Summary
Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala.
Abstract
Qui noi dettaglio la progettazione, la fabbricazione e l'uso di un dispositivo di microfluidica per valutare la deformabilità di un gran numero di singole cellule in modo efficiente. In genere, i dati per ~ 10 2 cellule possono essere acquisite all'interno di un esperimento di 1 ora. Un programma di analisi delle immagini automatizzata consente efficiente analisi post-esperimento dei dati di immagine, consentendo l'elaborazione di essere completo entro poche ore. La geometria del dispositivo è unico in quanto le cellule devono deformare attraverso una serie di costrizioni micron scala, consentendo in tal modo la deformazione iniziale e rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule da dosare. L'applicabilità di questo metodo per leucemia promielocitica umana (HL-60), le cellule è dimostrata. Cellule Guidando a deformarsi attraverso costrizioni micron scala usando flow-driven pressione, osserviamo che promielocitica umana (HL-60) le cellule momentaneamente occludono la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 msec prima passaging più rapidamente attraverso la successiva costrizioneioni con un tempo di transito medio di 4,0 msec per costrizione. Al contrario, tutto-trans retinoico trattati con acido (neutrofili-tipo) cellule HL-60 occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec prima passaging attraverso le strettoie successivi con un tempo di transito medio di 3,3 msec. Questo metodo può fornire indicazioni sulla natura viscoelastica di cellule, e in ultima analisi rivelano le origini molecolari di questo comportamento.
Introduction
Le variazioni di forma delle cellule sono fondamentali in numerosi contesti biologici. Ad esempio, eritrociti e leucociti deformano attraverso capillari che sono più piccoli di loro diametro 1. In metastasi, le cellule tumorali devono deformare attraverso spazi interstiziali stretti così come vascolare tortuoso e le reti linfatiche per seminare nei siti secondari 2. Per sondare il comportamento fisico delle singole cellule, dispositivi microfluidici presentano una piattaforma ideale che può essere personalizzato per studiare una serie di comportamenti cellulari tra cui la loro capacità di migrare attraverso strette fessure 3 e deformare passivamente attraverso costrizioni micron scala 3- 9. Polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, consentendo deformazioni cellulari per essere osservata con un microscopio ottico e analizzati utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini di base. Inoltre, le matrici di costrizioni possono essere definite con precisione, consentendo l'analisi di più celle contemporaneamente conrendimento che supera molte tecniche esistenti 10,11.
Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per sondare deformabilità cellulare utilizzando il dispositivo di microfluidica 'cellulare Deformatore' PDMS. Il dispositivo è progettato in modo che le cellule passaggio attraverso costrizioni sequenziali; questa geometria è comune in contesti fisiologici, come il capillare polmonare letto 12. Per misurare la deformabilità delle cellule, il tempo di transito fornisce una metrica conveniente che è facilmente misurato come il tempo richiesto per una singola cella di transito attraverso un'unica 4,6 costrizione. Per mantenere una caduta di pressione costante su tutti i canali ristretti durante il trasporto delle cellule, usiamo il flusso di pressione-driven. Il nostro protocollo include istruzioni dettagliate sulla progettazione e fabbricazione del dispositivo, il funzionamento del dispositivo di pressione-driven flusso, la preparazione e l'imaging di cellule, così come l'elaborazione delle immagini per misurare il tempo per le celle a deformare attraverso una serie di costrizioni. Includiamoentrambi i modelli del dispositivo e codice di elaborazione dati di visione come file supplementari. Come un campione rappresentativo di dati, mostriamo tempo di transito cella attraverso una serie di costrizioni in funzione del numero di costrizioni diversi passaggi. Analisi dei tempi per celle di transitare se costrizioni strette di un dispositivo microfluidico può rivelare differenze di deformabilità di una varietà di tipi cellulari 4,5,13. Il dispositivo dimostrato qui sorveglia unicamente transito cella attraverso una serie di costrizioni micron scala; questo disegno emula il percorso tortuoso che le cellule vivono in circolazione e permette anche sondare le caratteristiche fisiche supplementari di cellule, come tempo di rilassamento.
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Protocol
1 Microfluidic Device Design
NOTA: Il disegno dispositivo ha quattro regioni funzionali di base: porta di entrata, filtro cellule, matrice costrizione, e la porta di uscita (Figura 1). Il disegno complessivo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di cellule, con piccoli aggiustamenti alle dimensioni. Purché ecco alcuni consigli di progettazione di base insieme con i parametri del dispositivo che sono efficaci per una selezione di entrambe le cellule primarie e fotografati.
