Summary
Vi demonstrere en mikrofluidik-assay til måling af tidshorisonten for celler til transit gennem en sekvens af mikron-skala forsnævringer.
Abstract
Her detaljeret udformning, fremstilling og anvendelse af en mikrofluidindretning at evaluere deformerbarhed af et stort antal individuelle celler på en effektiv måde. Typisk kan data for ~ 10 2 celler kan erhverves inden for en 1 time eksperiment. En automatiseret billedanalyse program muliggør effektiv post-eksperiment analyse af billeddata, så behandling for at være fuldstændig inden for et par timer. Vores apparat geometri er unik ved, at celler skal deformere gennem en række micron skala forsnævringer, hvorved den indledende deformation og tidsafhængig lempelse af individuelle celler, der skal analyseres. Anvendeligheden af denne metode til human promyelocytisk leukæmi (HL-60) celler er påvist. Kørsel celler til at deformere gennem micron skala forsnævringer hjælp af tryk-drevet flow, observere vi, at den menneskelige promyelocytiske (HL-60) celler momentant okkludere første indsnævring til en median tid på 9,3 msek før passage hurtigere gennem den efterfølgende snøreioner med en median transittid på 4,0 msek pr konstriktion. Derimod all-trans-retinsyre-behandlede (neutrofil-type) HL-60-celler okkludere første indsnævring kun 4,3 msek før passage gennem de efterfølgende indsnævringer med en median transittid på 3,3 msek. Denne metode kan give indsigt i den viskoelastiske natur af celler, og i sidste ende afslører de molekylære oprindelsen af denne adfærd.
Introduction
Ændringer i celleform er kritiske i mange biologiske sammenhænge. For eksempel, erythrocytter og leukocytter deformere gennem kapillærer, der er mindre end deres egen diameter 1. I metastase skal kræftceller deformere gennem smalle interstitielle huller samt indviklet karsystem og lymfe netværk til frø på sekundære steder 2. Til at sondere den fysiske opførsel af de enkelte celler, præsentere mikrofluidenheder en ideel platform, der kan tilpasses til at studere en række celle adfærd, herunder deres evne til at vandre gennem smalle huller 3 og til passivt at deformere gennem micron skala forsnævringer 3- 9. Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidenheder er optisk transparent, så celle deformationer skal visualiseres ved hjælp af lys mikroskopi og analyseres ved hjælp af grundlæggende billedbehandling værktøj. Desuden kan arrays af forsnævringer være præcist defineret, så analyse af flere celler samtidig med etgennemløb, der overstiger mange eksisterende teknikker 10,11.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol til sondering celle deformerbarhed ved hjælp af 'Cell Deformer' PDMS mikrofluidindretning. Enheden er designet således, at cellerne passage gennem sekventielle indsnævringer; denne geometri er almindelig i fysiologiske sammenhænge, såsom pulmonal kapillærbane 12. At måle celle deformerbarhed, transit tid giver en bekvem metrik, der er let måles som den tid, der kræves for en individuel celle til transit gennem en enkelt indsnævring 4,6. For at opretholde et konstant trykfald over de trange kanaler under celle forsendelse, vi bruger trykdrevet strømning. Vores protokol indeholder detaljerede instruktioner om enheden design og fabrikation, enhedens drift efter trykdrevet strømning, forberedelse og billeddannelse af celler, samt billedbehandling til at måle tiden for celler at deformere gennem en række forsnævringer. Vi inkludererbåde enhedens design og forarbejdning vision data kode som supplerende filer. Som et repræsentativt udsnit af data, viser vi celle transittid gennem en serie af indsnævringer som en funktion af antallet af indsnævringer passeret. Analyse af tidsplanen for celler til transit selvom smalle forsnævringer af en mikrofluid enhed kan afsløre forskelle i deformerbarheden af en række celletyper 4,5,13. Enheden demonstreret her entydigt overvåger celle transit gennem en serie af micron skala forsnævringer; dette motiv emulerer snoet vej at celler opleve i omløb, og giver også mulighed for sondering yderligere fysiske egenskaber af celler, såsom afslapning tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrofluidindretning Design
BEMÆRK: Enheden design har fire grundlæggende funktionelle områder: indgangsport, celle filter, konstriktion array, og udgangsport (Figur 1). Det overordnede design kan anvendes til en bred vifte af celletyper, med mindre justeringer af dimensioner. Forudsat her er et par grundlæggende design anbefalinger sammen med enhedens parametre, der er effektive for et udvalg af både primære og udødeliggjorte celler.
