Summary
हम माइक्रोन पैमाने संकोचनों के एक दृश्य के माध्यम से पारगमन के लिए कोशिकाओं के लिए timescale को मापने के लिए एक microfluidics आधारित परख प्रदर्शित करता है.
Abstract
यहाँ एक कुशल तरीके से व्यक्ति की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के विरूपता का मूल्यांकन करने के लिए विस्तार से एक microfluidic डिवाइस के डिजाइन, निर्माण, और उपयोग हम. आमतौर पर, ~ 10 2 कोशिकाओं के लिए डेटा एक 1 घंटा प्रयोग के भीतर प्राप्त किया जा सकता है. एक स्वचालित छवि विश्लेषण कार्यक्रम के कुछ ही घंटों के भीतर पूरा होने की प्रोसेसिंग को सक्षम करने, छवि डेटा की कुशल के बाद प्रयोग के विश्लेषण में सक्षम बनाता है. हमारे उपकरण ज्यामिति कोशिकाओं जिससे प्रारंभिक विरूपण और व्यक्ति की कोशिकाओं के समय पर निर्भर छूट assayed हो, सक्रिय करने के माइक्रोन पैमाने संकोचनों की एक श्रृंखला के माध्यम से ख़राब चाहिए कि अद्वितीय है. मानव प्रोम्येलोच्य्टिक ल्यूकेमिया (एच एल -60) कोशिकाओं को इस पद्धति के प्रयोग का प्रदर्शन किया है. दबाव संचालित प्रवाह का उपयोग माइक्रोन पैमाने संकोचनों के माध्यम से ख़राब कोशिकाओं ड्राइविंग, हम मानव प्रोम्येलोच्य्टिक (एच एल -60) कोशिकाओं क्षण भर बाद कसना के माध्यम से और अधिक जल्दी passaging पहले 9.3 मिसे के एक औसत समय के लिए पहले कसना रोक देना कि निरीक्षणकसना प्रति 4.0 मिसे के एक औसत पारगमन समय के साथ आयनों. इसके विपरीत, सब पार retinoic एसिड का इलाज (न्युट्रोफिल प्रकार) एच एल -60 कोशिकाओं 3.3 मिसे के एक औसत पारगमन समय के साथ बाद संकोचनों के माध्यम से passaging से पहले केवल 4.3 मिसे के लिए पहली कसना रोक देना. इस विधि कोशिकाओं के viscoelastic प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और अंत में इस व्यवहार की आणविक मूल प्रकट कर सकते हैं.
Introduction
सेल आकार में परिवर्तन कई जैविक संदर्भों में महत्वपूर्ण हैं. उदाहरण के लिए, एरिथ्रोसाइट्स और leukocytes अपने स्वयं व्यास 1 से छोटे हैं कि केशिकाओं के माध्यम से ख़राब. मेटास्टेसिस में, कैंसर की कोशिकाओं को माध्यमिक साइटों 2 में बीज के लिए संकीर्ण बीचवाला अंतराल के साथ ही कपटपूर्ण vasculature और लसीका नेटवर्क के माध्यम से ख़राब करना होगा. व्यक्ति की कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार की जांच करने के लिए, microfluidic उपकरणों उनकी क्षमता संकीर्ण अंतराल 3 के माध्यम से विस्थापित करने के लिए और निष्क्रिय माइक्रोन पैमाने संकोचनों 3 से 9 तक ख़राब करने सहित सेल व्यवहार की एक श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक आदर्श मंच प्रस्तुत करते हैं. Polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic उपकरणों सेल विकृतियों प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना और बुनियादी छवि प्रसंस्करण उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा के लिए सक्रिय करने, ऑप्टिकली पारदर्शी हैं. इसके अलावा, संकोचनों की सरणियों ठीक एक साथ एक साथ कई कोशिकाओं का विश्लेषण सक्षम करने से परिभाषित किया जा सकता हैकई मौजूदा तकनीक 10,11 से अधिक throughput.