- Selezionare la larghezza dei canali di matrice costrizione (Figura 1B) a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule; Questa costrizione-cellula dimensioni quoziente desse un risultato deformazione delle cellule significativo ma intasamento minimo. Dato un tipo di cellula che non è stato testato in precedenza, è prudente progettare una gamma di larghezze di costrizione da ~ 30-50% il diametro delle cellule per trovare la larghezza ottimale. Come con molti tipi di dispositivi microfluidici, oltre 120 maestri stampi dispositivo possono essere modellati su un peccatogle wafer di silicio da 4 pollici, che consente una serie di disegni di dispositivi diversi per essere fabbricato in un unico processo di fabbricazione.
- Selezionare l'altezza del canale di almeno il 50% del diametro della cellula; ciò assicura la cella è confinata in 2 dimensioni. Per evitare il collasso canale durante l'incollaggio, accertarsi che le proporzioni canale non meno di 1:10 è (altezza: larghezza) in tutto il dispositivo. Per i canali che devono superare il rapporto di aspetto, aggiungere posti di sostegno per prevenire il collasso. Pali di sostegno spazio ad una distanza che è almeno il doppio del diametro delle cellule, per non ostacolare il flusso delle cellule.
- Include un filtro nei porti di entrata per rimuovere i detriti e disaggregare ammassi cellulari (Figura 1B). Regolare la dimensione e la spaziatura dei posti di filtro in modo che la distanza che separa i messaggi è approssimativamente pari ad un diametro di cella.
NOTA: Il limite inferiore di dimensioni funzione è impostata dalla risoluzione alla quale la maschera litografica viene stampato. Assicurarsi che tutte le funzioni sono all'interno delle resoluzione limite specificato dal fornitore di maschera.
2. Le forniture e Preparazione
NOTA: Prima di iniziare qualsiasi esperimento, i seguenti elementi devono essere preparati. Una schematica dell'intero configurazione è dato in Figura 1.
- Realizzare il maestro dispositivo utilizzando tecniche standard per microlavorazioni litografica 14,15. Verificare l'altezza delle caratteristiche modellata utilizzando un profilometro.
NOTA: Mentre master possono essere facilmente fabbricati in un impianto di camera bianca, alcuni laboratori hanno sviluppato metodi di litografia a basso costo per l'uso in un ambiente semi-pulito 16,17. - Preparare la fonte d'aria per il flusso guidato-pressione, utilizzando un serbatoio di aria compressa e la sequenza dei regolatori aria e raccordi (Figura 1A).
- Impostare un serbatoio di alimentazione dell'aria e il regolatore manuale.
NOTA: Una composizione di 5% di CO 2 in aria mantiene un ambiente simile a un tipico incubato coltura cellularer, ma altre miscele di gas possono anche essere utilizzati. - Impostare un regolatore di pressione a controllo elettronico in linea con il regolatore manuale. Utilizzare un convertitore elettro-pneumatico per regolare e mantenere una caduta di pressione stabile su tutti i canali, con le variazioni di pressione di meno di 2 kPa. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW (Informazioni supplementari) per inserire la pressione desiderata.
NOTA: Il convertitore elettro-pneumatico utilizza un circuito di feedback interno per regolare la pressione di uscita della valvola in modo che corrisponda alla pressione specificata attraverso il dispositivo di microfluidica. - Impostare una camera pressurizzata per guidare il flusso della sospensione cellulare. Assemblare una camera di sospensione cellulare su un citometro a flusso standard tubo e un cappuccio lavorata che crea una guarnizione a tenuta di pressione sul tubo.
NOTA: Il tappo camera di pressione contiene due orifizi: un ingresso che si collega al serbatoio dell'aria compressa e una presa attraverso il quale le cellule derivano dalla camera in pressione nel dispositivo (Figure 2).
- Impostare un serbatoio di alimentazione dell'aria e il regolatore manuale.
- Impostare un microscopio invertito dotato di una fotocamera che ha un tasso di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo per catturare le immagini delle cellule che attraversano la matrice costrizione. Interfaccia la fotocamera con una scheda di acquisizione video e un computer.
