغم من التشنج الضيقة للجهاز ميكروفلويديك يمكن أن تكشف عن الاختلافات في التشوه مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 4،5،13. الجهاز أثبت هنا يستكشف فريد عبور الخلية من خلال سلسلة من التشنج ميكرون الحجم؛ هذا التصميم يحاكي مسار متعرج تلك التجربة الخلايا في الدورة الدموية وتمكن أيضا سبر الخصائص الفيزيائية إضافية من الخلايا مثل وقت الاسترخاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ميكروفلويديك تصميم الجهاز

ملاحظة: تصميم الجهاز لديه أربع مناطق وظيفية أساسية هي: ميناء الدخول، وتصفية خلية، مجموعة انقباض، وميناء الخروج (الشكل 1). التصميم العام يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، مع تعديلات طفيفة على الأبعاد. المقدمة هنا هي بعض التوصيات الأساسية جنبا إلى جنب مع تصميم جهاز المعلمات التي هي فعالة لمجموعة مختارة من كل من الخلايا الأولية وخلد.

  1. حدد عرض مجموعة من القنوات انقباض (الشكل 1B) أن ما يقرب من 30-50٪ من متوسط ​​قطر الخلية؛ هذا انقباض الى خلية حجم النتائج نسبة تشوه في الخلية كبير ولكن الحد الأدنى من انسداد. إعطاء نوع من الخلايا التي لم يتم اختباره سابقا، فإنه من الحكمة لتصميم مجموعة من الاعراض انقباض من ~ 30-50٪ قطر خلية للعثور على العرض الأمثل. كما هو الحال مع العديد من أنواع الأجهزة ميكروفلويديك، أكثر من 120 جهاز قوالب رئيسية يمكن منقوشة على الخطيئةغلي 4 بوصة رقاقة السيليكون، وتمكين مجموعة من التصاميم المختلفة لجهاز تكون ملفقة في عملية تلفيق واحدة.
  2. حدد ارتفاع قناة أن تكون على الأقل 50٪ من قطر الخلية؛ وهذا يضمن يقتصر الخلية في 2 أبعاد. لمنع انهيار قناة خلال الترابط، تأكد من أن نسبة الارتفاع القناة لا يقل عن 1:10 (الطول: العرض) في جميع أنحاء الجهاز. للقنوات التي يجب أن تتجاوز هذه النسبة الجانب، إضافة وظائف الدعم لمنع الانهيار. وظائف الدعم الفضاء على مسافة التي هي على الأقل ضعف قطرها خلية حتى لا تعيق تدفق الخلية.
  3. تشمل مرشح في موانئ الدخول إلى إزالة الحطام وتفصيل مجموعات الخلايا (الشكل 1B). ضبط حجم وتباعد من المشاركات مرشح بحيث تكون المسافة التي تفصل المشاركات التي تساوي تقريبا قطرها خلية واحدة.
    ملاحظة: يتم تعيين الحد الأدنى من حجم الميزة من خلال القرار الذي تتم طباعة قناع الطباعة الحجرية. التأكد من أن جميع الميزات ضمن الدقةالحد olution التي يحددها المورد قناع.

2. اللوازم وإعداد

ملاحظة: قبل البدء في أي تجربة، يجب أن يكون مستعدا العناصر التالية. ويرد التخطيطي من الإعداد بأكمله في الشكل 1.

