Summary
Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.
Abstract
Hier werden wir ausführlich die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Mikrofluid-Vorrichtung, um die Verformbarkeit der eine große Anzahl von einzelnen Zellen in einer effizienten Weise zu bewerten. Typischerweise können Daten für ~ 10 2 Zellen in einem 1 h Experiment gewonnen werden. Ein automatisiertes Bildanalyseprogramm ermöglicht die effiziente Post Experiment Analyse von Bilddaten, so dass die Verarbeitung innerhalb weniger Stunden zu sein. Unsere Vorrichtung Geometrie ist einzigartig, da Zellen müssen durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen zu verformen, wodurch die anfängliche Verformung und zeitabhängige Relaxation von einzelnen Zellen, die untersucht werden. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf die menschliche promyelozytische Leukämie (HL-60-Zellen) nachgewiesen wird. Fahren Zellen durch Mikrometermaßstab Verengungen mit druckgetriebenen Strömung verformen, beobachten wir, dass die menschliche Promyelozyten (HL-60-Zellen) kurzzeitig verschließen die erste Engstelle für eine mittlere Zeit von 9,3 ms vor schneller Passage durch die nachfolgenden constrictIonen mit einer mittleren Laufzeit von 4,0 ms pro Verengung. Dagegen all-trans-Retinsäure-behandelten (Neutrophile-Typ) HL-60-Zellen zu verschließen, die erste Einschnürung für nur 4,3 ms vor Passage durch die nachfolgenden Einschnürungen mit einer mittleren Durchgangszeit von 3,3 msec. Diese Methode kann Einblick in die viskoelastischen Eigenschaften von Zellen zu schaffen, und schließlich zeigen die molekularen Ursachen für dieses Verhalten.
Introduction
Veränderungen in der Zellform kritisch in zahlreichen biologischen Kontext. Beispielsweise Erythrozyten und Leukozyten zu verformen durch die Kapillaren, die kleiner ist als ihre eigenen Durchmesser 1 sind. Bei der Metastasierung, müssen Krebszellen durch die engen Zwischenräume sowie gewundenen Gefäßsystem und lymphatischen Netze zu verformen, um an sekundären Standorten 2 Samen. Um das physikalische Verhalten einzelner Zellen zu untersuchen, präsentieren mikrofluidischen Systemen eine ideale Plattform, die individuell auf eine Reihe von Zellverhalten einschließlich ihrer Fähigkeit, durch enge Spalte 3 zu migrieren und zu passiv durch Mikrometermaßstab Verengungen 3 9 verformen studieren. Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrofluidik-Vorrichtungen optisch transparent sind, so dass Zellverformungen mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht und unter Verwendung von Bildverarbeitungshilfsmittel analysiert werden. Darüber hinaus können Anordnungen von Verengungen genau definiert werden, wodurch Analyse von mehreren Zellen gleichzeitig mit einerDurch dass viele bestehende Techniken 10,11 übersteigt.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Versuchsprotokoll zur Sondierung Zelle Verformbarkeit mit der "Handy-Deformer" PDMS mikrofluidischen Vorrichtung. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Zellen durch sequentielle Passage Einschnürungen; Diese Geometrie ist in physiologischen Zusammenhängen, wie beispielsweise Lungen Kapillarbett 12 gemeinsam. Um die Zell Verformbarkeit messen, bietet Laufzeit eine bequeme Metrik, die leicht als die Zeit für eine individuelle Zelle dazu, durch eine einzige Engstelle 4,6 erforderlich ist, gemessen. Um einen konstanten Druckabfall über die verengten Kanäle während der Zell Transit zu gewährleisten, verwenden wir druckgetriebenen Strömung. Unser Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Einrichtung Konstruktion und Herstellung, Betrieb der Vorrichtung durch Druck angetriebenen Strömungs, Aufbereitung und Darstellung von Zellen, als auch die Bildverarbeitung, um die Zeit für Zellen, die durch eine Reihe von Verengungen verformen messen. Wir sindbeide Geräteausführungen und Vision der Datenverarbeitung als Zusatzcode-Dateien. Als ein repräsentatives Beispiel von Daten, zeigen wir Zelldurchgangszeit durch eine Reihe von Verengungen in Abhängigkeit von der Anzahl der Einschnürungen agiert. Analyse der Zeitskala für Zellen Transit wenn schmale Verengungen einer mikrofluidischen Vorrichtung kann Unterschiede in der Verformbarkeit von einer Vielzahl von Zelltypen 4,5,13 offenbaren. Die hier gezeigte Gerät eindeutig blickt Zelle Transit durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen; Dieses Design emuliert den gewundenen Weg, die Zellen zu erleben im Umlauf und ermöglicht auch zusätzliche Sondierung physikalischen Eigenschaften der Zellen, wie zB Entspannungszeit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofluidik-Geräte-Design-
HINWEIS: Das Gerätedesign hat vier grundlegende Funktionsbereiche: Eingangsöffnung, Zellenfilter, Verengung Array und Austrittsöffnung (Abbildung 1). Der Gesamtaufbau kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, mit geringfügigen Anpassungen Dimensionen. Hier vorgesehen sind ein paar grundlegende Gestaltungsempfehlungen zusammen mit Geräteparameter, die wirksam für eine Auswahl von primären und immortalisierten Zellen sind.