- Preparare una soluzione madre tensioattivo del 10% w / w Pluronic F-127 in tampone fosfato (PBS), come l'aggiunta di una piccola quantità di F127 alla soluzione multimediale cellule aiuterà a ridurre al minimo l'adesione delle cellule alle pareti PDMS. Per preparare la soluzione F127, vortice e riscaldare lentamente a 37 ° C per sciogliere la F127. Prima dell'uso, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di tensioattivo in anticipo come vortex e filtraggio genera bolle che persistono per più di 24 ore.
3 Microfluidic Fabrication dispositivo
- Realizzare blocco PDMS con canali microfluidici.
- Mescolare accuratamente PDMS unrapporto ta di 1:10 (w / w) agente indurente alla base.
- Versare il composto sopra il master del dispositivo (punto 2.1). Degas in una campana di vetro con il vuoto applicato fino a quando le bolle intrappolate scompaiono, o per circa 10-20 min.
NOTA: Dopo questo tempo, ci possono essere ancora bolle all'interfaccia aria-PDMS, che è normale; queste saranno tipicamente dissipare durante la cottura. È più critico per garantire che non vi siano bolle rimanenti adiacenti ai canali. - Cuocere il dispositivo degasato a 65 ° C per 4 ore. Per evitare che i canali di collassare, cuocere il dispositivo durante la notte per reticolare ulteriormente le PDMS per un dispositivo con un alto modulo elastico che è più resistente al collasso canale. Tuttavia, nota che si estendeva cottura embrittles anche i PDMS e può portare alla fessurazione quando punzonatura fori (punto 3.3).
- Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master. Tagliare dispositivi microfluidici individuali fuori del blocco PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal paloer. Iniziate sollevando delicatamente un angolo del dispositivo; peeling lento e dolce, in contrasto con il sollevamento del blocco di PDMS verso l'alto, riduce lo stress su entrambi i PDMS e il master.
- Punch buchi nel dispositivo PDMS per creare porte di connessione per l'accesso tra tubi e microcanali. Creare fori con una biopsia, e punch dal lato canale attraverso il lato esterno del dispositivo.
NOTA: Un pugno biopsia con un diametro 0,75 millimetri crea buchi che si interfacciano perfettamente con polietereterchetone (PEEK) tubo (diametro esterno = 1/32 "o 0,79 millimetri) o tubo di polietilene (PE-20, diametro esterno = 0,043" o 1,09 millimetri ). Utilizzare un anello di luce per aiutare a visualizzare i fori nei dispositivi con canali poco profondi 18. Assicurarsi che la biopsia è tagliente; dopo un uso ripetuto all'avanguardia offusca e la biopsia deve essere eliminata e sostituita. - Sciacquare il dispositivo PDMS con isopropanolo (HPLC) per rimuovere polvere e depositati pezzi di PDMS. Assicurarsi che ilfori sono chiari di detriti da dirigere un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia squeeze attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata. Dopo la pulizia, posizionare i blocchi PDMS con canali a faccia in su in un piatto pulito Petri per mantenere la pulizia del dispositivo. Se necessario, dispositivi di archiviazione in questa forma fino legame.
- Pulire il substrato di vetro risciacquando con metanolo (grado HPLC), asciugare con aria filtrata, e mettere su una piastra riscaldante a 200 ° C per 5-10 minuti al fine di garantire il vetro è completamente pulita e asciutta prima del trattamento al plasma.
NOTA: Il substrato di vetro forma il fondo di ciascun canale. Tipicamente un vetrino sufficiente, dal momento che un obiettivo 10X o 20X è l'ideale per l'imaging più canali in parallelo. Per una maggiore risoluzione delle immagini, legare il dispositivo a un coprioggetto (# 1.5 di spessore). - Incollare il dispositivo PDMS al substrato di vetro.
- Il plasma ad ossigeno trattare il lato canale del blocco PDMS e 1 parte di un vetrino.
NOTA: Won una unità di scarico manuale, utilizzare un tempo di trattamento di 1 min, ma ottimizzare il tempo di trattamento per ciascun apparecchio plasma di ossigeno. - Posizionare il lato canale delle PDMS sulla parte superiore del lato trattato del vetro immediatamente dopo il trattamento.