- Vælg bredden af konstriktion array-kanaler (figur 1B) til at være ca 30-50% af den gennemsnitlige cellediameter; denne indsnævring-til-celle-størrelsesforhold resulterer i signifikant celle deformation men minimal tilstopning. Givet en celletype, som ikke tidligere er blevet testet, er det klogt at udforme en række konstriktion bredder fra ~ 30-50% cellediameteren at finde den optimale bredde. Som med mange typer af mikrofluidenheder kan over 120 enheder master-forme være mønstret på en syndgle 4 tommer silicium wafer, der muliggør en bred vifte af forskellige enhedstyper design, der skal fremstilles i en enkelt fremstillingsproces.
- Vælg den kanal højde være mindst 50% af diameteren celle; dette sikrer cellen er begrænset i 2 dimensioner. For at undgå kanal sammenbrud under limning, sørge for, at den kanal skærmformat er intet mindre end 1:10 (højde: bredde) i hele enheden. For kanaler, der må overstige dette aspekt ratio, tilføje understøttelse stillinger for at forhindre sammenbrud. Space bærestolper i en afstand, der er mindst dobbelt cellediameteren til ikke hæmme celle flow.
- Medtag et filter på indgangsporte til at fjerne snavs og disaggregere celleklynger (figur 1b). Juster størrelsen og afstanden af filter stillinger, således at afstanden mellem de stillinger, er omtrent lig med en cellediameter.
BEMÆRK: Den nedre grænse for funktion størrelse er fastsat af den opløsning, som litografi maske udskrives. Sørg for, at alle funktioner er inden for de resolution grænse ved masken leverandøren.
2. Leverancer og klargøring
BEMÆRK: Inden et eksperiment, skal følgende punkter være forberedt. En skematisk af hele opsætningen er givet i figur 1.
- Fabrikere enheden mester anvendelse af standardteknikker til litografisk mikro 14,15. Kontroller højden af mønstrede funktioner ved hjælp af en profilometer.
BEMÆRK: Mens mestre kan nemt fremstillet i et renrum, har nogle laboratorier udviklet billige litografi metoder til brug i en semi-rent miljø 16,17. - Forbered luftkilde til trykdrevet strømning, ved hjælp af en tank af komprimeret luft og sekvens af luft regulatorer og fittings (figur 1A).
- Indstil en lufttilførsel tank og manuel regulator.
BEMÆRK: En sammensætning af 5% CO2 i luft opretholder et lignende miljø som en typisk cellekultur incubator, men andre gasblandinger kan også anvendes. - Opsæt en elektronisk styret trykregulator på linje med den manuelle regulator. Brug en elektro-pneumatisk konverter til at regulere og opretholde en stabil trykfald over kanalerne, med tryksvingninger på mindre end 2 kPa. Brug simpel kode skrevet i LabVIEW (Supplerende oplysninger) for at indtaste det ønskede tryk.
BEMÆRK: elektro-pneumatisk konverter anvender en intern feedback-loop til at justere trykket ventiludløbet at matche den angivne pres i hele mikrofluidindretning. - Opsæt et trykkammer til at drive strømmen af cellesuspensionen. Saml en cellesuspension kammer ud af en standard flowcytometer rør og en bearbejdet hætte, der skaber en tryktæt forsegling på røret.
BEMÆRK: trykkammer kasket indeholder to åbninger: en fjord, der forbinder til trykluft tanken, og en stikkontakt, hvorigennem celler flyder fra trykkammeret i enheden (Figure 2).
- Indstil en lufttilførsel tank og manuel regulator.
- Opsæt et inverteret mikroskop udstyret med et kamera, der har en erhvervelse på mindst 100 frames per sekund til at tage billeder af celler strømmer gennem indsnævringen array. Interface kameraet med et video capture-kort og en computer.