- Wählen Sie die Breite der Verengung Anordnungskanäle (1B) auf etwa 30-50% des durchschnittlichen Zelldurchmesser ist; Diese Verengung zu Zelle Größenverhältnis führt zu erheblichen Zellverformung aber minimale Verstopfung. Bei einem Zelltyp, die zuvor nicht getestet wurde, ist es ratsam, eine Reihe von Verengung Breiten von ~ 30-50% Design der Zelldurchmesser, um die optimale Breite zu finden. Wie bei vielen Arten von mikrofluidischen Geräten können über 120 Gerätestammformen auf einer Sünde strukturiert werdenGLE 4 Zoll Silicium-Wafer, wodurch ein Array von unterschiedlichen Geräteausführungen in einem einzigen Herstellungsprozess hergestellt werden.
- Wählen Sie die Kanalhöhe zumindest 50% der Zelldurchmesser ist; Dies gewährleistet die Zelle in 2 Dimensionen beschränkt. Um die Kanal Zusammenbruch während der Bindung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Kanalseitenverhältnis ist nicht weniger als 1:10 (Höhe: Breite) in der gesamten Gerät. Für die Kanäle, die dieses Seitenverhältnis überschreiten darf, fügen Stützpfosten, um einen Zusammenbruch zu verhindern. Raumtragpfosten in einem Abstand, der mindestens das Zweifache der Zelldurchmesser, um Zellstrom nicht behindert wird.
- Einen Filter in den Eintrittsöffnungen, um Schmutz zu entfernen und zu zerlegen Zellhaufen (Abbildung 1B). Anpassen der Größe und der Abstand der Filterstellen, so dass der Abstand zwischen den Stellen ungefähr gleich einem Zellendurchmesser ist.
HINWEIS: Die untere Grenze der Strukturgröße ist durch die Auflösung, mit der die Lithographiemaske gedruckt eingestellt. Stellen Sie sicher, dass alle Funktionen innerhalb der reslösung Grenze durch die Maske Lieferanten festgelegt.
2. Lieferungen und Vorbereitung
HINWEIS: Vor Beginn der Versuch, müssen die folgenden Punkte vorbereitet werden. Eine schematische Darstellung der gesamten Konfiguration ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Herstellung der Gerätestamm Verwendung von Standardtechniken für lithographische Mikro 14,15. Überprüfen Sie, ob die Höhe der strukturierten Merkmale mit einem Profilometer.
HINWEIS: Bei Master können leicht in einem Reinraum-Anlage hergestellt werden, haben einige Labors kostengünstig Lithografieverfahren zur Verwendung in einem Halb sauberen Umgebung entwickelten 16,17. - Bereiten Sie die Luftquelle für druckgetriebene Strömung mit einem Druckluftbehälter und die Abfolge der Luftregler und Armaturen (1A).
- Einrichtung einer Luftversorgungstank und Handregler.
ANMERKUNG: Eine Zusammensetzung von 5% CO 2 in Luft unterhält eine ähnliche Umgebung wie ein typischer Zellkultur incubator, aber auch andere Gasgemische können ebenfalls verwendet werden. - Einrichtung eines elektronisch gesteuerten Druckregler in-line mit dem Handregler. Verwenden einen elektropneumatischen Wandler zu regeln und eine stabile Druckabfall über den Kanal, mit Druckschwankungen von weniger als 2 kPa. Verwenden Sie den einfachen Code in LabVIEW geschrieben (Ergänzende Informationen) zur Eingabe der gewünschten Druck.