यहाँ हम 'सेल deformer' PDMS microfluidic डिवाइस का उपयोग सेल विरूपता की जांच के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. डिवाइस बनाया गया है अनुक्रमिक संकोचनों के माध्यम से कोशिकाओं बीतने इतना है कि; इस ज्यामिति ऐसे 12 बिस्तर फेफड़े केशिका के रूप में शारीरिक संदर्भों में आम है. सेल विरूपता गेज, पारगमन समय आसानी से एक भी कसना 4,6 के माध्यम से पारगमन के लिए एक व्यक्ति के सेल के लिए आवश्यक समय के रूप में मापा जाता है कि एक सुविधाजनक मीट्रिक प्रदान करता है. सेल पारगमन के दौरान constricted चैनलों में एक निरंतर दबाव ड्रॉप बनाए रखने के लिए, हम दबाव संचालित प्रवाह का उपयोग करें. हमारी प्रोटोकॉल कोशिकाओं संकोचनों की एक श्रृंखला के माध्यम से ख़राब करने के लिए समय को मापने के लिए दबाव संचालित प्रवाह, तैयारी और कोशिकाओं की इमेजिंग, साथ ही छवि प्रसंस्करण द्वारा डिवाइस डिजाइन और निर्माण, डिवाइस ऑपरेशन पर विस्तृत निर्देश शामिल हैं. हम शामिलडिवाइस डिजाइन और पूरक फ़ाइलों के रूप में दृष्टि डाटा प्रोसेसिंग कोड दोनों. डेटा के एक प्रतिनिधि नमूने के रूप में, हम passaged संकोचनों की संख्या के एक समारोह के रूप में संकोचनों की एक श्रृंखला के माध्यम से सेल पारगमन समय दिखा. पारगमन के लिए कोशिकाओं के लिए timescale का विश्लेषण एक microfluidic डिवाइस की संकीर्ण संकोचनों प्रकार की कोशिकाओं 4,5,13 की एक किस्म की विरूपता में मतभेद प्रकट कर सकते हैं, हालांकि. यहां प्रदर्शन युक्ति विशिष्ट माइक्रोन पैमाने संकोचनों की एक श्रृंखला के माध्यम से सेल पारगमन सर्वेक्षण; इस डिजाइन कोशिकाओं के संचलन में अनुभव और भी इस तरह के विश्राम का समय के रूप में कोशिकाओं के अतिरिक्त शारीरिक विशेषताओं की जांच में सक्षम बनाता है कि कपटपूर्ण पथ emulates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 microfluidic युक्ति डिजाइन
नोट: प्रवेश बंदरगाह, सेल फिल्टर, कसना सरणी, और निकास बंदरगाह (चित्रा 1): डिवाइस डिजाइन चार बुनियादी कार्यात्मक क्षेत्रों है. समग्र डिजाइन आयामों को मामूली समायोजन के साथ, सेल प्रकार की एक विस्तृत सरणी के लिए लागू किया जा सकता है. दोनों को प्राथमिक और अमर कोशिकाओं के चयन के लिए प्रभावी रहे हैं कि डिवाइस मापदंडों के साथ कुछ बुनियादी डिजाइन सिफारिशों यहाँ हैं प्रदान की.
- औसत सेल व्यास का लगभग 30-50% होने की कसना सरणी चैनल (चित्रा 1 बी) की चौड़ाई का चयन करें; महत्वपूर्ण सेल विरूपण लेकिन न्यूनतम clogging में इस कसना के लिए सेल आकार के अनुपात का परिणाम है. पहले से परीक्षण नहीं किया गया है कि एक सेल प्रकार को देखते हुए यह ~ 30-50% से इष्टतम चौड़ाई को खोजने के लिए सेल व्यास कसना चौड़ाई की एक श्रृंखला डिजाइन करने के लिए समझदारी है. Microfluidic उपकरणों के कई प्रकार के साथ के रूप में, 120 से अधिक डिवाइस मास्टर नए नए साँचे एक पाप पर नमूनों किया जा सकता हैअलग डिवाइस डिजाइन की एक सरणी सक्षम करने GLE 4 इंच सिलिकॉन वेफर, एक भी निर्माण की प्रक्रिया में गढ़े होंगे.
- सेल व्यास के कम से कम 50% करने के लिए चैनल ऊंचाई का चयन करें; इस सेल 2 आयामों में ही सीमित है सुनिश्चित करता है. (: चौड़ाई ऊंचाई) युक्ति भर संबंधों के दौरान चैनल पतन को रोकने के लिए, चैनल पहलू अनुपात कम नहीं 1:10 से है कि यह सुनिश्चित करें. , इस पहलू अनुपात से अधिक पतन को रोकने के लिए समर्थन पदों को जोड़ना होगा कि चैनलों के लिए. सेल प्रवाह बाधित नहीं करने के रूप में कम से कम दो बार सेल व्यास है कि दूरी पर अंतरिक्ष समर्थन पदों.
- सेल समूहों (चित्रा 1 बी) मलबे को हटाने और disaggregate के लिए प्रवेश बंदरगाहों पर एक फिल्टर को शामिल करें. पदों को अलग दूरी से एक सेल व्यास के लगभग बराबर है इतना है कि फिल्टर पदों के आकार और रिक्ति समायोजित करें.
नोट: सुविधा आकार की निचली सीमा लिथोग्राफी मुखौटा छपा हुआ है, जिस पर संकल्प द्वारा निर्धारित है. सभी सुविधाओं को जोड़कर भीतर हैं कि सुनिश्चित करेंमुखौटा आपूर्तिकर्ता द्वारा निर्दिष्ट olution सीमा.
2 आपूर्ति और तैयारी
नोट: किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले, निम्न आइटम तैयार रहना चाहिए. पूरे सेटअप के एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिया जाता है.
- Lithographic micromachining 14,15 के लिए मानक तकनीक का उपयोग कर डिवाइस गुरु बनाना. एक profilometer का उपयोग नमूनों सुविधाओं की ऊंचाई की जाँच करें.
नोट: स्वामी आसानी से एक cleanroom सुविधा में निर्मित किया जा सकता है, कुछ प्रयोगशालाओं एक अर्द्ध स्वच्छ वातावरण 16,17 में उपयोग के लिए सस्ती लिथोग्राफी तरीके विकसित किया है. - संपीड़ित हवा और हवा नियामकों और फिटिंग (चित्रा 1 ए) के अनुक्रम का एक टैंक का उपयोग, दबाव संचालित प्रवाह के लिए हवा स्रोत तैयार करें.
- एक हवा की आपूर्ति टैंक और मार्गदर्शन नियामक की स्थापना की.