  1. افتعال سيد الجهاز باستخدام التقنيات القياسية لمتناهي الصغر معدني 14،15. تحقق من ارتفاع ملامح نمط باستخدام profilometer.
    ملاحظة: في حين يمكن أن تكون ملفقة الماجستير بسهولة في منشأة غرف الأبحاث، وضعت بعض معامل الطباعة الحجرية طرق غير مكلفة للاستخدام في بيئة شبه نظيفة 16،17.
  2. إعداد مصدر الهواء لتدفق ضغط يحركها، وذلك باستخدام خزان الهواء المضغوط وتسلسل المنظمين الهواء وحديد التسليح (الشكل 1A).
    1. انشاء خزان العرض الجوي ومنظم اليدوي.
      ملاحظة: تكوين 5٪ CO 2 في الهواء يحافظ على بيئة مماثلة نموذجية ثقافة الخلية incubatoص، ولكن مخاليط الغاز أخرى يمكن أن تستخدم أيضا.
    2. إنشاء منظم الضغط التي تسيطر عليها الكترونيا تماشيا مع المنظم اليدوي. استخدام محول الكهربائية الهوائية لتنظيم والحفاظ على انخفاض الضغط مستقر عبر القنوات، مع تقلبات ضغط أقل من 2 كيلو باسكال. استخدام رمز بسيط مكتوب في ابفيف (معلومات تكميلية) لإدخال الضغط المطلوب.
      ملاحظة: تحويل الكهربائية الهوائية يستخدم حلقة ردود الفعل الداخلية لضبط ضغط صمام مأخذ لتتناسب مع ضغط محدد عبر الجهاز ميكروفلويديك.
    3. انشاء غرفة الضغط لدفع تدفق تعليق خلية. تجميع الغرفة تعليق خلية من تدفق قياسي عداد الكريات أنبوب وقبعة تشكيله أن يخلق ختم ضغط محكم على أنبوب.
      ملاحظة: سقف غرفة الضغط يحتوي على اثنين من فتحات: والذي يربط مدخل إلى خزان الهواء المضغوط، ومنفذا من خلالها تدفق الخلايا من غرفة الضغط في الجهاز (شملت رقمه 2).
  3. انشاء مجهر مقلوب مزودة بكاميرا يحتوي على نسبة الاستحواذ على ما لا يقل عن 100 لقطة في الثانية لالتقاط الصور من الخلايا التي تتدفق من خلال مجموعة انقباض. واجهة الكاميرا مع بطاقة التقاط الفيديو والكمبيوتر.
  4. إعداد محلول المخزون السطحي 10٪ ث / ث بلورونيك F-127 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة كمية صغيرة من F127 إلى الحل سائل الإعلام خلية سوف تساعد على تقليل التصاق الخلية إلى جدران PDMS. لإعداد حل F127، دوامة والحرارة بلطف عند 37 درجة مئوية لإذابة F127. قبل الاستخدام، وتمرير حل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. إعداد الحل السطحي مقدما كما vortexing لوتصفية سيولد الفقاعات التي سوف تستمر لأكثر من 24 ساعة.

3. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. كتلة افتعال PDMS مع قنوات ميكروفلويديك.
    1. مزيج PDMS بدقة ونسبة تا 1:10 (ث / ث) وكيل المعالجة إلى القاعدة.
    2. صب الخليط فوق سيد جهاز (الخطوة 2.1). ديغا في جرة الجرس مع فراغ التطبيقية حتى تختفي فقاعات شرك، أو لمدة 10-20 دقيقة.
      ملاحظة: بعد هذا الوقت، قد يكون هناك فقاعات لا يزال في واجهة الهواء PDMS، وهو أمر طبيعي؛ هذه سوف تتبدد عادة خلال الخبز. هو الأكثر أهمية لضمان عدم وجود فقاعات المتبقية المجاورة للقنوات.
    3. خبز الجهاز نزع الغاز عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعة. لمنع القنوات من الانهيار، خبز الجهاز بين عشية وضحاها لمواصلة تشعبي PDMS لجهاز مع أعلى معامل المرونة التي هي أكثر مقاومة للقناة الانهيار. ومع ذلك، علما بأن تمديد الخبز embrittles أيضا PDMS وربما يؤدي إلى تكسير عند اللكم ثقوب (الخطوة 3.3).
  2. إزالة الأجهزة ميكروفلويديك من القالب الرئيسي. قطع الأجهزة ميكروفلويديك الفردية خارج الكتلة PDMS بشفرة حلاقة وإزالة الجهاز من الصاريإيه. تبدأ من خلال رفع بلطف من زاوية واحدة من الجهاز. تقشير لطيف وبطيء، في مقابل رفع كتلة PDMS على التوالي، ويقلل من الإجهاد على كل من PDMS وسيد.
  3. لكمة ثقوب في الجهاز PDMS لخلق منافذ اتصال للوصول بين أنابيب وmicrochannels. خلق الثقوب باستخدام لكمة خزعة، ولكمة من الجانب من خلال قناة الى الجانب الخارجي للجهاز.
    ملاحظة: لكمة خزعة مع 0.75 مم حجم ثقب الثقوب التي تخلق واجهة تماما مع polyetheretherketone (نظرة خاطفة) أنابيب (القطر الخارجي = 1/32 "أو 0.79 ملم) أو أنابيب البولي إيثيلين (PE-20، القطر الخارجي = 0.043" مم أو 1.09 ). استخدام ضوء حلقة للمساعدة في تصور ثقوب في الأجهزة مع قنوات ضحلة 18. تأكد من أن لكمة خزعة حادة. بعد تكرار استخدام يبلد طليعة ويجب التخلص من لكمة خزعة واستبدالها.
  4. شطف الجهاز PDMS مع الأيزوبروبانول (HPLC الصف) لإزالة الغبار وقدمت قطعا من PDMS. تأكد من أنثقبا واضحة من الحطام عن طريق توجيه دفق مستمر من الأيزوبروبانول النقي من زجاجة ضغط من خلال الثقوب. ضربة الجافة مع الهواء تصفيتها. بعد التنظيف، ومكان كتل PDMS مع قنوات مكشوفة في طبق بيتري نظيفة للحفاظ على نظافة الجهاز. إذا لزم الأمر، وأجهزة تخزين هذا النموذج حتى في الترابط.
  5. تنظيف الركيزة الزجاج من قبل الشطف مع الميثانول (HPLC الصف)، ضربة الجافة مع الهواء تصفيتها، ووضع على 200 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة موقد لضمان زجاج نظيف وجاف تماما قبل العلاج البلازما.
    ملاحظة: الركيزة الزجاج تشكل الجزء السفلي من كل قناة. عادة شريحة زجاجية يكفي، لأن الهدف 10X 20X أو مثالية لتصوير قنوات متعددة في نفس الوقت. للدقة أعلى والتصوير، والسندات الجهاز إلى ساترة (# 1.5 سمك).
  6. السندات الجهاز PDMS إلى الركيزة الزجاج.
    1. الأكسجين البلازما علاج الجانب القناة من كتلة PDMS و1 جانب شريحة زجاجية.
      ملاحظة: Wإيث وحدة التفريغ باليد، استخدم وقت العلاج من 1 دقيقة، ولكن تحسين وقت العلاج لكل جهاز البلازما الأكسجين.
    2. وضع الجانب القناة من PDMS على رأس الجانب المعالج من الزجاج مباشرة بعد العلاج.
    3. عقد معا مع الضغط الخفيف ل~ 10 ثانية لتعزيز الترابط. خبز الجهاز بأكمله في درجة حرارة مرتفعة (60-80 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة على الأقل لتحسين قوة السندات.