HINWEIS: Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Ventilausgangsdruck auf den vorgegebenen Druck in der mikrofluidischen Vorrichtung anpassen. - Einrichten einer Druckkammer, um eine Strömung der Zellsuspension zu fahren. Zusammenstellung eines Zellsuspensionskammer von einer Standard-Durchflusszytometer Rohr und einem maschinell bearbeiteten Kappe, die eine druckdichte Abdichtung an dem Rohr erzeugt.
HINWEIS: Die Druckkammer Kappe enthält zwei Öffnungen: einen Einlass, der mit dem Druckluftbehälter verbunden ist, und einen Auslass, durch die Zellen fließt aus der Druckkammer in der Vorrichtung (Figure 2).
- Einrichtung einer Luftversorgungstank und Handregler.
- Einrichten eines umgekehrten Mikroskop mit einer Kamera, die eine Erfassungsrate von mindestens 100 Bilder pro Sekunde, um Bilder von den Zellen durch die Verengung Array fließenden einzufangen ausgestattet. Schnittstelle wird die Kamera mit einem Video-Capture-Karte und einem Computer.
- Wird eine Stammlösung des oberflächenaktiven Mittels 10% w / w Pluronic F-127 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), wie die Zugabe einer geringen Menge an F127 zu dem Zellmedium Lösung wird zur Zelladhäsion an PDMS Wände minimieren. Um die F127-Lösung, Vortex und Wärme schonend bei 37 ° C vorbereiten, die F127 aufzulösen. Vor verwenden, übergeben Sie die Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter und bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Tensid-Lösung im Voraus als Vortex und Filter wird Blasen, die für mehr als 24 Stunden anhalten wird zu generieren.
3. Mikrofluidik-Geräte-Fertigung
- Herzustellen PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen.
- Mix PDMS gründlich einTA-Verhältnis von 1:10 (w / w) Härter zur Basis.
- Gießen Sie die Mischung über die Gerätestamm (Schritt 2.1). Degas in einer Glasglocke mit angelegtem Vakuum, bis die eingeschlossenen Blasen verschwinden, oder für ca. 10-20 min.
HINWEIS: Nach dieser Zeit kann es immer noch Blasen an der Luft-PDMS-Schnittstelle, die normal zu sein; diese werden in der Regel während des Backens zu zerstreuen. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, daß es keine verbleibenden Blasen benachbart zu den Kanälen. - Backen das entgaste Gerät bei 65 ° C für 4 h. Um die Kanäle vor dem Kollaps zu verhindern, backen Sie das Gerät über Nacht zur weiteren Vernetzung der PDMS für ein Gerät mit einem höheren Elastizitätsmodul, die resistenter gegen Kanal-Zusammenbruch ist. Jedoch beachten, dass Back erweitert versprödet auch die PDMS und kann zu Rissbildung beim Stanzen Löcher (Schritt 3.3) führen.
- Mikrofluidik-Geräte zu entfernen aus der Urform. Schneiden einzelnen mikrofluidischen Bauteilen aus der PDMS-Block mit einer Rasierklinge und entfernen Sie das Gerät aus der Mastäh. Starten Sie durch leichtes Anheben aus einer Ecke des Geräts; langsam und sanftes Peeling, im Gegensatz zu Aufhebung der PDMS-Block gerade nach oben, reduziert die Belastung auf beiden PDMS und den Master.
- Stanzlöcher in der PDMS-Gerät an Anschluss-Ports für den Zugriff zwischen Schlauch und Mikrokanäle erstellen. Erstellen Löcher mit einem Stanzbiopsie, und stanzen von der Kanalseite durch an der Außenseite der Vorrichtung.