नोट: हवा में 5% की एक रचना, सीओ 2 एक ठेठ सेल संस्कृति incubato रूप में एक समान वातावरण बनाए रखता हैअनुसंधान, लेकिन अन्य गैस के मिश्रण का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - पुस्तिका नियामक के साथ लाइन में एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित दबाव नियामक की स्थापना की. कम से कम 2 किलो पास्कल के दबाव उतार चढ़ाव के साथ, विनियमित और चैनलों में एक स्थिर दबाव ड्रॉप बनाए रखने के लिए एक विद्युत वायवीय कनवर्टर का उपयोग करें. इनपुट के लिए LabVIEW में लिखा सरल कोड (पूरक जानकारी) वांछित दबाव का प्रयोग करें.
नोट: विद्युत वायवीय कनवर्टर microfluidic युक्ति भर में निर्दिष्ट दबाव मैच के लिए वाल्व आउटलेट दबाव को समायोजित करने के लिए एक आंतरिक प्रतिक्रिया पाश का उपयोग करता है. - सेल निलंबन के प्रवाह को ड्राइव करने के लिए एक दबाव कक्ष की स्थापना की. ट्यूब कोशिकामापी एक मानक प्रवाह और ट्यूब पर एक दबाव से तंग सील बनाता है कि एक machined टोपी के बाहर एक सेल निलंबन कक्ष इकट्ठे.
नोट: (Figur कोशिकाओं डिवाइस में दबाव कक्ष से प्रवाह के माध्यम से जो संपीड़ित हवा टैंक को जोड़ता है कि एक इनलेट, और एक दुकान: दबाव चैम्बर टोपी दो orifices शामिलई 2).
- एक हवा की आपूर्ति टैंक और मार्गदर्शन नियामक की स्थापना की.
- कसना सरणी के माध्यम से बह कोशिकाओं की छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रति सेकंड कम से कम 100 फ्रेम के एक अधिग्रहण दर है कि एक कैमरा के साथ लगे एक औंधा माइक्रोस्कोप सेट करें. एक वीडियो पर कब्जा कार्ड और एक कंप्यूटर के साथ कैमरा इंटरफेस.
- PDMS दीवारों से कोशिका आसंजन को कम करने में मदद मिलेगी सेल मीडिया समाधान के लिए F127 की एक छोटी राशि जोड़ने के रूप में Pluronic एफ 127 W / फॉस्फेट बफर खारा में (पीबीएस) डब्ल्यू 10% के एक शेयर surfactant समाधान तैयार करें. F127 भंग करने के लिए धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर F127 समाधान, भंवर और गर्मी तैयार करने के लिए. , का उपयोग एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान के पास है और कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए पहले. 24 से अधिक घंटे के लिए रहेंगे कि बुलबुले उत्पन्न होगा vortexing और छानने के रूप में अग्रिम में surfactant समाधान तैयार करें.
3 microfluidic डिवाइस निर्माण
- Microfluidic चैनलों के साथ PDMS ब्लॉक बनाना.
- मिक्स PDMS अच्छी तरह से एक1:10 के टा अनुपात (डब्ल्यू डब्ल्यू /) आधार को इलाज के एजेंट.
- डिवाइस मास्टर (2.1 कदम) के ऊपर मिश्रण डालो. फँस बुलबुले जब तक एप्लाइड वैक्यूम के साथ एक बेल जार में देगास गायब, या के बारे में 10-20 मिनट के लिए.
नोट: इस समय के बाद, अभी भी सामान्य है जो एयर PDMS इंटरफ़ेस, पर बुलबुले वहाँ हो सकता है; ये आम तौर पर पाक के दौरान नष्ट करना होगा. यह चैनलों के निकट कोई शेष बुलबुले हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है. - 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर degassed डिवाइस सेंकना. ढहने से चैनलों को रोकने के लिए, आगे चैनल पतन के लिए प्रतिरोधी है कि एक उच्च लोचदार मापांक के साथ एक डिवाइस के लिए PDMS crosslink करने के लिए रात भर डिवाइस सेंकना. हालांकि, पाक बढ़ाया कि नोट भी PDMS embrittles और छेद (3.3 चरण) छिद्रण जब खुर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
- मास्टर मोल्ड से microfluidic उपकरणों निकालें. एक धार के साथ PDMS ब्लॉक के बाहर व्यक्तिगत microfluidic उपकरणों कट और मस्तूल से डिवाइस को दूरइंजी. धीरे डिवाइस के एक कोने से उठाने के द्वारा शुरू करो; सीधे PDMS ब्लॉक उठाने के लिए विरोध के रूप में धीमी और कोमल छीलने, PDMS और मास्टर दोनों पर तनाव कम कर देता है.
- PDMS डिवाइस में पंच छेद ट्यूबिंग और microchannels के बीच पहुँच के लिए कनेक्शन बंदरगाहों बनाने के लिए. एक बायोप्सी पंच का उपयोग छेद बना, और डिवाइस के बाहरी तरफ के माध्यम से चैनल की ओर से पंच.