- Tenere insieme con una leggera pressione per ~ 10 secondi per promuovere l'incollaggio. Cuocere l'intero dispositivo a temperatura elevata (60-80 ° C) per almeno 15 minuti per migliorare la forza di legame.
- Il plasma ad ossigeno trattare il lato canale del blocco PDMS e 1 parte di un vetrino.
4 Deformazione cellule attraverso i canali ristretto
- Controllare il dispositivo di microfluidica sotto un microscopio. Assicurarsi che i canali non sono crollate o rotti e che entrambi i fori di entrata e uscita si collegano direttamente nei canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (10X). Designare dispositivi difettosi segnando la superficie delle PDMS con una lametta e non usarli per esperimenti.
- Preparare i campioni di coltura cellulare per essere processati. Cellule Cultura usano condizioni standard.
- Fo esempio, la cultura HL-60 cellule in terreno RPMI-1640 integrati con la soluzione di penicillina-streptomicina 1% e siero fetale bovino al 10% in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C.
- Per le cellule aderenti, li raccogliere da tripsinizzazione e risospendere in terreno di coltura fresco. Utilizzare un protocollo standard di tripsinizzazione; per esempio, aggiungere ~ 0,5 ml di tripsina ad un pallone con il 25 cm 2 area culturale, e risospendere in ~ 30 ml di terreno fresco. Differenziare cellule HL-60 in cellule neutrofili di tipo da parte di tutti-trans retinoico (ATRA) ad una concentrazione finale di 5 mM per 1 x 10 5 cellule / ml come descritto in precedenza 19,20.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 3 minuti, aspirare con cura le cellule surnatante e risospendere alla densità finale appropriato terreno di coltura fresco con 0,1% v / v F-127.
- Contare le cellule utilizzando un contatore Coulter, emocitometro, o citofluorimetro. Regolare la sospensione cellulare ad una densità di 1 x 10 6 a 5 x 10
- Mettere sospensione cellulare in un citofluorimetro tubo e collegarlo al tappo a pressione. Prima di collegare il tubo al dispositivo microfluidica, regolare la pressione a circa 14-21 kPa e filo fino alla sospensione cellulare emerge dalla punta del tubo. Questo aiuterà a ridurre al minimo le bolle d'aria nel tubo e il dispositivo.
- Inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nella presa del dispositivo. Se il dispositivo è legato ad un coprioggetto, posizionare il dispositivo su una superficie piana e solida come la fase di microscopio prima di collegare il tubo; il vetrino è fragile e può rompersi in caso contrario.
- Inserire un pezzo di tubo into l'apertura di uscita e farlo passare in un tubo vuoto per la raccolta dei rifiuti, ad esempio un tubo Falcon vuota attaccata al lato del palco microscopio. Per coerenza nella resistenza fluidica complessiva del dispositivo tra esperimenti, verificare che il tubo di ingresso e uscita è dello stesso diametro e circa la stessa lunghezza per ogni esperimento.
- Rampa delicatamente la pressione di circa 28 kPa o fino a quando le cellule passano attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che i diversi canali sono nel campo visivo e sono perpendicolari al fondo della schermata. Se la fotocamera è limitata dalla dimensione dei dati, acquisire più video per generare un numero sufficiente di punti di dati indipendenti. Regolare il tasso necessario per l'uscita dei dati desiderata telaio. Per catturare cambiamenti nella forma cellulare, utilizzare l'imaging ad alta velocità a 300 fotogrammi al secondo (fps); per misurare i tempi di transito di celle, utilizzare frame rate di circa 100 fps.
Analisi dei dati 5.
- Aprire il file Master_script.m (scaricabile File supplementare) ed eseguire il programma.
- Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che viene visualizzata. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio.
NOTA: Una figura apparirà che richiede all'utente di selezionare una finestra di ritaglio rettangolare per il primo video. - Selezionare una finestra che comprende tutti i canali da sinistra a destra e interseca i canali appena sopra la prima lampadina della matrice di canali in alto e in basso (Figura 3).
- Selezionare le regioni costrizione da l'immagine ritagliata. Prestare particolare attenzione a mantenere una distanza fissa di pixel tra la finestra limite superiore e inferiore per ogni video selezionato.
NOTA: Il bordo superiore della finestra specifica la costrizione più in alto e il bordo inferiore della finestra specifica la costrizione in basso (figura 4); costrizioni intermedie sono approssimate da questo input dell'utente. Successivamente, l'algoritmo mostra le segmentation delle cellule per i primi 50 frame di ogni video (Figura 5). - Monitorare l'immagine in alto a sinistra (Figura 5A) strettamente per determinare se l'algoritmo è localizzare con precisione le cellule; un'immagine binarizzata viene sovrapposta al video sorgente per dimostrare la posizione delle cellule identificate.
NOTA: Le finestre diverse, (Figure 5B-5D) sono per la diagnosi di codice e dimostrano i fotogrammi video dopo le operazioni di elaborazione delle immagini specifiche. - Selezionare il video successivo da elaborare dalla finestra di Windows Explorer.
NOTA: L'algoritmo si Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni video selezionato. - Selezionare Annulla una volta tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora risorse per istruire la funzione che l'elenco dei video è completa.
NOTA: L'algoritmo eseguirà le operazioni rimanenti senza l'intervento dell'utente. Questo richiederà circa 1-2 ore a seconda del numero di video trasformati e pe informaticirformance. Al termine, l'algoritmo produrrà un istogramma dei dati di tempo di transito e di salvare i dati nella directory come un file .mat MATLAB e un file xls di Microsoft Excel.
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Representative Results
Per studiare la deformabilità dei diversi tipi di cellule, cellule di leucemia mieloide umana (HL-60), le cellule differenziate neutrofili, cellule linfocitarie topo, e linee cellulari di carcinoma ovarico umano (OVCAR8, HEYA8) vengono valutati utilizzando la tecnica microfluidica il 'cellulare Deformer'. Risultati rappresentativi per il tempo di transito di HL-60 cellule HL-60 e neutrofili tipo mostrano i tempi per una singola cella di transito attraverso una serie di costrizioni, come mostrato nella Figura 6. Tempo di transito è misurato per una popolazione di cellule singole a ogni costrizione 7 micron in una serie di 7 costrizioni ad una pressione di 28 kPa guida (Figura 6).
Come mostrato in figura 6, cellule HL-60 occludono temporaneamente la prima costrizione per un tempo medio di 9,3 msec prima passaging attraverso le costrizioni successive. Al contrario, cellule HL-60 neutrofili di tipo occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec primapassaging. Il tempo di transito più breve delle cellule HL-60 è coerente con le loro ridotte moduli elastici e viscosi, come determinato dalla microscopia a forza atomica 21 e micropipetta aspirazione 22. Questi risultati sono coerenti con i livelli ridotti di proteina mechanoregulating, lamina A, che determinano i tempi di transito di cellule attraverso le lacune micron scala 23. Una volta superata la prima costrizione, cellule transito più rapidamente attraverso i rimanenti costrizioni, da 2 a 7, con un tempo di transito mediana di 4,0 msec per le cellule HL-60 e 3,3 msec per le celle di tipo neutrofili (Figura 6). Mentre le cellule HL-60 mostrano ancora leggermente più lunga ma significativi tempi di transito (C2-C7, p = 1.7E-9), la distribuzione dei tempi di transito per costrizioni 2-7 sono quasi identici per ogni tipo cellulare. L'osservazione del tempo di transito è più necessario per la prima costrizione può riflettere che le cellule viscoelastiche non rilassarsi completamente alla loro forma iniziale on questi tempi ~ msec. Questo comportamento può essere spiegato da cambiamenti strutturali irreversibili che si sviluppano all'interno della cellula, e facilitare il loro transito attraverso le successive lacune micron scala. È importante sottolineare che, confrontando il tempo di transito tra le popolazioni di cellule, anche per la prima costrizione, può rivelare differenze nella loro deformabilità 23.
Figura 1 Rappresentazione schematica del setup sperimentale. . Dispositivo A. 'cellulare Deformatore' nel setup sperimentale che mostra le connessioni di periferiche B. Il disegno dispositivo dispone di 4 regioni funzionali: porta di entrata, filtro cellule, matrice costrizione, e la porta di uscita. Architettura del dispositivo di microfluidica mostrando le sue caratteristiche principali; inserto mostra un'immagine luce trasmessa dei canali ristretti. Scala, 10 μ ; M.
Figura 2. disegni di ingegneria per una protezione personalizzata per pressurizzare i media di cellule contenute in un citofluorimetro tubo.
Figura 3 Dimostrazione di come selezionare la regione di interesse per fotogramma video ritaglio.