- Forbered en bestand overfladeaktivt opløsning af 10% w / w Pluronic F-127 i phosphatpufret saltvand (PBS) som tilsætning af en lille mængde af F127 til cellen medier løsning vil bidrage til at minimere celleadhæsion til PDMS vægge. For at forberede F127 løsning, vortex og varme forsigtigt ved 37 ° C for at opløse F127. Før brug passere opløsningen gennem et 0,2 um sprøjtefilter og opbevares ved stuetemperatur. Forbered overfladeaktive løsning som hvirvelblanding og filtrering forhånd vil generere bobler, der vil vare i mere end 24 timer.
3. mikrofluidindretning Fabrication
- Fabrikere PDMS blok med mikrofluidkanaler.
- Bland PDMS grundigt enta-forhold på 1:10 (vægt / vægt) hærder til basen.
- Hæld blandingen over enheden master (trin 2.1). Afgasses i en glasklokke med påført vakuum indtil de indfangede boblerne forsvinder, eller for omkring 10-20 minutter.
BEMÆRK: Efter dette tidspunkt kan der stadig være bobler på luft-PDMS interface, som er normalt; disse vil typisk sprede under bagning. Det er mest kritisk for at sikre, at der ikke er resterende bobler støder op til kanalerne. - Bag den afgassede apparat ved 65 ° C i 4 timer. For at forhindre kanaler kollapse, bage enheden natten over til yderligere at tværbinde PDMS til en enhed med et højere elasticitetsmodul, der er mere modstandsdygtig over for kanal sammenbrud. Bemærk dog, at udvidet bagning embrittles også PDMS og kan føre til revner, når stansning huller (trin 3.3).
- Fjern mikrofluidenheder fra master formen. Skær individuelle mikrofluidenheder ud af PDMS blok med et barberblad, og fjern enheden fra mastenis. Start med at løfte forsigtigt fra det ene hjørne af enheden; langsom og blid peeling, i modsætning til at løfte PDMS blok lige op, reducerer belastningen på både PDMS og master.
- Punch huller i PDMS enheden oprette forbindelsesporte for adgang mellem slanger og microchannels. Opret hullerne med en biopsitang, og punch fra kanalen side gennem til den udvendige side af enheden.
BEMÆRK: En biopsitang med en 0,75 mm boring størrelse skaber huller, grænseflade perfekt med polyetheretherketon (PEEK) rør (ydre diameter = 1/32 "eller 0,79 mm) eller polyethylen rør (PE-20, ydre diameter = 0,043" eller 1,09 mm ). Brug en ring lys til at hjælpe visualisere huller i enheder med lavvandede kanaler 18. Vær sikker på, biopsitang er skarp; efter gentagen brug forkant sløver og biopsitang skal kasseres og udskiftes. - Skyl PDMS enhed med isopropanol (HPLC-kvalitet) til at fjerne støv og domicileret bidder af PDMS. Sørg for, atudstansede huller er fri for snavs ved at rette en konstant strøm af ren isopropanol fra en sprøjteflaske gennem hullerne. Blæs tør med filtreret luft. Efter rengøring place PDMS blokke med kanaler står op i en ren petriskål for at bevare enheden renlighed. Hvis det er nødvendigt, lagre enheder i denne form indtil limning.
- Rens glasset substrat ved skylning med methanol (HPLC-kvalitet), blæse tør med filtreret luft, og sted på en 200 ° C varmeplade i 5-10 minutter for at sikre, at glasset er helt ren og tør, før plasma-behandling.
BEMÆRK: Glassubstratet danner bunden af hver kanal. Typisk et objektglas tilstrækkeligt, da en 10X eller 20X objektiv er ideel til billeddannelse af flere kanaler i parallel. For højere opløsning billeddannelse, binde enheden til et dækglas (# 1.5 tykkelse). - Binde PDMS enheden til glassubstratet.
- Oxygenplasma behandle kanal side af PDMS blok og en side af en glasplade.