4. التشويه الخلايا من خلال قنوات ضيقة

  1. فحص الجهاز ميكروفلويديك تحت المجهر. ضمان أن القنوات لا انهار أو مكسورة وأن كلا من مدخل ومخرج الثقوب تربط مباشرة في قنوات الجهاز باستخدام هدفا الطاقة المنخفضة (10X). تعيين الأجهزة المعيبة بتسجيله سطح PDMS بشفرة حلاقة وعدم استخدامها لإجراء التجارب.
  2. تحضير عينات ثقافة الخلية إلى أن يعاير. خلايا ثقافة استخدام الظروف القياسية.
    1. Fأو المثال، والثقافة HL-60 الخلايا في المتوسط ​​RPMI-1640 تستكمل مع 1٪ من محلول البنسلين والستربتومايسين 10٪ مصل بقري جنيني في 5٪ CO 2 الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
    2. لخلايا ملتصقة، حصادها من قبل trypsinization و resuspend في متوسطة النمو الطازجة. استخدام بروتوكول trypsinization القياسية. على سبيل المثال، إضافة ~ 0.5 مل التربسين إلى قارورة مع 25 سم 2 منطقة ثقافة، و resuspend في ~ 30 مل متوسطة جديدة. التفريق HL-60 خلايا في الخلايا العدلة من نوع من جميع العابر الريتينول (ATRA) بتركيز نهائي من 5 ميكرومتر في 1 × 10 5 خلية / مل كما هو موضح سابقا 19،20.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق، ونضح بعناية الخلايا طاف و resuspend إلى كثافة النهائية المناسبة في مستنبت الطازجة بنسبة 0.1٪ V / V F-127.
  3. عد الخلايا باستخدام عداد كولتر، عدادة الكريات، أو تدفق عداد الكريات. ضبط خلية إلى تعليق كثافة من 1 × 06-5 أكتوبر × 10 ملاحظة: قد تحتاج كثافة الخلية وتركيز السطحي إلى تعديل تبعا للنظم خلايا معينة؛ يوفر الجدول 1 سجل التركيزات المستخدمة سابقا من الخلايا وF-127 لأنواع مختلفة من الخلايا.
  4. ضع تعليق الخلية في أنبوب تدفق عداد الكريات والاتصال غطاء الضغط. قبل توصيل الأنابيب إلى الجهاز ميكروفلويديك، وضبط الضغط إلى حوالي 14-21 كيلو باسكال ومطاردة حتى يخرج تعليق خلية من طرف الأنبوب. هذا سوف يساعد على تقليل فقاعات الهواء في الأنبوب والجهاز.
  5. إدراج غيض من الأنابيب التي تحتوي على تعليق خلية في مدخل الجهاز. إذا تم المستعبدين الجهاز إلى ساترة، ضع الجهاز على سطح صلب مسطح مثل المسرح المجهر قبل توصيل الأنابيب. ساترة هشة وربما كسر خلاف ذلك.
  6. اضافة الى وجود قطعة من الأنابيب كثافة العملياتس ميناء الخروج والطريق عليه في أنبوب فارغ لجمع النفايات مثل أنبوب فارغ الصقر مسجلة إلى جانب المسرح المجهر. من أجل التناسق في المقاومة الموائعية العام للجهاز بين التجارب، تأكد من أن مدخل ومخرج الأنابيب هو من نفس القطر وتقريبا نفس طول لكل تجربة.
  7. المنحدر بلطف الضغط إلى حوالي 28 كيلو باسكال أو حتى تتدفق الخلايا من خلال القنوات. وضع الجهاز بحيث قنوات متعددة تقع في مجال الرؤية وتكون متعامدة على الجزء السفلي من الشاشة. إذا الكاميرا محدودة بسبب حجم البيانات، والحصول على العديد من أشرطة الفيديو لتوليد عدد كاف من نقاط البيانات المستقلة. ضبط معدل الإطار وضرورية لإخراج البيانات المطلوبة. لالتقاط التغيرات في شكل الخلية، استخدم التصوير عالية السرعة 300 لقطة في الثانية (FPS). لقياس أوقات الترانزيت من الخلايا، استخدام معدلات الإطار من حوالي 100 إطارا في الثانية.

تحليل البيانات 5.

  1. فتح ملف ماستer_script.m (الملف التكميلي للتحميل) وتشغيل البرنامج.
  2. حدد أول فيديو ليتم تحليلها من مستكشف Windows النافذة التي تظهر. تحديد معدل الإطار للفيديو مختارة واضغط مفتاح الإدخال.
    ملاحظة: سوف يظهر الرقم الذي يطالب المستخدم لتحديد نافذة مستطيلة الاقتصاص للفيديو الأول.
  3. تحديد الإطار الذي يشمل جميع القنوات من اليسار إلى اليمين ويتقاطع القنوات فقط فوق مبة الأولى من مجموعة من القنوات في أعلى وأسفل (الشكل 3).
  4. تحديد المناطق انقباض من الصورة التي تم اقتصاصها. إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على مسافة ثابتة بكسل بين أعلى وأسفل نافذة الحدود لكل الفيديو المحدد.
    ملاحظة: تحدد الإطار العلوي حافة انقباض العلوي والسفلي حافة نافذة تحدد bottommost انقباض (الشكل 4)؛ ويقترب من هذا التشنج وسيطة إدخال المستخدم. التالي، تعرض خوارزمية لياليegmentation الخلايا للإطارات 50 الأولى من كل فيديو (الشكل 5).
  5. مراقبة الصورة اليسرى العليا (الشكل 5A) عن كثب لتحديد ما إذا الخوارزمية هي تحديد مكان الخلايا بدقة. تم فرضه صورة binarized على مصدر الفيديو لإظهار مكان الخلايا التي تم تحديدها.
    ملاحظة: نوافذ مختلفة، (الأرقام 5B-5D) هي لكود التشخيص وتظهر إطارات الفيديو بعد عمليات معالجة الصور المحددة.
  6. حدد مقطع الفيديو التالي لتتم معالجتها من نافذة مستكشف Windows.
    ملاحظة: الخوارزمية وكرر الخطوات من 5،2-5،5 لكل الفيديو المحدد.
  7. حدد إلغاء مرة واحدة تم إضافة جميع مقاطع الفيديو المرجوة من خلال نافذة ويندوز إكسبلورر لإرشاد وظيفة أن قائمة الفيديو كاملة.
    ملاحظة: سوف الخوارزمية تنفيذ العمليات المتبقية دون تدخل المستخدم. وهذا سوف يستغرق حوالي 1-2 ساعة اعتمادا على عدد من أشرطة الفيديو معالجتها والمؤسسة العامة الكمبيوترrformance. عند الانتهاء، سوف تنتج خوارزمية الرسم البياني للبيانات وقت العبور وحفظ البيانات في الدليل كملف حصيرة MATLAB وملف .xls مايكروسوفت إكسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتحقيق في أنواع مختلفة من التشوه الخلايا، وخلايا سرطان الدم النخاعي الإنسان (HL-60)، خلايا العدلات متباينة، والخلايا اللمفاوية الماوس، والمبيض خطوط الخلايا السرطانية البشرية (OVCAR8، HEYA8) يتم تقييمها باستخدام تقنية على "خلية Deformer" ميكروفلويديك. نتائج ممثلة للمرة عبور HL-60 خلايا HL-60 والعدلات من نوع تظهر الزمني للخلية واحدة إلى المرور عبر سلسلة من التشنج، كما هو مبين في الشكل 6. يقاس وقت العبور للسكان من الخلايا الفردية في كل انقباض 7 ميكرون في سلسلة من 7 التشنج عند ضغط 28 كيلو باسكال الدافعة لل(الشكل 6).