Figura 4 Dimostrazione di come selezionare i luoghi di costrizione.
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Figura 5 Finestra di osservazione utilizzato per verificare che l'algoritmo identifica correttamente posizioni delle celle mentre elaborano attraverso l'array costrizione. Immagine A. binarizzate viene sovrapposta al video sorgente per mostrare la posizione delle cellule B. immagine Difference;. C. Cappello In basso l'immagine filtrata; D. Median filtrato.
Figura 6 Rappresentante misurazioni dei tempi di transito in funzione del numero di costrizione. A. cellule HL-60 presentano un più lungo tempo di transito attraverso il primo costrizione di HL-60 (neutrofili-tipo), le cellule B. trattate con ATRA. Un confronto del tempo di passaggio trasformato (log10) attraverso il primo costrizione come valutata utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney rivela l'differenza è significativa, p = 1.47E-5. Le cellule tipicamente transito attraverso il primo costrizione più lentamente rispetto costrizioni successive. I dati viene mostrato qui per le cellule in transito attraverso 7 micron larghe costrizioni ad una pressione di 28 kPa di guida. Densità cellulare, diametro medio delle cellule, e la concentrazione di tensioattivo sono riportati nella tabella 1 HL-60, N = 77.; ATRA trattati HL-60, N = 97. risultati sono stati replicati in esperimenti indipendenti nel corso di 3 giorni diversi.
Figura 7 Panoramica dello script MATLAB per la misurazione del tempo di transito. Il primo ciclo richiede l'intervento dell'utente e di osservazione per i primi 50 fotogrammi per ogni video. Dopo il primo ciclo, l'intero programma verrà eseguito senza l'intervento dell'utente e compila i dati e grafici sulla popolazione automaticamente.
Tabella 1 In precedenza ha studiato sistemi cellulari e le loro condizioni di funzionamento.
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Discussion
Qui forniamo una procedura sperimentale completo per l'analisi della deformazione delle cellule che transitano attraverso i canali microfluidici ristretto con flusso pressione-driven. Uno script MATLAB consente l'elaborazione automatica dei dati (Supplemental materiale); di una versione aggiornata del codice è mantenuta ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Più in generale, le tecniche qui presentate possono essere adattati in molti saggi microfluidica cell-based, tra cui l'effetto del citoscheletro e agenti di irrigidimento nucleari 24,23 e saggiare la deformabilità dei tipi di cellule di cancro di 4,5. Nel loro insieme con una maggiore risoluzione al microscopio immagine deformazioni subcellulari, questo metodo fornisce un approccio potente per lo studio delle cellule proprietà meccaniche e alterazioni che si verificano in condizioni fisiologiche e patologiche.
Cellulare Automatic Processing Algorithm
Figura 7, e l'insieme delle funzioni di MATLAB è fornito nei prospetti supplementari. In breve, l'utente è incaricato di selezionare tutti i video da analizzare; ritagliare ogni video per la regione di interesse; e specificare un frame rate per la serie di video; successivamente, il software elabora automaticamente i dati video per determinare il tempo di transito di ciascuna cella per ogni costrizione. Ci sono alcuni requisiti per lo script di operare: cellule dovrebbero fluire dalla parte superiore del telaio alla parte inferiore del telaio nel video; la posizione del dispositivo microfluidica e le condizioni di illuminazione non dovrebbe cambiare sensibilmente per tutta la durata del video; e video devono essere in formato avi. È importante sottolineare che l'algoritmo di tracking comprende cellule che sia entrare e di passaggio nella finestra temporale di una singola registrazione video, che è di circa 8 sec. Pertanto, qualsiasioggetti che hanno un tempo di transito maggiore sono esclusi dall'analisi. Eseguendo sottrazione dello sfondo, gli oggetti che sono presenti in tutta l'intero video vengono rimossi dall'analisi. Il codice implementa anche un cutoff dimensione inferiore, che può essere impostata dall'utente. Il cutoff dimensione per l'analisi video è stato di 5 pixel, equivalenti a un diametro di 2,7 micron cellulare.
Dal momento che i file di dati video ad alta velocità possono essere considerevole (~ 500 MB), il programma è computazionalmente intensive. Il codice è più gestito in modo efficiente utilizzando un computer desktop con almeno 6 GB di RAM e un chipset a 64 bit sia con un disco rigido locale con almeno una capacità di 1 TB o interfacciato con un grande disco rigido esterno o un server di dati con una USB 3.0 , FireWire, o una connessione Ethernet. I dati viene emesso in un formato istogramma per una rapida visualizzazione dei risultati; è anche catalogato come dati memorizzati in un (.mat) file di dati MATLAB e in un foglio di calcolo di Excel.
Il codice che è presented fornisce un modo semplice per confrontare popolazioni cellulari mediante l'analisi del tempo di transito per le celle a passare attraverso ogni costrizione. Per un'analisi più dettagliata, il codice potrebbe essere esteso ad indagare su altri parametri, tra cui le dimensioni delle cellule, proporzioni, così come il rilassamento tempi. Gli studi precedenti rivelano solo una debole dipendenza della dimensione cellulare sul tempo di transito 6.
Insidie dispositivi connessi
Canali occlusi sono un ostacolo importante in ogni esperimento flusso. L'adesione cellulare alle pareti del dispositivo potrebbe compromettere il flusso delle cellule attraverso i canali ristretti: le cellule possono essere osservati a spalmare lungo le pareti del canale. Per evitare l'adesione, trattamento superficiale adeguato con F-127 è essenziale.
Le proprietà di superficie del cambiamento PDMS con il tempo dopo il trattamento al plasma, che rende il PDMS temporaneamente idrofile 25,26. Nel corso di una settimana, le superfici PDMS idrofile lentamente degenerare al loro energia di superficie idrofobica naturale; questo può impugnare la rimozione di bolle d'aria attraverso i canali. I dispositivi devono essere utilizzate entro sette giorni di trattamento al plasma. Ancora più importante, il tempo tra il trattamento al plasma e il test deformabilità dovrebbe essere coerente in tutti gli esperimenti.
Mentre abbiamo distinto con successo i tempi di transito tra tipi cellulari distinti che utilizzano dispositivi fabbricati con un pavimento di vetro e tre pareti PDMS, dispositivi possono anche essere fabbricati in modo da avere le proprietà di superficie uniformi su tutte e quattro le pareti del canale 27. Il dispositivo PDMS può essere legato ad un substrato di vetro spincoated con uno strato PDMS sottile: miscelare il catalizzatore a sistemarsi presso un rapporto di 1: 5 (w / w), versare sullo stampo del dispositivo, e la cura per 20 minuti a 65 ° C . Nel frattempo, spincoat un sottile strato di 1:20 (w / w) catalizzatore basare sul substrato di vetro; cuocere in forno a 85 ° C per 4 min. Posizionare il dispositivo PDMS sulla diapositiva PDMS-rivestite, e finire la cottura durante la notteper completare incollaggio. Questo metodo è anche utile se una macchina plasma per vetro-PDMS incollaggio non è disponibile.
Insidie cellulari connessi.
gallina preparazione della sospensione cellulare, la densità delle cellule è critica: se la densità cellulare è troppo bassa, eventi transito cellule saranno infrequenti; se la densità cellulare è troppo alta, non ci sarà più celle Passaging un singolo canale contemporaneamente, la caduta di pressione attraverso una singola cella non saranno coerenti, e sarà difficile per delineare le singole celle con uno script automatico.
Mentre gli esperimenti vengono in genere eseguite entro 30 minuti di sospensioni di cellule in fase di preparazione, le cellule possono depositarsi sul fondo della camera di pressione su tempi più lunghi di> 30 min. Per evitare di stabilirsi per periodi di tempo più lunghi, la camera di pressione e il tubo di collegamento possono essere ruotati periodicamente. Per gli esperimenti più lunghi, una piccola ancoretta magnetica può essere aggiunto al cell sospensione, con una piastra di agitazione posizionato sotto la camera di pressione per agitare le cellule e prevenire sedimentazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere Lloyd Ung per l'input costruttivo nelle prime versioni di questa tecnica, il dottor Jeremy Agresti per le punte di design tappo a pressione, e il dottor Dongping Qi per il suo aiuto nella fabbricazione il tappo di pressione. Siamo grati ai laboratori di M. Teitell e P. Gunaratne per fornire una varietà di campioni di cellule per il test. Siamo grati per la National Science Foundation (CARRIERA Premio DBI-1254185), la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, e la UCLA clinica e traslazionale Science Institute per sostenere questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
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