HINWEIS: Eine Biopsie Punch mit einer 0,75 mm Bohrung schafft Löcher, die Schnittstelle perfekt mit Polyetheretherketon (PEEK)-Schlauch (Außendurchmesser = 1/32 "oder 0,79 mm) oder Polyethylenschlauch (PE-20, Außendurchmesser = 0,043" oder 1,09 mm ). Verwenden Sie einen Ringlicht zu helfen, zu visualisieren Löcher in Geräten mit flachen Kanälen 18. Seien Sie sicher, dass die Biopsie Punch ist scharf; nach wiederholter Anwendung die Schnittkante abstumpft und die Biopsie Punch sollten entsorgt und ersetzt werden. - Spülen Sie die PDMS-Gerät mit Isopropanol (HPLC-Qualität), um Staub und Brocken eingereicht von PDMS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass diegestanzten Löcher sind frei von Fremdkörpern, indem ein stetiger Strom von reinem Isopropanol aus einer Spritzflasche durch die Löcher. Föhnen mit gefilterter Luft. Nach der Reinigung Ort PDMS-Blöcke mit Kanälen nach oben in eine saubere Petrischale auf Sauberkeit Gerät zu erhalten. Falls erforderlich, speichern Geräte in dieser Form bis Bindung.
- Reinigen Sie das Glassubstrat durch Spülen mit Methanol (HPLC-Qualität), föhnen mit gefilterter Luft, und auf eine 200 ° C Warmhalteplatte für 5-10 min, um sicherzustellen, das Glas ist absolut sauber und trocken vor der Plasmabehandlung.
HINWEIS: Das Glassubstrat der Boden jeder Kanal bildet. Typischerweise ein Glasobjektträger genügt, da ein 10X oder 20X Ziel ist ideal zur Abbildung mehrere Kanäle parallel. Für eine höhere Auflösung Bildgebung, verbinden Sie das Gerät an einem Deckglas (# 1.5 Dicke). - Verbinden die PDMS-Gerät auf das Glassubstrat.
- Sauerstoffplasma-Behandlung der Kanalseite der PDMS-Block und 1 Seite eines Glasobjektträgers.
HINWEIS: Wit einem Handabgabeeinheit, mit einem Behandlungszeit von 1 min, aber die Optimierung der Behandlungszeit für jedes Sauerstoff-Plasma-Vorrichtung. - Platzieren der Kanalseite der PDMS auf der behandelten Seite der Glas unmittelbar nach der Behandlung.
- Halten Sie durch leichten Druck zusammen für ~ 10 Sekunden, um die Bindung zu fördern. Bake der gesamten Vorrichtung bei einer erhöhten Temperatur (60-80 ° C) für mindestens 15 min auf Haftfestigkeit zu verbessern.
- Sauerstoffplasma-Behandlung der Kanalseite der PDMS-Block und 1 Seite eines Glasobjektträgers.
4. Verformen Zellen durch verengte Kanäle
- Überprüfen Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht zusammengebrochen oder gebrochen ist und dass beide Einlass und Auslass Löcher sind direkt in die Gerätekanäle durch die Verwendung eines Low-Power-Objektiv (10-fach). Bestimmen Sie defekte Geräte, indem man die Oberfläche der PDMS mit einer Rasierklinge und für Experimente nutzen sie nicht.
- Vorbereitung der Zellkulturproben, die untersucht werden. Kulturzellen unter Standardbedingungen.
- Foder beispielsweise Kultur HL-60-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% fötalem Rinderserum und 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C ergänzt.
- Für adhärenten Zellen, ernten sie durch Trypsinierung und resuspendieren in frischem Wachstumsmedium. Verwenden Sie ein Standard-Protokoll Trypsinierung; zum Beispiel, fügen ~ 0,5 ml Trypsin in einen Kolben mit 25 cm 2 Kulturbereich und resuspendieren in ~ 30 ml frischem Medium. Unterscheiden HL-60-Zellen in neutrophile Typ-Zellen von all-trans-Retinsäure (ATRA) in einer Endkonzentration von 5 uM pro 1 x 10 5 Zellen / ml, wie zuvor beschrieben 19,20.
- Zentrifugation der Zellen bei 300 × g für 3 min, sorgfältig den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen an die entsprechende endgültige Dichte in frischem Kulturmedium mit 0,1% v / v F-127.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Coulter Counter, Hämazytometer oder Durchflusszytometer. Einstellen der Zellsuspension in einer Dichte von 1 × 10 6 bis 5 × 10
- Zeigen Zellsuspension in einem Durchflusszytometer Rohr und an der Druckkappe. Vor dem Anschluss der Schläuche an die Mikrofluidik-Vorrichtung, bis die Zellsuspension ergibt sich aus der Spitze der Schläuche den Druck auf ungefähr 14-21 kPa und bündig. Dies wird helfen, um Luftblasen in dem Schlauch und der Vorrichtung zu minimieren.