كما هو مبين في الشكل (6)، HL-60 خلايا انسداد مؤقتا انقباض الأول لفترة وسيطة من 9.3 ميللي ثانية قبل الركض من خلال التشنج اللاحقة. على النقيض من ذلك، العدلات من نوع HL-60 خلايا تسد انقباض الأول فقط 4.3 مللي ثانية قبلالركض. على وقت العبور أقصر من الخلايا HL-60 يتسق مع انخفاض معاملات الرجوعية المرنة والتي لزجة، على النحو الذي يحدده مجهر القوة الذرية 21 و 22 micropipette الطموح. هذه النتائج تتفق أيضا مع انخفاض مستويات البروتين mechanoregulating، امين، التي تحدد أوقات الترانزيت من خلال خلايا ميكرون على نطاق الفجوات 23. مرة واحدة من خلال انقباض الأول، خلايا عبور بسرعة أكبر من خلال التشنج المتبقية، 2-7، مع الوقت عبور المتوسط ​​من 4.0 ميللي ثانية للخلايا HL-60 و 3.3 ميللي ثانية للخلايا العدلات من نوع (الشكل 6). بينما الخلايا HL-60 لا تزال تظهر أطول قليلا ولكن أوقات عبور هامة (C2-C7، ص = 1.7E-9)، وتوزيع أوقات العبور للالتشنج 2-7 متطابقة تقريبا لكل نوع من الخلايا. مراقبة على وقت العبور أطول اللازمة لانقباض الأول قد يعكس أن الخلايا اللزجة لا الاسترخاء تماما الأولي شكل سن هذه الجداول الزمنية ~ ميللي ثانية. ويمكن أيضا أن يفسر هذا السلوك حسب التغيرات الهيكلية التي لا رجعة فيها تطوير داخل الخلية، وتسهيل مرورهم من خلال اللاحقة الثغرات ميكرون النطاق. الأهم من ذلك، من خلال مقارنة زمن العبور بين سكان الخلية، حتى بالنسبة للانقباض الأول، يمكن أن تكشف عن الاختلافات في 23 من التشوه.

الشكل 1
الرقم 1. توضيح تخطيطي من الإعداد التجريبية. . جهاز A. "خلية Deformer 'في الإعداد التجريبية تظهر الاتصالات الطرفية B. تصميم الجهاز يحتوي 4 مناطق وظيفية: ميناء الدخول، وتصفية خلية، مجموعة انقباض، ومنفذ الخروج. بنية الجهاز ميكروفلويديك تظهر معالمه الرئيسية؛ أقحم يظهر صورة الخفيفة تنتقل من القنوات مقيدة. الحجم، 10 μ ؛ م.