नोट: एक 0.75 एमएम बोर आकार के साथ एक बायोप्सी पंच polyetheretherketone के साथ पूरी तरह से छेद (तिरछी) ट्यूबिंग (बाहरी व्यास = 1/32 "या 0.79 मिमी) या पॉलीथीन टयूबिंग (पीई-20, बाहरी व्यास = 0.043" या 1.09 मिमी कि इंटरफेस बनाता है ). उथले चैनल 18 के साथ उपकरणों में छेद कल्पना में मदद करने के लिए एक अंगूठी प्रकाश का प्रयोग करें. बायोप्सी पंच तेज है सुनिश्चित करें; बाद अत्याधुनिक dulls प्रयोग दोहराया और बायोप्सी पंच त्याग और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. - PDMS की धूल और दर्ज कराई हिस्सा हटाने के लिए isopropanol (HPLC ग्रेड) के साथ PDMS डिवाइस कुल्ला. सुनिश्चित करेंछिद्रित छेद छेद के माध्यम से एक निचोड़ बोतल से शुद्ध isopropanol की एक सतत स्ट्रीम निर्देशन से मलबे के स्पष्ट हैं. फ़िल्टर्ड हवा के साथ सूखे उड़ा. सफाई के बाद, चैनल के साथ जगह PDMS ब्लॉक युक्ति सफाई बनाए रखने के लिए एक साफ पेट्री डिश में सामना. संबंधों में जब तक इस रूप में, दुकान उपकरणों के लिए आवश्यक हैं.
- , मेथनॉल (HPLC ग्रेड) के साथ rinsing द्वारा कांच सब्सट्रेट साफ फ़िल्टर्ड हवा के साथ सूखी झटका, और कांच प्लाज्मा उपचार से पहले पूरी तरह से साफ और शुष्क है यह सुनिश्चित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए एक 200 डिग्री सेल्सियस hotplate पर जगह है.
नोट: ग्लास सब्सट्रेट प्रत्येक चैनल के नीचे रूपों. एक 10x या 20x उद्देश्य समानांतर में कई चैनलों इमेजिंग के लिए आदर्श है, क्योंकि आम तौर पर एक गिलास स्लाइड, suffices. उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए, एक coverslip (# 1.5 मोटाई) को युक्ति बांड. - ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए PDMS डिवाइस बंधन.
- ऑक्सीजन प्लाज्मा चैनल PDMS ब्लॉक की तरफ और एक गिलास स्लाइड के 1 पक्ष का इलाज.
नोट: डब्ल्यूएक हाथ से आयोजित निर्वहन इकाई ith, 1 मिनट के उपचार के समय का उपयोग करें, लेकिन प्रत्येक ऑक्सीजन प्लाज्मा तंत्र के लिए उपचार समय का अनुकूलन. - तुरंत उपचार के बाद कांच का इलाज पक्ष के शीर्ष पर PDMS के चैनल पक्ष रखें.
- के लिए प्रकाश दबाव ~ के साथ संबंधों को बढ़ावा देने के लिए 10 सेकंड पकड़ो. कम से कम 15 मिनट के लिए एक ऊंचा तापमान (60-80 डिग्री सेल्सियस) पर पूरे डिवाइस सेंकना बंधन शक्ति में सुधार करने के लिए.
- ऑक्सीजन प्लाज्मा चैनल PDMS ब्लॉक की तरफ और एक गिलास स्लाइड के 1 पक्ष का इलाज.
4 constricted चैनलों के माध्यम से कोशिकाओं deforming
- एक खुर्दबीन के नीचे microfluidic डिवाइस का निरीक्षण किया. चैनल ढह गई या टूट नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करें और दोनों इनलेट और आउटलेट छेद एक कम बिजली उद्देश्य (10X) का उपयोग कर डिवाइस चैनलों में सीधे कनेक्ट. एक धार के साथ PDMS की सतह स्कोरिंग द्वारा दोषपूर्ण उपकरणों निर्धारित करते हैं और प्रयोगों के लिए उन्हें प्रयोग नहीं करते.
- सेल संस्कृति के नमूने तैयार assayed हो. मानक स्थितियों का उपयोग संस्कृति कोशिकाओं.
- एफया उदाहरण, 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 5% में 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक RPMI 1640 मध्यम में संस्कृति एच एल-60 कोशिकाओं.
- पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, ताजा मध्यम विकास में trypsinization और resuspend द्वारा उन्हें फसल. एक मानक trypsinization प्रोटोकॉल का उपयोग; उदाहरण के लिए, 25 सेमी 2 संस्कृति के क्षेत्र के साथ एक फ्लास्क ~ 0.5 मिलीलीटर trypsin जोड़ने, और ~ 30 मिलीलीटर ताजा मध्यम में resuspend. पहले 19,20 वर्णित के रूप में 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल प्रति 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में सब पार retinoic (ATRA) द्वारा न्युट्रोफिल प्रकार की कोशिकाओं में एच एल -60 कोशिकाओं को अलग.
- अपकेंद्रित्र 3 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं, ध्यान से 0.1% वी / वी एफ 127 के साथ ताजा संस्कृति के माध्यम में उचित अंतिम घनत्व सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं महाप्राण.
- एक कल्टर काउंटर, hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, या कोशिकामापी प्रवाह. 1 एक्स 10 6 10 x 5 के घनत्व को सेल निलंबन समायोजित
नोट: सेल घनत्व और surfactant एकाग्रता विशेष सेल प्रणाली के आधार पर संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है, 1 टेबल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं और एफ 127 की पहले से इस्तेमाल किया सांद्रता का एक रिकॉर्ड प्रदान करता है. - ट्यूब कोशिकामापी एक प्रवाह में सेल निलंबन प्लेस और दबाव टोपी से कनेक्ट. सेल निलंबन ट्यूबिंग की नोक से उभर तक microfluidic डिवाइस के लिए ट्यूबिंग जोड़ने से पहले, के बारे में 14-21 kPa के लिए दबाव और फ्लश समायोजित. इस ट्यूबिंग और डिवाइस में हवाई बुलबुले को कम करने में मदद मिलेगी.