BEMÆRK: Wed en håndholdt afladningsenhed bruge en behandlingstid på 1 minut, men optimere behandlingen for hver iltapparat plasma. - Placer kanal side af PDMS oven på den behandlede side af glasset umiddelbart efter behandlingen.
- Hold sammen med et let tryk for ~ 10 sek for at fremme binding. Bag hele enheden ved en forhøjet temperatur (60-80 ° C) i mindst 15 min for at forbedre bindingsstyrken.
- Oxygenplasma behandle kanal side af PDMS blok og en side af en glasplade.
4. Deformering celler gennem trange kanaler
- Efterse mikrofluidindretning under et mikroskop. Sørg for, at kanalerne ikke er brudt sammen eller brudt, og at både indsugnings og udløbshullerne tilsluttes direkte til enhedens kanaler ved hjælp af en energibesparende målsætning (10X). Udpeg defekte enheder ved at lave overfladen af PDMS med et barberblad og ikke bruger dem til forsøg.
- Forbered cellekultur prøver de skal analyseres. Kultur-celler under anvendelse af standardbetingelser.
- Feller eksempel kultur HL-60-celler i RPMI-1640-medium suppleret med 1% penicillin-streptomycin-opløsning og 10% føtalt bovint serum i 5% CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Til adhærente celler, høste dem ved trypsinisering og resuspender i frisk vækstmedium. Brug et standard trypsinisering protokollen; for eksempel tilføje ~ 0,5 ml trypsin til en kolbe med 25 cm 2 kultur-området, og resuspenderes i ~ 30 ml frisk medium. Differentiere HL-60 celler i neutrofil-type celler af all-trans-retinsyre (ATRA) i en endelig koncentration på 5 uM pr 1 x 10 5 celler / ml som tidligere beskrevet 19,20.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 3 minutter, omhyggeligt aspireres supernatanten og resuspender cellerne i passende endelige densitet i frisk dyrkningsmedium med 0,1% v / v F-127.
- Tæl celler ved hjælp af en Coulter-tæller, hæmacytometer eller flowcytometer. Juster cellesuspension til en densitet på 1 x 06-5 oktober x 10
- Placer celle suspension i et flowcytometer rør og oprette forbindelse til trykdæksel. Før slangen tilslutning til mikrofluid anordning, justere trykket til omkring 14-21 kPa, og flugter til cellesuspensionen fremgår fra spidsen af røret. Dette vil bidrage til at minimere luftbobler i slangen og enheden.
- Sæt spidsen af røret, der indeholder cellesuspensionen i enheden indløbet. Hvis enheden er bundet til et dækglas, at placere enheden på en flad, solid overflade, såsom mikroskopbordet før slangen forbinder; dækglasset er skrøbelig, og ellers kan knække.
- Sæt et stykke slange into udgangsport og dirigerer det ind i et tomt rør til indsamling af affald, såsom en tom Falcon-rør tapede til side af mikroskopbordet. Til sammenhængen i den samlede strømningstekniske modstand af enheden mellem eksperimenter, sørge for, at indløb og udløb slangen er af samme diameter og omtrent samme længde for hvert forsøg.
- Forsigtigt rampe op presset til omkring 28 kPa eller indtil celler strømmer gennem kanalerne. Placer enheden, så at flere kanaler er i synsfeltet og er vinkelret på bunden af skærmen. Hvis kameraet er begrænset af data størrelse erhverve flere videoer til at generere et tilstrækkeligt antal uafhængige datapunkter. Juster frame rate som er nødvendige for den ønskede data output. For at fange ændringer i cellens form, bruger høj hastighed billeddannelse ved 300 frames per sekund (fps); at måle transittider celler, skal du bruge frame rates på cirka 100 fps.
5. Dataanalyse
- Åbn filen Master_script.m (Downloadable Supplerende fil) og kør programmet.
- Vælg den første video, der skal analyseres fra Windows Stifinder-vindue, der vises. Angiv billedhastigheden for den valgte video og trykke på enter.
BEMÆRK: En figur vises der beder brugeren om at vælge et rektangulært beskæring vindue til den første video. - Vælg et vindue, der omfatter alle de kanaler, fra venstre til højre og skærer kanalerne lige over den første pære af matrix af kanaler på toppen og bunden (figur 3).