الشكل 2
الشكل 2. الرسومات الهندسية للقبعة مخصصة للضغط على وسائل الإعلام خلية الواردة في تدفق عداد الكريات الأنبوب.

الرقم 3
الرقم 3. مظاهرة لكيفية تحديد المنطقة التي تهم إطار الفيديو الاقتصاص.

الرقم 4
الرقم 4. مظاهرة من كيفية اختيار المواقع انقباض.

51474fig5highres.jpg "العرض =" 500 "/>
شخصية نافذة مراقبة 5. تستخدم للتحقق من أن يحدد بشكل صحيح خوارزمية المواقع خلية لأنها معالجة من خلال مجموعة انقباض. تم فرضه A. Binarized الصورة على مصدر الفيديو لإظهار مكان الخلايا B. صورة الفرق؛ C. قبعة أسفل صورة تصفيتها، D. الوسيط تصفيتها.

الرقم 6
الرقم 6. ممثل القياسات الوقت العبور بوصفها وظيفة من عدد انقباض. A. HL-60 خلايا تظهر وقتا أطول المرور عبر انقباض الأول من B. ATRA المعاملة HL-60 (العدلات من نوع) الخلايا. مقارنة بين مرور الوقت تحولت (LOG10) من خلال انقباض الأول وتقييمها باستخدام اختبار اللامعلمية مان ويتني تكشفالفرق كبير، ع = 1.47E-5. عادة خلايا المرور عبر انقباض الأول ببطء أكثر من التشنج اللاحقة. تظهر البيانات هنا لخلايا تمر عبر 7 التشنج واسعة ميكرون عند ضغط 28 كيلو باسكال الدافعة لل. تعطى كثافة الخلية، يعني خلية قطر، وتركيز السطحي في الجدول 1 HL-60، N = 77؛ ATRA المعاملة HL-60، تم تكرار N = 97. النتائج في تجارب مستقلة على مدار 3 أيام مختلفة.

الرقم 7
الرقم 7. نظرة عامة على السيناريو MATLAB لقياس الوقت العبور. الحلقة الأولى تتطلب تدخل المستخدم والمراقبة للإطارات 50 الأولى لكل الفيديو. بعد الحلقة الأولى، سيتم تشغيل البرنامج بأكمله دون تدخل المستخدم ويجمع البيانات السكانية والمؤامرات تلقائيا.

البريد الحدود = "0" بطانة الخلايا = "0" CELLSPACING = "0" العرض = "582"> نوع من الخلايا الطول قناة (ميكرومتر) انقباض قناة (ميكرومتر) يعني خلية قطر (ميكرومتر) تركيز خلية (خلية / مل) تركيز بالسطح (المجلد٪) HL-60 10.2 5، 7، 9 14 ~ 1 × 10 6 F127: 0.1 العدلات من نوع HL-60 10.2 5، 7، 9 14 ~ 1 × 10 6 F127: 0.1 س؛ "> OVCAR8 10.2 7 و 9 16 ~ 5 × 10 6 F127: 0.1 HEYA8 10.2 7 و 9 17 ~ 5 × 10 6 F127: 0.1 الماوس اللمفاويات 5.5 3، 5 8 ~ 3 × 10 6 F127: 0.33

الجدول 1. درس سابقا أنظمة الخلايا وظروف التشغيل الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا توفير إجراء تجريبي شامل لتحليل تشوه الخلايا تمر عبر قنوات ميكروفلويديك مقيدة باستخدام تدفق ضغط يحركها. وهناك سيناريو MATLAB يمكن معالجة البيانات الآلي (المواد التكميلية). يتم الاحتفاظ نسخة محدثة من قانون ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). على نطاق أوسع، والتقنيات المعروضة هنا يمكن تكييفها في العديد من المقايسات خلية مقرها ميكروفلويديك، بما في ذلك أثر هيكل الخلية وكلاء تشنج 24،23 النووي وكذلك معايرة والتشوه من أنواع الخلايا السرطانية 4،5. جنبا إلى جنب مع دقة أعلى المجهري لصورة تشوهات التحت خلوية، وهذه الطريقة طريقة فعالة لدراسة الخلايا الخواص الميكانيكية والتغييرات التي تحدث في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