- डिवाइस इनलेट में सेल निलंबन युक्त ट्यूबिंग की नोक डालें. डिवाइस एक coverslip को बंधुआ है, तो ऐसे ट्यूबिंग जोड़ने से पहले खुर्दबीन मंच के रूप में एक फ्लैट, ठोस सतह पर डिवाइस जगह; coverslip नाजुक है और अन्यथा भंग हो सकता है.
- ट्यूबिंग पूर्णांक के एक टुकड़े डालेंकचरे के संग्रह के लिए एक खाली ट्यूब में बाहर निकलने के बंदरगाह और यह मार्ग ओ ऐसे खुर्दबीन मंच की ओर करने के लिए टेप एक खाली फाल्कन ट्यूब के रूप में. प्रयोगों के बीच डिवाइस के समग्र fluidic प्रतिरोध में स्थिरता के लिए, प्रवेश और दुकान ट्यूबिंग एक प्रयोग के लिए एक ही व्यास और लगभग एक ही लंबाई की है कि यह सुनिश्चित करें.
- धीरे लगभग 28 किलो पास्कल या कोशिकाओं चैनलों के माध्यम से प्रवाह जब तक दबाव रैंप. कि कई चैनलों को देखने के क्षेत्र में हैं और स्क्रीन के नीचे करने के लिए सीधा कर रहे हैं तो डिवाइस स्थिति. कैमरा डेटा आकार के द्वारा सीमित है, तो स्वतंत्र डेटा बिंदुओं की एक पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए कई वीडियो हासिल. वांछित डेटा उत्पादन के लिए आवश्यक के रूप में फ्रेम दर को समायोजित करें. प्रति सेकंड 300 फ्रेम (एफपीएस) पर उच्च गति इमेजिंग का उपयोग, सेल आकार में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए; , कोशिकाओं के पारगमन समय को मापने के लगभग 100 एफपीएस के फ्रेम दर का उपयोग करने के लिए.
5 डेटा विश्लेषण
- फ़ाइल मस्त खोलेंer_script.m (डाउनलोड पूरक फ़ाइल) और कार्यक्रम चलाते हैं.
- पहले वीडियो चुनें प्रतीत होता है कि Windows Explorer विंडो से विश्लेषण किया जा सके. चयनित वीडियो के लिए फ्रेम दर निर्दिष्ट करें और प्रेस दर्ज करें.
ध्यान दें: एक आंकड़ा है कि पहला वीडियो के लिए एक आयताकार फसल खिड़की का चयन करने के लिए उपयोगकर्ता प्रेरित दिखाई देगा. - बाएं से दाएं सभी चैनल शामिल हैं और बस के ऊपर और नीचे (चित्रा 3) पर चैनलों की सरणी के पहले बल्ब ऊपर चैनलों intersects कि एक खिड़की का चयन करें.
- फसली छवि से कसना क्षेत्रों का चयन करें. चयनित हर वीडियो के लिए ऊपर और नीचे खिड़की सीमा के बीच एक निश्चित पिक्सेल दूरी बनाए रखने के लिए विशेष ध्यान दे.
नोट: शीर्ष खिड़की किनारे सर्वोच्च कसना और नीचे खिड़की किनारे निर्दिष्ट नीचा कसना (चित्रा 4) निर्दिष्ट करता है; मध्यवर्ती संकोचनों इस उपयोगकर्ता इनपुट से approximated कर रहे हैं. अगला, एल्गोरिथ्म है को प्रदर्शित करता हैप्रत्येक वीडियो के पहले 50 फ्रेम के लिए कोशिकाओं की egmentation (चित्रा 5). - एल्गोरिथ्म सही ढंग से कोशिकाओं लगाने है तो यह निर्धारित करने के लिए बारीकी से ऊपर छोड़ दिया छवि (चित्रा 5A) की निगरानी; एक binarized छवि पहचान कोशिकाओं के स्थान प्रदर्शित करने के लिए स्रोत वीडियो पर आरोपित है.
नोट: विभिन्न खिड़कियों, (आंकड़े 5 ब-5D) कोड निदान के लिए कर रहे हैं और विशिष्ट छवि प्रसंस्करण आपरेशन के बाद वीडियो फ्रेम प्रदर्शित करता है. - अगले वीडियो का चयन करें Windows Explorer विंडो से संसाधित करने के लिए.
नोट: दोहराना होगा एल्गोरिथ्म चयनित प्रत्येक वीडियो के लिए 5.2-5.5 कदम. - रद्द चुन लेते हैं सभी वांछित वीडियो वीडियो सूची पूरा हो गया है कि समारोह हिदायत करने के लिए Windows Explorer विंडो के माध्यम से जोड़ दिया गया है.
नोट: एल्गोरिथ्म उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना शेष आपरेशन प्रदर्शन करेंगे. यह संसाधित वीडियो और कंप्यूटर पीई की संख्या के आधार पर लगभग 1-2 घंटे का समय लगेगाrformance. पूरा होने पर, एल्गोरिथ्म पारगमन समय डेटा की एक हिस्टोग्राम का उत्पादन होगा और एक MATLAB चटाई फाइल और एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल .xls फ़ाइल के रूप में निर्देशिका में डेटा को बचाने के.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, मानव माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं (एच एल -60), भेदभाव न्युट्रोफिल कोशिकाओं, माउस लिम्फोसाइट कोशिकाओं, और मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों (OVCAR8, HEYA8) की विरूपता की जांच करने के लिए 'सेल deformer' microfluidic तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है. चित्रा 6 में दिखाया गया है एच एल -60 और न्युट्रोफिल प्रकार एच एल -60 कोशिकाओं के पारगमन समय के लिए प्रतिनिधि परिणाम, संकोचनों की एक श्रृंखला के माध्यम से पारगमन के लिए एक एकल कक्ष के लिए timescale दिखा. ट्रांजिट समय व्यक्ति की कोशिकाओं की आबादी में लिए मापा जाता है 28 किलो पास्कल (चित्रा 6) की एक ड्राइविंग दबाव में 7 संकोचनों की एक श्रृंखला में प्रत्येक 7 माइक्रोन कसना.
चित्रा 6 में दिखाया गया है, एच एल -60 कोशिकाओं अस्थायी रूप से बाद में संकोचनों के माध्यम से passaging पहले 9.3 मिसे के एक औसत समय के लिए पहले कसना रोक देना. इसके विपरीत, न्युट्रोफिल प्रकार एच एल -60 कोशिकाओं केवल 4.3 मिसे के लिए पहली कसना से पहले रोक देनाpassaging. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी 21 और micropipette आकांक्षा 22 द्वारा निर्धारित एच एल -60 कोशिकाओं का कम पारगमन समय, उनके कम लोचदार और चिपचिपा moduli के साथ संगत है. इन परिणामों भी माइक्रोन पैमाने अंतराल 23 के माध्यम से कोशिकाओं के पारगमन समय निर्धारित जो mechanoregulating प्रोटीन, lamin ए के कम स्तर के साथ संगत कर रहे हैं. एक बार पहले कसना के माध्यम से, एच -60 कोशिकाओं के लिए 4.0 मिसे और न्युट्रोफिल प्रकार की कोशिकाओं के लिए 3.3 मिसे के एक औसत पारगमन समय के साथ 2-7 शेष संकोचनों के माध्यम से और अधिक जल्दी कोशिकाओं पारगमन,, (चित्रा 6). एच एल -60 कोशिकाओं को अभी भी थोड़ा लंबा प्रदर्शन लेकिन जबकि महत्वपूर्ण पारगमन टाइम्स (सी 2-C7, पी = 1.7E-9), संकोचनों 2-7 के लिए पारगमन समय का वितरण प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए लगभग समान हैं. पहले कसना लिए आवश्यक लंबे समय तक पारगमन समय का अवलोकन viscoelastic कोशिकाओं को पूरी तरह से अपने प्रारंभिक आकार ओ के लिए आराम नहीं है कि प्रतिबिंबित कर सकते हैंn इन ~ मिसे timescales. यह व्यवहार भी सेल के भीतर विकसित करने, और बाद में माइक्रोन पैमाने अंतराल के माध्यम से अपने पारगमन की सुविधा है कि अपरिवर्तनीय संरचनात्मक परिवर्तन से समझाया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, यहां तक कि पहले कसना के लिए, सेल आबादी के बीच पारगमन समय की तुलना करके, उनके विरूपता 23 में मतभेद प्रकट कर सकते हैं.
प्रयोगात्मक स्थापना की 1 योजनाबद्ध चित्र चित्रा. . प्रवेश बंदरगाह, सेल फिल्टर, कसना सरणी, और निकास बंदरगाह: ए 'सेल deformer' परिधीय कनेक्शन दिखा प्रयोगात्मक सेटअप में डिवाइस बी डिवाइस डिजाइन 4 कार्यात्मक क्षेत्रों है. इसकी मुख्य विशेषताएं दिखा microfluidic डिवाइस की वास्तुकला; इनसेट constricted चैनलों की एक प्रेषित प्रकाश छवि को दर्शाता है. स्केल, 10 μ , एम.
एक कस्टम टोपी के लिए चित्रा 2 इंजीनियरिंग ड्राइंग ट्यूब कोशिकामापी एक प्रवाह में निहित सेल मीडिया पर दबाव डालने के लिए.
वीडियो फ्रेम फसल के लिए ब्याज के क्षेत्र का चयन करने के लिए कैसे की 3 प्रदर्शन चित्रा.
कसना स्थानों का चयन करने के लिए कैसे की 4 प्रदर्शन चित्रा.
51474fig5highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 5 अवलोकन खिड़की वे कसना सरणी के माध्यम से प्रक्रिया के रूप में एल्गोरिथ्म ठीक से सेल स्थानों की पहचान सत्यापित करें कि इस्तेमाल किया. . ए Binarized छवि कोशिकाओं के स्थान को दिखाने के लिए स्रोत वीडियो पर आरोपित बी फर्क छवि है; सी निचला टोपी फ़िल्टर्ड छवि, डी माध्य फ़िल्टर्ड.
चित्रा कसना संख्या के एक समारोह के रूप में 6 प्रतिनिधि पारगमन समय माप. ए एच एल -60 कोशिकाओं बी ATRA इलाज एच एल -60 (न्युट्रोफिल प्रकार) कोशिकाओं से पहले कसना के माध्यम से एक लंबे समय तक पारगमन समय दिखा रहे हैं. Nonparametric मान व्हिटनी परीक्षण का उपयोग का मूल्यांकन के रूप में पहली कसना माध्यम तब्दील बीतने के समय (log10) की तुलना से पता चलता हैअंतर महत्वपूर्ण है, पी = 1.47E-5. कोशिकाओं को आमतौर पर पहली कसना के माध्यम से पारगमन अधिक धीरे से बाद में संकोचनों. डाटा 28 kPa के एक ड्राइविंग दबाव में 7 मीटर चौड़ा संकोचनों के माध्यम से गुजर कोशिकाओं के लिए यहाँ दिखाया गया है. . सेल घनत्व, सेल व्यास, और surfactant एकाग्रता मतलब एच एल -60 तालिका 1 में दी गई, एन = 77 कर रहे हैं; ATRA इलाज एच एल -60, एन = 97 के परिणाम 3 अलग अलग दिनों के दौरान अधिक स्वतंत्र प्रयोगों में दोहराया गया.
पारगमन समय को मापने के लिए MATLAB स्क्रिप्ट के 7 अवलोकन चित्रा. पहला लूप प्रत्येक वीडियो के लिए पहले 50 फ्रेम के लिए उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप और अवलोकन की आवश्यकता है. पहली पाश के बाद, पूरे कार्यक्रम उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना चलाने के लिए और स्वचालित रूप से संकलित और भूखंडों जनसंख्या डेटा जाएगा.
तालिका 1 इससे पहले सेल प्रणाली और उनके परिचालन की स्थिति का अध्ययन किया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ हम दबाव संचालित प्रवाह का उपयोग constricted microfluidic चैनलों के माध्यम से गुजर कोशिकाओं की विकृति का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करते हैं. एक matlab स्क्रिप्ट स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग (पूरक सामग्री) सक्षम बनाता है; कोड का एक अद्यतन संस्करण (बनाए रखा है www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). अधिक मोटे तौर पर, यहाँ प्रस्तुत तकनीकों cytoskeletal के प्रभाव और परमाणु stiffening एजेंट 24,23 के साथ ही कैंसर सेल प्रकार 4,5 की विरूपता परख करने की क्रिया सहित कई सेल आधारित microfluidic assays में रूपांतरित किया जा सकता है. छवि subcellular विकृतियों को उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ साथ में ले ली, इस विधि सेल यांत्रिक गुणों और शारीरिक और रोग की स्थिति में होते हैं कि परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है.
स्वचालित सेल प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म
चित्रा 7 में उल्लिखित है, और MATLAB कार्यों का सेट पूरक जानकारी में प्रदान की जाती है. संक्षेप में, उपयोगकर्ता का विश्लेषण करने के लिए सभी वीडियो का चयन करने के निर्देश दिए है; ब्याज के क्षेत्र के लिए प्रत्येक वीडियो फसल; और वीडियो के सेट के लिए एक फ्रेम दर निर्दिष्ट; इसके बाद, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक कसना लिए प्रत्येक कोशिका के पारगमन समय निर्धारित करने के लिए वीडियो डेटा संसाधित करता है. संचालित करने के लिए स्क्रिप्ट के लिए कुछ आवश्यकताएँ हैं: कोशिकाओं वीडियो में फ्रेम के नीचे करने के लिए फ्रेम के ऊपर से प्रवाह चाहिए; microfluidic युक्ति स्थिति और वीडियो की अवधि से अधिक appreciably परिवर्तन नहीं होना चाहिए प्रकाश व्यवस्था की स्थिति; और वीडियो .AVI प्रारूप में होना चाहिए. महत्वपूर्ण बात है, ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म दोनों लगभग 8 सेकंड है जो एक वीडियो रिकॉर्डिंग के समय खिड़की में भर बीतने कि कोशिकाओं में शामिल हैं. इसलिए, किसी भीएक लंबे समय तक पारगमन समय है कि वस्तुओं के विश्लेषण से बाहर रखा गया है. पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करके पूरे वीडियो भर में मौजूद हैं कि वस्तुओं विश्लेषण से हटा रहे हैं. कोड भी उपयोगकर्ता द्वारा सेट किया जा सकता है जो एक कम आकार कटऑफ, लागू करता है. वीडियो विश्लेषण के लिए आकार कटऑफ 2.7 माइक्रोन से एक सेल व्यास के बराबर 5 पिक्सल था.
उच्च गति वीडियो डेटा फ़ाइलें (~ 500 एमबी) बड़े आकार का हो सकता है, कार्यक्रम गहन computationally है. कोड सबसे अधिक कुशलता से कम से कम 6 जीबी रैम की और एक स्थानीय हार्ड कम से कम एक 1 टीबी क्षमता के साथ ड्राइव या किसी के साथ एक 64 बिट चिपसेट के साथ एक डेस्कटॉप कंप्यूटर का उपयोग कर चलाया जाता है एक यूएसबी 3.0 के साथ एक बड़े बाहरी हार्ड ड्राइव या डेटा सर्वर के साथ interfaced , फायरवायर, या ईथरनेट कनेक्शन. डेटा परिणाम के तेजी से दृश्य के लिए हिस्टोग्राम प्रारूप में उत्पादन होता है; यह भी एक MATLAB (चटाई) डेटा फ़ाइल में है और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में संग्रहीत डेटा के रूप में सारणीबद्ध है.
पीआर है कि कोडesented प्रत्येक कसना के माध्यम से पारित होने के लिए कोशिकाओं के लिए पारगमन समय के विश्लेषण से सेल आबादी की तुलना करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, कोड सेल आकार, पहलू अनुपात, साथ ही विश्राम timescale सहित अन्य मानकों की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है. पिछले अध्ययनों से पारगमन समय 6 पर सेल आकार का केवल एक कमजोर निर्भरता प्रकट करते हैं.
डिवाइस से संबंधित नुकसान
Occluded चैनलों किसी भी प्रवाह प्रयोग में एक प्रमुख बाधा है. डिवाइस दीवारों से कोशिका आसंजन constricted चैनलों के माध्यम से कोशिकाओं के प्रवाह क्षीण होगा: कोशिकाओं चैनल दीवारों के साथ बाहर धब्बा देखा जा सकता है. आसंजन को रोकने के लिए, एफ 127 के साथ उचित सतह के उपचार के लिए आवश्यक है.
25,26 अस्थायी रूप से हाइड्रोफिलिक PDMS renders जो प्लाज्मा उपचार के बाद समय के साथ PDMS परिवर्तन की सतह गुण. एक सप्ताह के दौरान, हाइड्रोफिलिक PDMS सतहों धीरे धीरे डेउनके प्राकृतिक हाइड्रोफोबिक सतह ऊर्जा को उत्पन्न; इस चैनल के माध्यम से हवाई बुलबुले को हटाने को चुनौती दे सकता. डिवाइसेज इस प्रकार प्लाज्मा उपचार के सात दिनों के भीतर किया जाना चाहिए. सबसे महत्वपूर्ण बात, प्लाज्मा उपचार और विरूपता परख के बीच समय सभी प्रयोगों में संगत होना चाहिए.
हम सफलतापूर्वक एक गिलास मंजिल और तीन PDMS दीवारों के साथ निर्मित उपकरणों का उपयोग अलग प्रकार की कोशिकाओं के बीच पारगमन बार प्रतिष्ठित है, जबकि वे सभी चार चैनल दीवारों 27 पर वर्दी सतह गुण है, ताकि उपकरणों को भी निर्मित किया जा सकता है. PDMS डिवाइस एक पतली PDMS परत के साथ spincoated एक ग्लास सब्सट्रेट को बंधुआ जा सकता है: 5 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) डिवाइस मोल्ड पर डालना, और 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए चिकित्सा: 1 के अनुपात के आधार पर करने के लिए इलाज के एजेंट मिश्रण . इस बीच, 1:20 का एक पतली परत spincoat (डब्ल्यू डब्ल्यू /) ग्लास सब्सट्रेट पर आधार करने के लिए इलाज के एजेंट; 4 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना. PDMS लेपित स्लाइड पर PDMS डिवाइस, जगह और रातोंरात पाक खत्मसंबंधों को पूरा करने के लिए. गिलास PDMS संबंधों के लिए एक प्लाज्मा मशीन उपलब्ध नहीं है तो यह विधि भी मूल्यवान है.
सेल से संबंधित नुकसान.
सेल निलंबन की तैयारी मुर्गी, कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है: सेल घनत्व बहुत कम है, तो सेल पारगमन घटनाओं निराला होगा; सेल घनत्व बहुत अधिक है, वहाँ एक साथ एक चैनल passaging कई कोशिकाओं, एक ही सेल में दबाव ड्रॉप संगत नहीं होगा किया जाएगा, और यह एक स्वचालित स्क्रिप्ट के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं को चित्रित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा.
प्रयोगों आमतौर पर सेल निलंबन के 30 मिनट के लिए तैयार किया जा रहा है के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं, कोशिकाओं> 30 मिनट की लंबी बार से अधिक दबाव कक्ष के नीचे करने के लिए व्यवस्थित कर सकते हैं. अब समय समय पर निपटाने से बचने के लिए दबाव चैम्बर और जोड़ने ट्यूबिंग समय समय पर घुमाया जा सकता है. अब प्रयोगों के लिए, एक छोटे चुंबकीय हलचल पट्टी CE करने के लिए जोड़ा जा सकता हैकोशिकाओं को उत्तेजित और निपटाने को रोकने के लिए दबाव चैम्बर के नीचे तैनात एक हलचल थाली के साथ करूँगा निलंबन,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
लेखकों को इस तकनीक के प्रारंभिक संस्करणों में रचनात्मक इनपुट के लिए लॉयड Ung स्वीकार करना चाहते हैं, दबाव टोपी fabricating में उनकी मदद के लिए दबाव टोपी डिजाइन सुझावों के लिए डॉ जेरेमी Agresti, और डॉ Dongping क्यूई. हम परीक्षण के लिए सेल के नमूने की एक किस्म प्रदान करने के लिए एम Teitell और पी गुणरत्ने की प्रयोगशालाओं के लिए आभारी हैं. हम इस काम के समर्थन के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (कैरियर पुरस्कार DBI-1254185), यूसीएलए Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र, और क्लीनिकल यूसीएलए और translational विज्ञान संस्थान के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