- Vælg indsnævringen regioner fra det beskårne billede. Vær særlig opmærksom på at opretholde en fast pixel afstand mellem top og bund vindue grænse for hver video er valgt.
BEMÆRK: Den øverste vindue kant angiver den øverste konstriktion og nederste vindue kant angiver det nederste forsnævringen (figur 4); mellemliggende forsnævringer er tilnærmet fra denne bruger input. Dernæst viser den algoritme af segmentation af celler for de første 50 billeder for hver video (figur 5). - Overvåg øverste venstre billede (figur 5A) nøje at bestemme, om algoritmen nøjagtigt lokalisere celler; en binariserede billede overlejres på kilden video til at demonstrere placeringen af identificerede celler.
BEMÆRK: De forskellige vinduer, (figur 5B-5D) er for kode diagnose og demonstrere videobilleder efter specifikke billede behandlinger. - Vælg den næste video, der skal behandles fra Windows Stifinder-vinduet.
BEMÆRK: Algoritmen vil gentage trin 5,2-5,5 for hver video er valgt. - Vælg annullere når alle ønskede videoer er blevet tilføjet via Windows Stifinder til at instruere den funktion, at videoen listen er færdig.
BEMÆRK: Algoritmen vil udføre de resterende operationer uden brugerens indgriben. Det vil tage omkring 1-2 timer afhængigt af antallet af videoer forarbejdede og computer performance. Ved afslutning, vil algoritmen producere et histogram af transittiden data, og gemme dataene i fortegnelsen som en Matlab .mat fil og en Microsoft Excel xls-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At undersøge deformerbarheden forskellige celletyper, humane myeloide leukæmiceller (HL-60), differentierede neutrofile celler, mus lymfocytceller og human ovariekræft cellelinjer (OVCAR8, HEYA8) vurderes ved hjælp af 'Cell Deformer "mikrofluid teknik. Repræsentative resultater for transittiden af HL-60-og neutrofil-type HL-60-celler viser tidsplanen for en enkelt celle til transit gennem en serie indsnævringer, som vist i figur 6. Transittiden måles for en population af individuelle celler ved hver 7 um sammensnøring i en serie af 7 indsnævringer på en drivende tryk på 28 kPa (figur 6).
Som vist i figur 6, HL-60-celler midlertidigt okkluderer den første indsnævring til en median på 9,3 msek før passage gennem de efterfølgende forsnævringer. Derimod neutrofil-type HL-60-celler okkludere første indsnævring kun 4,3 msek førpassage. Den kortere transittid af HL-60-celler er i overensstemmelse med deres reducerede elastiske og viskøse moduli, som bestemt ved atomic force mikroskopi 21 og mikropipetteaspirationsteknik 22. Disse resultater er også i overensstemmelse med de reducerede niveauer af mechanoregulating protein lamin A, der bestemmer transittider af celler gennem micron skala huller 23. Når gennem den første indsnævring celler transit hurtigere gennem de resterende forsnævringer fra 2 til 7, med en median transittid på 4,0 msek for HL-60-celler og 3,3 msek for neutrofil-type celler (figur 6). Mens HL-60-celler stadig udviser lidt længere, men væsentlige transittider (C2-C7, p = 1.7E-9), fordelingen af transporttiden for indsnævringer 2-7 er næsten identiske for hver celletype. Observationen af den længere transit tid, der kræves for første indsnævring kan afspejle, at de viskoelastiske celler ikke slappe helt af til deres oprindelige form on disse ~ ms tidsskalaer. Denne adfærd kan også forklares med irreversible strukturelle ændringer, der udvikler inde i cellen, og lette deres transit gennem de efterfølgende huller mikron-skala. Vigtigere er det, ved at sammenligne transittid mellem cellepopulationer, selv for den første indsnævring kan afsløre forskelle i deres deformerbarhed 23.