خلية التلقائي تجهيز خوارزمية

"jove_content"> الأفلام المكتسبة يمكن تحليلها مع تدخل المستخدم يستخدم القليل النصي MATLAB. ويرد الخوارزمية في الشكل 7، ويتم توفير مجموعة من الوظائف MATLAB في المعلومات التكميلية. وباختصار، فإن تعليمات للمستخدم لتحديد كافة أشرطة الفيديو لتحليل. كل المحاصيل الفيديو لمنطقة المصالح؛ وتحديد معدل الإطار لمجموعة من أشرطة الفيديو. بعد ذلك، يقوم البرنامج تلقائيا بمعالجة البيانات والفيديو لتحديد وقت عبور كل خلية لكل انقباض. هناك متطلبات معينة للبرنامج النصي للعمل: خلايا ينبغي أن تتدفق من أعلى الإطار إلى الجزء السفلي من الإطار في الفيديو؛ موقف الجهاز ميكروفلويديك وظروف الإضاءة يجب أن لا تغيير ملحوظ خلال مدة الفيديو؛ وينبغي أن يكون الفيديو في شكل افي. الأهم من ذلك، تتضمن خوارزمية تتبع الخلايا أن كلا من الدخول والمرور في الإطار الزمني لتسجيل فيديو واحد، وهو ما يقرب من 8 ثانية. وبالتالي، فإن أييتم استبعاد الكائنات التي لديها وقتا أطول العبور من التحليل. عن طريق أداء الطرح الخلفية، تتم إزالة الكائنات التي هي موجودة في جميع أنحاء الفيديو بأكمله من التحليل. كما تنفذ رمز انخفاض قطع حجم، والتي قد يتم تعيين من قبل المستخدم. كان حجم قطع لتحليل الفيديو 5 بكسل، أي ما يعادل قطرها 2.7 ميكرون خلية.

منذ الملفات بيانات الفيديو عالية السرعة يمكن أن يكون كبير (~ 500 MB)، هذا البرنامج هو الحسابية مكثفة. كود تشغيل أكثر كفاءة باستخدام جهاز كمبيوتر سطح المكتب مع لا يقل عن 6 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي وشرائح 64 بت إما مع القرص الصلب المحلي بسعة 1 تيرابايت على الأقل أو ربطه مع محرك أقراص صلب خارجي كبير أو خدمة البيانات مع USB 3.0 و FireWire أو اتصال إيثرنت. البيانات هو الإخراج في شكل الرسم البياني لتصور سريع النتائج؛ وجدولتها كما أنها البيانات التي يتم تخزينها في (حصيرة) ملف بيانات MATLAB وجداول البيانات إكسل.

التعليمات البرمجية التي يتم العلاقات العامةيوفر esented طريقة بسيطة للمقارنة بين السكان الخلية من خلال تحليل الوقت عبور للخلايا إلى المرور عبر كل انقباض. لتحليل أكثر تفصيلا، يمكن تمديدها رمز للتحقيق المعايير الأخرى بما في ذلك حجم الخلية، نسبة الارتفاع، وكذلك الاسترخاء مقياس الوقت. تكشف الدراسات السابقة فقط الاعتماد ضعف حجم الخلية في الوقت المحدد عبور 6.

مطبات المتعلقة جهاز

قنوات المغطي هي عقبة رئيسية في أي تجربة التدفق. سوف التصاق الخلية إلى جدران يضعف جهاز تدفق الخلايا من خلال قنوات ضيقة: يمكن ملاحظة الخلايا لتشويه على طول جدران القناة. لمنع التصاق، والمعالجة السطحية المناسبة مع F-127 أمر ضروري.

خصائص سطح PDMS التغيير مع مرور الوقت بعد العلاج البلازما، مما يجعل PDMS ماء مؤقتا 25،26. على مدى أسبوع واحد، PDMS الأسطح المائية دي ببطءتوليد الطاقة على سطح مسعور الطبيعية لها؛ هذا يمكن الطعن في إزالة فقاعات الهواء من خلال القنوات. وبالتالي يجب أن تستخدم الأجهزة خلال سبعة أيام من العلاج البلازما. الأهم من ذلك، يجب أن يكون الوقت بين العلاج البلازما والفحص التشوه متناسقة عبر جميع التجارب.