- Führen Sie die Spitze des Schlauches, die die Zellsuspension in das Gerät Einlass. Wenn das Gerät mit einem Deckglas geklebt, stellen Sie das Gerät auf einer ebenen, festen Oberfläche wie dem Mikroskoptisch, bevor Sie den Schlauch; das Deckglas ist zerbrechlich und kann sonst brechen.
- Legen Sie ein Stück Schlauch into der Ausgangsöffnung und Route in ein Leerrohr für Abfallsammel zB eine leere Falcon-Röhrchen auf der Seite des Mikroskoptisch geklebt. Konsistenz der Gesamtströmungswiderstand der Vorrichtung zwischen den Experimenten, dass der Einlass und der Auslass Schlauch ist mit dem gleichen Durchmesser und etwa die gleiche Länge für jedes Experiment.
- Sanft Rampe den Druck auf etwa 28 kPa oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren der Vorrichtung, so daß mehrere Kanäle in dem Sichtfeld und sind senkrecht zur Unterseite des Bildschirms. Wenn die Kamera durch Datengröße beschränkt ist, erwerben mehrere Videos, eine ausreichende Anzahl unabhängiger Datenpunkte zu erzeugen. Passen Sie die Bildrate für die gewünschten Datenausgabe wie nötig. Um Änderungen in der Zellform zu erfassen, verwenden Hochgeschwindigkeits-Imaging bei 300 Bildern pro Sekunde (fps); zu Laufzeiten von Zellen zu messen, verwenden Bildraten von etwa 100 fps.
5. Datenanalyse
- Öffnen Sie die Datei Master_script.m (Herunterladbare Zusatz Datei) und starten Sie das Programm.
- Wählen Sie das erste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster, das angezeigt wird analysiert werden. Geben Sie die Framerate für das ausgewählte Video und drücken Sie die Eingabetaste.
HINWEIS: Eine Figur wird angezeigt, dass der Benutzer aufgefordert, eine rechteckige Fenster Zuschneiden für das erste Video zu wählen. - Auswählen eines Fensters, das alle Kanäle von links nach rechts schneidet, umfasst und die Kanäle nur über den ersten Kolben der Anordnung von Kanälen an der Oberseite und Unterseite (3).
- Wählen Sie die Regionen aus der Verengung zugeschnittene Bild. Achten Sie besonders auf eine feste Pixelabstand zwischen den oberen und unteren Fensterrand für jedes Video eingestellt zu halten.
HINWEIS: Die obere Fensterkante gibt die oberste Verengung und unteren Fensterrand gibt die unterste Einschnürung (Abbildung 4); Zwischen Einschnürungen sind von dieser Benutzereingaben angenähert. Als nächstes zeigt die s der Algorithmusegmentation von Zellen für die ersten 50 Rahmen jedes Video (Bild 5). - Überwachen die linke obere Bild (5A) eng zu bestimmen, ob der Algorithmus genauen Lokalisieren Zellen; eine binarisierten Bild auf der Videoquelle überlagert, um die Position der identifizierten Zellen zu demonstrieren.
HINWEIS: Die verschiedenen Fenster, (5B-5D) sind für die Code-Diagnose und zeigen die Videobilder nach bestimmten Bildverarbeitungsoperationen. - Wählen Sie das nächste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster bearbeitet werden.
HINWEIS: Der Algorithmus Wiederholen Sie die Schritte 5,2-5,5 für jedes Video ausgewählt. - Wählen Sie Abbrechen, wenn alle gewünschten Videos haben über die Windows-Explorer-Fenster hinzugefügt, um die Funktion, die die Video-Liste vollständig ist weisen.
HINWEIS: Der Algorithmus wird die restlichen Operationen ohne Benutzereingriff durchführen. Dies wird etwa 1-2 Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der Videos bearbeitet und Computer performance. Nach der Fertigstellung wird der Algorithmus ein Histogramm der Laufzeit-Daten zu erzeugen und speichern Sie die Daten im Verzeichnis als MATLAB .mat Datei und einer Microsoft Excel XLS-Datei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Verformbarkeit der verschiedenen Zelltypen, Menschen myeloischen Leukämie-Zellen (HL-60), differenziert neutrophilen Zellen, Maus-Lymphozyten-Zellen und menschlichen Eierstockkrebszelllinien (OVCAR8, HEYA8) untersuchen werden mit der "Handy-Deformer" Mikrofluidik-Technik ausgewertet. Repräsentative Ergebnisse für die Laufzeit des HL-60 und Neutrophilen-Typ HL-60-Zellen zeigen den Zeitplan für eine einzelne Zelle dazu, durch eine Reihe von Engstellen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Laufzeit ist für eine Bevölkerung von einzelnen Zellen gemessen am jeweils 7 um Einschnürung in einer Serie von Einschnürungen 7 an einem Antriebsdruck von 28 kPa (Abbildung 6).
Wie in 6 gezeigt, HL-60-Zellen vorübergehend zu verschließen, die erste Einschnürung für eine mittlere Zeit von 9,3 ms vor Passage durch die nachfolgenden Einschnürungen. Dagegen Neutrophilen-Typ HL-60-Zellen zu verschließen, die erste Einschnürung für nur 4,3 ms vorPassagieren. Die kürzere Durchgangszeit der HL-60-Zellen ist, die mit ihrer reduzierten elastischen und viskosen Module, wie durch Rasterkraftmikroskopie-Mikropipette 21 und Streben 22 bestimmt. Diese Ergebnisse stimmen auch mit der reduzierten Niveaus des mechanoregulating Protein Lamin A, die Laufzeiten von Zellen durch Mikrometermaßstab Spalte 23 bestimmen. Einmal durch die erste Einschnürung, Zellen Transit schneller durch die verbleibenden Einschnürungen von 2 bis 7, mit einer mittleren Durchgangszeit von 4,0 ms für den HL-60-Zellen und 3,3 ms für den Neutrophilen-Typ-Zellen (Abbildung 6). Während die HL-60-Zellen zeigen noch etwas länger, aber signifikante Laufzeiten (C2-C7, p = 1.7E-9), die Verteilung der Laufzeiten für Verengungen 2-7 sind für jeden Zelltyp nahezu identisch. Die Beobachtung der für die erste Einschnürung erforderlich längeren Laufzeit kann widerspiegeln, dass die viskoelastischen Zellen nicht vollständig ihre ursprüngliche Form o entspannenn diese ~ ms Zeitskalen. Dieses Verhalten kann auch durch irreversible strukturelle Veränderungen, die innerhalb der Zelle zu entwickeln, und ihre Durchfuhr durch die nachfolgenden Mikrometermaßstab Lücken erleichtern erklärt werden. Wichtig ist, dass durch den Vergleich Transitzeit zwischen Zellpopulationen, auch für die erste Einschnürung, können Unterschiede in ihrer Verformbarkeit 23 offenbaren.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. . A. 'Handy-Deformer "Gerät in der Versuchsanordnung, die die Peripherieanschlüsse B. Das Gerätedesign hat 4 Funktionsbereiche: Eingangsöffnung, Zellenfilter, Verengung Array und Austrittsöffnung. Architektur des Mikrofluidik-Vorrichtung, die die wichtigsten Funktionen; Einschub zeigt eine Durchlichtbild des verengten Kanäle. Skala, 10 μ , M.
Abbildung 2. Technische Zeichnungen für eine individuell gestaltete Mütze in einem Durchflusszytometer Rohr enthaltenen Zellmedien Druck zu setzen.
Abbildung 3. Demonstration, wie man die Region von Interesse für Video-Frame Zuschneiden auszuwählen.
Abbildung 4. Demonstration, wie man Konstriktionsorten wählen.
51474fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Abbildung 5. Sichtfenster verwendet werden, um zu überprüfen, ob der Algorithmus richtig identifiziert Zellenpositionen, wie sie durch die Verengung Array verarbeiten. A. digitalisierten Bild ist auf der Video-Quelle überlagert, um die Position der Zellen zeigen B. Differenzbild;. C. Bottom Hut gefilterte Bild, D. Median gefiltert.
Figur 6. Repräsentative Laufzeitmessungen in Abhängigkeit von der Verengung Nummer. A. HL-60-Zellen eine längere Laufzeit durch die erste Verengung als B. ATRA behandelten HL-60 (Neutrophilen-Typ-Zellen). Ein Vergleich der Durchgangszeit transformiert (log10) durch die erste Einschnürung, wie unter Verwendung des nichtparametrischen Mann-Whitney-Test bewertet zeigt dieUnterschied ist signifikant, p = 1.47E-5. Zellen in der Regel die Durchreise durch die erste Engstelle langsamer als die nachfolgenden Verengungen. Daten werden hier für Zellen im Transit durch 7 um weiten Verengungen bei einem Antriebsdruck von 28 kPa gezeigt. Zelldichte, mittlere Zelldurchmesser und Tensidkonzentration sind in Tabelle 1 HL-60, N = 77. ATRA behandelten HL-60, N = 97. Die Ergebnisse in unabhängigen Experimenten im Laufe von 3 verschiedenen Tagen wiederholt.
Abbildung 7: Übersicht über die MATLAB-Skript für die Messung der Laufzeit. Die erste Schleife erfordert Benutzereingriff und Beobachtung für die ersten 50 Rahmen für jede Video. Nach der ersten Schleife, wird das gesamte Programm ohne Benutzereingriff ausgeführt und automatisch kompiliert und Grundstücke Bevölkerungsdaten.
Tabelle 1. Zuvor studierte Zellsystemen und deren Betriebsbedingungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieten wir eine umfassende experimentelle Verfahren zur Analyse der Verformung von Zellen im Transit durch schnürt mikrofluidischen Kanälen mit druckgetriebenen Strömung. Ein MATLAB-Skript ermöglicht die automatisierte Datenverarbeitung (ergänzendes Material); eine aktualisierte Version des Codes eingehalten wird ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Im weiteren Sinne können die hier vorgestellten Techniken in vielen Zellbasis mikrofluidischen Tests angepasst werden, einschließlich der Wirkung der Zytoskelett-und Kernversteifungsmittel 24,23 sowie Testen der Verformbarkeit von Krebszelltypen 4,5. Zusammen mit einer höheren Auflösung Mikroskopie Bild subzellulärer Verformungen genommen, bietet diese Methode einen leistungsfähigen Ansatz, um die Zell mechanischen Eigenschaften und Veränderungen, die in physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten zu studieren.
Automatische Zellverarbeitungsalgorithmus
7 beschrieben, und der Satz von MATLAB-Funktionen ist in der Zusatzinformation bereitgestellt. Kurz gesagt, wird der Benutzer angewiesen, alle Videos auswählen, um zu analysieren; Ernte jedes Video für die Region von Interesse; und geben Sie einen Frame-Rate für den Satz von Videos; Danach wird die Software automatisch verarbeitet Videodaten, die Laufzeit jeder Zelle für jede Verengung bestimmen. Es gibt gewisse Anforderungen an das Skript zu bedienen: Zellen aus der ersten Zeile der Rahmen an der Unterseite des Rahmens in dem Video zu fließen; Mikrofluidische Vorrichtung Position und die Beleuchtungsbedingungen nicht nennenswert über die Dauer des Video ändern; und Videos sollten in AVI-Format vorliegen. Wichtig ist, umfasst das Verfolgungsalgorithmus Zellen, die sowohl ein und Durchgang in dem Zeitfenster von einer einzelnen Videoaufnahme, die etwa 8 sec ist. Daher ist jedeObjekte, die eine längere Laufzeit haben, werden von der Analyse ausgeschlossen. Durch Ausführen Untergrundsubtraktion werden Objekte, die während der gesamten Video vorliegen aus der Analyse entfernt. Der Code implementiert auch eine geringere Größe Cutoff, die vom Benutzer eingestellt werden kann. Die Größe der Abschneidefrequenz für die Videoanalyse betrug 5 Pixel entspricht einem Zelldurchmesser von 2,7 um.
Da die High-Speed-Video-Daten-Dateien können groß sein können (~ 500 MB), das Programm ist sehr rechenintensiv. Code wird am effizientesten laufen mit einem Desktop-Computer mit mindestens 6 GB RAM und einer 64-Bit-Chipsatz mit einem lokalen Festplattenlaufwerk mit mindestens einer 1 TB Kapazität oder mit einem großen externen Festplatte oder Datenserver mit einem USB-3.0-Schnittstelle , FireWire oder Ethernet-Verbindung. Daten werden in einem Histogramm Format für schnelle Visualisierung der Ergebnisse; wird es auch als Daten, die in einem MATLAB (.mat) Datendatei und in einer Excel-Tabelle gespeichert ist tabellarisch dargestellt.
Der Code, der presented bietet einen einfachen Weg, um Zellpopulationen durch Analyse der Laufzeit für Zellen um einen Durchgang durch jede Einschnürung zu vergleichen. Für eine genauere Analyse, könnte der Code erweitert werden, um andere Parameter wie Zellgröße, Seitenverhältnis, sowie Entspannung Zeitskala zu untersuchen. Frühere Studien zeigen, nur eine schwache Abhängigkeit der Zellgröße auf Laufzeit 6.
Gerätebezogene Fallstricke
Verstopfte Kanäle sind ein großes Hindernis in jeder Strömungsexperiment. Zelladhäsion an der Gerätewand wird die Strömung der Zellen durch die verengten Kanäle beeinträchtigen: Zellen beobachtet, um entlang der Kanalwände verschmieren werden. Um die Haftung zu vermeiden, ist die richtige Oberflächenbehandlung mit F-127 notwendig.
Die Oberflächeneigenschaften des PDMS Änderung mit der Zeit nach der Plasmabehandlung, das die PDMS vorübergehend hydro 25,26 macht. Im Verlauf von einer Woche, hydrophile Oberflächen PDMS langsam dezu erzeugen, um ihre natürliche hydrophobe Oberflächenenergie; Dies kann die Entfernung von Luftblasen durch die Kanäle herausfordern. Geräte sollten also innerhalb von sieben Tagen nach der Plasmabehandlung verwendet werden. Am wichtigsten ist, sollte die Zeit zwischen der Plasmabehandlung und der Verformbarkeit Test konsistent in allen Experimenten.
Während wir erfolgreich Laufzeiten zwischen verschiedenen Zelltypen mit Hilfe von Geräten mit Glasboden und drei Wände PDMS hergestellt aus, können die Geräte auch hergestellt werden, so dass sie gleichmäßige Oberflächeneigenschaften auf allen vier Kanalwände 27 haben. Die PDMS Vorrichtung auf ein Glassubstrat mit einer dünnen Schicht aufgeschleudert PDMS gebunden werden: Mischungs Härtungsmittel in einem Verhältnis von 1 zu stützen: 5 (w / w), gieße auf dem Gerät Form und Heilung für 20 min bei 65 ° C . Inzwischen Schleuderbeschichtung eine dünne Schicht von 1:20 (w / w), Härtungsmittel auf das Glassubstrat zu stützen; backen bei 85 ° C für 4 min. Legen Sie die PDMS-Gerät auf dem PDMS-beschichteten Objektträger und Fertigbacken über Nacht, um die Verbindung zu beenden. Dieses Verfahren ist auch nützlich, wenn ein Plasma-Gerät für Glas-PDMS-Bindung nicht vorhanden ist.
Zellbezogene Fallstricke.
Henne Herstellung der Zellsuspension, die Dichte der Zellen kritisch: wenn die Zelldichte zu niedrig ist, wird Zelle Transit Ereignisse selten sein; Wenn die Zelldichte zu hoch ist, wird es mehrere Zellen Passagieren einen einzigen Kanal übertragen, wird der Druckabfall über eine einzelne Zelle nicht einheitlich sein, und es wird schwierig sein, einzelne Zellen mit einer automatisierten Prozedur zu beschreiben.
Während Experimente werden typischerweise innerhalb von 30 min von Zellsuspensionen hergestellt, die durchgeführt wird, können die Zellen auf dem Boden der Druckkammer über längere Zeit von> 30 min absetzen. Für die Beilegung von über längere Zeiträume zu vermeiden, kann die Druckkammer und Verbindungsschlauch regelmäßig gedreht werden. Für längere Experimente, kann eine kleine magnetischen Rührstab, die CE hinzugefügt werdenll Suspension mit einer Aufsehen Platte unterhalb der Druckkammer, um die Zellen zu agitieren und zu verhindern, Absetzen positioniert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Lloyd Ung für konstruktiven Input in frühen Versionen dieser Technik anerkennen, Dr. Jeremy Agresti für Druckdeckel Design-Tipps und Dr. Dongping Qi für seine Hilfe bei der Herstellung der Druckkappe. Wir sind dankbar, dass die Labors von M. und P. Teitell Gunaratne für die Bereitstellung einer Vielzahl von Zellproben zum Testen. Wir danken der National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), der UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center und der UCLA klinische und translationale Wissenschaft Institut für die Unterstützung dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