Figur 1. Skematisk illustration af forsøgsopstillingen. . A. »Cell Deformer 'enhed i forsøgsopstillingen viser de perifere forbindelser B. Enheden design har 4 funktionelle områder: indgangsport, celle filter, konstriktion array, og udgangsport. Arkitektur af mikrofluidindretning viser de vigtigste karakteristika; indsatte viser en transmitteret lys billede af de trange kanaler. Scale, 10 μ ; M.
Figur 2. Tekniske tegninger til en brugerdefineret kasket at presse cellemedier indeholdt i et flowcytometer rør.
Figur 3. Demonstration af, hvordan du vælger det område af interesse for videobillede beskæring.
Figur 4. Demonstration af, hvordan man vælger konstriktion placeringer.
51474fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Observation vindue bruges til at verificere, at algoritmen korrekt identificerer celleplaceringer, som de behandler gennem indsnævringen array. A. binariserede billede er overlejret på kilden video til at vise placeringen af cellerne B. Forskel billede;. C. Bund hat filtrerede billede D. Median filtreret.
Figur 6. Repræsentative transittid målinger som funktion af konstriktion nummer. A. HL-60-celler udviser en længere transittid gennem den første indsnævring end B. ATRA-behandlede HL-60 (neutrofil-type) celler. En sammenligning af den transformerede passagetid (log10) gennem den første indsnævring, som blev vurderet ved hjælp af den ikke-parametriske Mann-Whitney-testen afslørerforskel er signifikant, p = 1.47E-5. Celler typisk transit gennem den første indsnævring langsommere end de efterfølgende indsnævringer. Data vist her for celler i transit gennem 7 um-dækkende forsnævringer på en drivende tryk på 28 kPa. Celletæthed betyder cellediameter, og koncentration af overfladeaktivt stof er anført i tabel 1 HL-60, N = 77.; ATRA-behandlede HL-60, N = 97. Resultater replikeres i uafhængige eksperimenter i løbet af 3 forskellige dage.
Figur 7. Oversigt over Matlab script til at måle transittiden. Første løkke kræver brugerens intervention og observation for de første 50 billeder for hver video. Efter den første løkke, vil hele programmet kører uden brugerens medvirken og sammenstiller og plots befolkningsdata automatisk.
Tabel 1. Tidligere studerede celle systemer og deres driftsforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi et omfattende eksperimentelle procedure til analyse af deformation af celler i transit gennem trange mikrofluidkanaler anvendelse af tryk-drevet flow. En MATLAB script muliggør automatiseret databehandling (supplerende materiale); en opdateret version af koden opretholdes ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mere generelt kan de teknikker, der præsenteres her, tilpasses i mange cellebaserede mikrofluide analyser, inklusive effekten af cytoskeletal og nukleare afstivende midler 24,23 samt analyse deformabilitet cancercelletyper 4,5. Taget sammen med højere opløsning mikroskopi til at afbilde subcellulære deformationer denne metode giver en kraftfuld metode til at studere celle-mekaniske egenskaber og ændringer, der forekommer i fysiologiske og patologiske tilstande.
Automatisk Cell algoritme
figur 7, og sættet af MATLAB funktioner opnås i de supplerende oplysninger. Kort sagt, bliver brugeren bedt om at vælge alle de videoer til at analysere; beskære hver video for regionen interesse; og angive en billedhastighed for sættet af videoer; Derefter software behandler automatisk videodata at bestemme transittiden i hver celle for hver indsnævring. Der er visse krav til scriptet til at køre celler skal strømme fra toppen af rammen til bunden af rammen på videoen; den mikrofluidindretning position og lysforholdene bør ikke ændre betydeligt i varigheden af video; og videoer skal være i .avi-format. Vigtigere er det, sporingsalgoritmen omfatter celler, både ind og passage i tidsvindue på en enkelt videooptagelse, der er ca 8 sek. Derfor vil enhverobjekter, der har en længere transittid er udelukket fra analysen. Ved at udføre baggrund subtraktion, er objekter, der er til stede i hele videoen fjernet fra analysen. Koden gennemfører også en mindre størrelse cutoff, som kan indstilles af brugeren. Størrelsen cutoff for video-analyse var 5 pixel, svarende til en celle diameter på 2,7 um.
Da de high-speed video-datafiler kan være betydelig (~ 500 MB), er programmet regnekraft. Kode er mest effektivt køre ved hjælp af en stationær computer med mindst 6 GB RAM og en 64-bit chipset med enten en lokal harddisk med mindst en 1 TB kapacitet eller interface med en stor ekstern harddisk eller data-server med en USB 3.0 , FireWire eller Ethernet-forbindelse. Data output i et histogram format til hurtig visualisering af resultater; det er også tabelform som data, der er lagret i en MATLAB (.mat) datafil og i et Excel regneark.
Den kode, der er PResented giver en enkel måde at sammenligne cellepopulationer ved analyse af transittiden for celler til gennemsejling hver konstriktion. For mere detaljeret analyse, kan koden udvides til at undersøge andre parametre, herunder celle størrelse, formatforhold, samt afslapning tidshorisont. Tidligere undersøgelser viser kun en svag afhængighed af cellestørrelse på transittid 6.
Enheds-relaterede Faldgruber
Okkluderede kanaler er en væsentlig hindring i enhver flow eksperiment. Celleadhæsion til enhedens vægge vil forringe strømmen af celler gennem de trange kanaler: celler kan observeres at smøre ud langs kanalen vægge. For at undgå vedhæftning er afgørende korrekt overfladebehandling med F-127.
Overfladeegenskaber PDMS ændre sig med tiden efter plasma-behandling, hvilket gør PDMS midlertidigt hydrofile 25,26. I løbet af en uge, hydrofile PDMS overflader langsomt degenerere til deres naturlige hydrofobe overflade energi; dette kan udfordre fjernelse af luftbobler gennem kanalerne. Enheder bør derfor anvendes inden for syv dage plasma-behandling. Vigtigst, bør tiden mellem plasma behandling og deformerbarheden analysen være konsistent på tværs af alle forsøg.
Mens vi med succes har udmærket transittider mellem forskellige celletyper ved hjælp af anordninger, fremstillet med et glas gulv og tre PDMS vægge, kan enhederne også fremstilles, så de har ensartede overfladeegenskaber på alle fire kanalvægge 27. PDMS-enheden kan være bundet til et glassubstrat spundet med et tyndt PDMS lag: bland hærdningsmiddel at basere i et forhold på 1: 5 (vægt / vægt), hældes på enheden formen, og hærde i 20 minutter ved 65 ° C . I mellemtiden spincoat et tyndt lag på 1:20 (vægt / vægt) hærder at basere på glassubstratet; bages ved 85 ° C i 4 min. Placer PDMS enheden på PDMS-overtrukne dias, og slut bagning nattenfor at fuldføre binding. Denne metode er også værdifuldt, hvis et plasma maskine til glas-PDMS binding er ikke tilgængelig.
Cell-relaterede faldgruber.
høne forbereder cellesuspensionen densiteten af celler er kritisk: Hvis celledensiteten er for lav, vil celle transit begivenheder være sjældne; hvis celledensiteten er for høj, vil der være flere celler passage af et enkelt kanal samtidigt, vil trykfaldet over en enkelt celle ikke være i overensstemmelse, og det vil være vanskeligt at afgrænse individuelle celler med en automatiseret script.
Mens forsøg typisk udføres inden for 30 min af cellesuspensioner fremstilles, kan cellerne sig på bunden af trykkammeret over længere tider> 30 min. For at undgå afregning over længere perioder, kan trykkammeret og tilslutning slanger periodisk roteres. Ved længere eksperimenter, kan en lille magnetisk omrørerstav sættes til cell suspension med en omrøringsplade placeret under trykkammeret at omrøre cellerne og forhindrer bundfældning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Lloyd Ung til konstruktive bidrag i tidlige versioner af denne teknik, Dr. Jeremy Agresti for pres cap design tips, og Dr. Dongping Qi for hans hjælp i opdigte trykdækslet. Vi er taknemmelige for laboratorier M. Teitell og P. Gunaratne for at levere en bred vifte af celleprøver til test. Vi er taknemmelige for National Science Foundation (KARRIERE Award DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center og UCLA Clinical and Translational Science Institute for at støtte dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