ولئن كنا قد تميز بنجاح أوقات الترانزيت بين أنواع الخلايا متميزة باستخدام الأجهزة ملفقة مع أرضية زجاجية وثلاثة جدران PDMS والأجهزة يمكن أيضا أن تكون ملفقة بحيث يصبح لديهم خصائص سطح موحدة على جميع الجدران الأربعة 27 قناة. الجهاز PDMS يمكن المستعبدين إلى الركيزة الزجاج spincoated بطبقة رقيقة PDMS: مزيج علاج وكيل لقاعدة في نسبة 1: 5 (ث / ث)، صب القالب على الجهاز، وعلاج لمدة 20 دقيقة في 65 ° C . وفي الوقت نفسه، spincoat طبقة رقيقة من 01:20 (ث / ث) وكيل المعالجة لقاعدة على الركيزة الزجاج؛ تخبز في 85 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. وضع الجهاز PDMS على الشريحة المغلفة PDMS، والانتهاء من الخبز بين عشية وضحاهالاستكمال الربط. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة إذا كان جهاز البلازما لالزجاج PDMS الترابط غير متوفرة.

المزالق المرتبطة الخلية.

الدجاجة إعداد تعليق خلية، وكثافة الخلايا أمر بالغ الأهمية: إذا كانت كثافة الخلية منخفضة جدا، وسوف يكون خلية الأحداث عبور نادرة. إذا كانت كثافة الخلية مرتفعة جدا، وسوف تكون هناك عدة خلايا الركض قناة واحدة في وقت واحد، فإن هبوط الضغط عبر خلية واحدة لا تكون متسقة، وسيكون من الصعب لتحديد الخلايا الفردية مع برنامج نصي الآلي.

بينما يتم عادة إجراء التجارب في غضون 30 دقيقة من الايقاف الخلية التي يجري إعدادها، يمكن خلايا تستقر في قاع غرفة الضغط على مرات أطول من> 30 دقيقة. لتجنب تسوية على مدى فترات زمنية أطول، وغرفة الضغط وربط الأنابيب يمكن أن تكون استدارة بشكل دوري. للتجارب أطول، يمكن إضافة شريط مغناطيسي صغير لمليرة لبنانية تعليق، مع لوحة ضجة وضعه تحت ضغط غرفة للتحريض الخلايا ومنع تصفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن نعترف لويد اونغ لإدخال بناء في الإصدارات الأولى من هذه التقنية، والدكتور جيريمي Agresti لغطاء الضغط نصائح التصميم، والدكتور دونغبينغ تشى لمساعدته في افتعال غطاء الضغط. نحن ممتنون للمختبرات M. Teitell وP. Gunaratne لتوفير مجموعة متنوعة من العينات خلية للاختبار. نحن ممتنون لمؤسسة العلوم الوطنية (التوظيف جائزة DBI-1254185)، ومركز جونسون الشامل للسرطان في جامعة كاليفورنيا، وجامعة كاليفورنيا ومعهد العلوم السريرية بالحركة لدعم هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant  Fisher Scientific  8409400 Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker Essex Brownell DC-184-1.1 Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit Enercon Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) Ted Pella, Inc. 15072
Fingertight Ferrule, 1/32" Upchurch Scientific UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32 Upchurch Scientific UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm Valco TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm Becton Dickinson 427406
Pressure regulator Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD McMaster Carr 5648K284
Push-to-connect fittings McMaster Carr 5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter Omega IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ National Instruments NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal National Instruments SCB-68-776844-01
LabView System Design Software National Instruments
MATLAB Software The MathWorks, Inc. MATLAB R2012a Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable National Instruments SHC68-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
  4. Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
  5. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  6. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
  7. Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
  8. Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
  9. Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
  10. Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
  11. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  12. Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
  13. Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
  14. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
  15. Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
  16. Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
  17. Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
  18. Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
  19. Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
  20. Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
  21. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  22. Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
  23. Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
  24. Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
  25. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  26. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
  27. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 91، الميكانيكا الخلية، على microfluidics، وتدفق ضغط يحركها، ومعالجة الصور، والتشخيص عالية الإنتاجية، التصنيع الدقيق
تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoelzle, D. J., Varghese, B. A.,… More

Hoelzle, D. J., Varghese, B. A., Chan, C. K., Rowat, A. C. A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability. J. Vis. Exp. (91), e51474, doi:10.3791/51474 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter