Summary
Vi demonstrerer en MicroFluidics-baserte analysen for å måle tidsskalaen for celler til transitt gjennom en sekvens av mikron-skala restriksjonar.
Abstract
Her har vi detalj utforming, fabrikasjon og bruk av en mikrofluid enhet for å evaluere deformerbarhet av et stort antall enkeltceller på en effektiv måte. Vanligvis kan data for ~ 10 2 celler kan erverves i løpet av en 1-timers eksperimentet. En automatisert bildeanalyse-program gjør det mulig effektiv etter eksperiment analyse av bildedata, slik prosessering for å være fullstendig i løpet av få timer. Vår geometri enheten er unik ved at cellene må deformeres gjennom en serie av mikron-skala innsnevringer, og dermed muliggjør den innledende deformasjon og tidsavhengig avslapning av individuelle celler som skal undersøkes. Anvendeligheten av denne metode til human promyelocytiske leukemi (HL-60)-celler er vist. Kjøring celler til å deformere gjennom mikron-skala restriksjonar ved hjelp trykkraft, observerer vi at menneskelig Promyelocytic (HL-60) celler øyeblikk occlude den første innsnevring for en median tid på 9,3 msek før passering raskere gjennom den påfølgende constrictioner med en median overføringstiden av 4,0 ms pr innsnevring. I motsetning til dette, all-trans retinsyre-behandlet (nøytrofil-type) HL-60-celler som okkluderer den første innsnevring i bare 4,3 ms før passering gjennom de etterfølgende innsnevringer med en midlere transittid på 3,3 msek. Denne metoden kan gi innsikt i viskoelastisk natur celler, og til slutt avdekke molekylære opprinnelsen til denne atferden.
Introduction
Endringer i celleform er avgjørende i en rekke biologiske sammenhenger. For eksempel, erytrocytter og leukocytter deformeres gjennom kapillærer som er mindre enn sin egen diameter 1. I metastasering, må kreftceller deformert gjennom trange interstitiell hull samt kronglete blodkar og lymfekar nettverk til frø på sekundære områder to. Å sondere den fysiske oppførselen til enkeltceller, presentere microfluidic enheter en ideell plattform som kan tilpasses til å studere en rekke celle atferd inkludert deres evne til å migrere gjennom smale hull 3 og passivt deformeres gjennom mikron-skala constrictions 3- ni. Polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic enheter er optisk transparent, slik at celle deformasjoner å bli visualisert ved hjelp av lysmikroskopi og analysert ved hjelp av grunnleggende bildebehandlingsverktøy. Videre kan sammensetninger av innsnevringer bli nøyaktig definert, slik at analyse av flere celler samtidig med engjennomstrømming som overgår mange eksisterende teknikker 10,11.
Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for sondering celle formbarhet ved hjelp av "Cell Deformer 'PDMS microfluidic enhet. Anordningen er utformet slik at cellene passasje gjennom sekvensielle innsnevringer; denne geometri er vanlig i fysiologiske sammenhenger, som for eksempel lunge-kapillære bed 12. For å måle celle deformerbarhet, gir transittid en enkel beregning som er lett måles som den tid som kreves for en enkelt celle til transitt gjennom en enkelt innsnevring 4,6. For å opprettholde et konstant trykkfall over de innsnevrede kanaler under celle transitt, bruker vi trykkraft. Vår protokoll omfatter detaljerte instruksjoner om enheten konstruksjon og fabrikasjon, betjeningen av trykkraft, preparering og avbildning av celler, så vel som bildebehandling for å måle tid for cellene til å deformeres gjennom en rekke innsnevringer. Vi inkludererbåde enhets design og visjon databehandling kode som supplerende filer. Som et representativt utvalg av data, viser vi celletransittiden gjennom en rekke innsnevringer som en funksjon av antall innsnevringer passaged. Analyse av tidsskalaen for celler til transitt skjønt trange innsnevringer av en mikrofluidteknisk enhet kan vise forskjeller i deformasjon av en rekke celletyper 4,5,13. Anordningen vist her entydig undersøkelser celle transitt gjennom en serie av mikron-skala innsnevringer; dette designet emulerer kronglete sti som cellene opplever i omløp og også gjør sondering flere fysiske egenskapene til cellene som avslapping tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfluidic Device Design
MERK: Enheten designen har fire grunnleggende funksjonelle regioner: entry port, cellefilter, innsnevring array, og exit port (figur 1). Den generelle designen kan brukes til et bredt spekter av celletyper, med mindre justeringer av dimensjoner. Forutsatt her er noen grunnleggende design anbefalinger sammen med enhetsparametere som er effektive for et utvalg av både primære og udødeliggjort celler.
- Velg bredden innsnevring array-kanaler (figur 1B) til å være omtrent 30-50% av den gjennomsnittlige cellediameter; denne innsnevring til-celle-forholdet resulterer i signifikant celle deformasjon, men minimal tilstopping. Gitt en celletype som ikke tidligere er testet, er det klokt å designe en rekke innsnevring bredder fra ~ 30-50% cellen diameter for å finne den optimale bredden. Som med mange typer microfluidic enheter, kan over 120 enhetsmester muggsopp være mønstret på en syndgle 4 tommers silisiumskive, slik at en rekke forskjellige innretningskonstruksjoner som skal fremstille i en enkelt fremstillingsprosess.
- Velg kanalhøyden til å være minst 50% av cellediameter; Dette sikrer at cellen er begrenset i to dimensjoner. For å hindre kanal kollaps under bonding, sikre at kanalen størrelsesforholdet er ikke mindre enn 1:10 (høyde: bredde) i hele enheten. For kanaler som må overskride dette sideforholdet, legge til støtte innlegg for å hindre kollaps. Mellomrom bærestolper i en avstand som er minst dobbelt så stor diameter som cellen for å ikke hindre cellestrømmen.
- Inkluder et filter på inngangsporter for å fjerne rusk og disaggregert celleklynger (Figur 1b). Justere størrelsen og avstanden av filterstengene, slik at avstanden som skiller de stillinger er tilnærmet lik en cellediameter.
MERK: Den nedre grensen for funksjonen størrelse er bestemt av oppløsningen som litografi maske skrives. Sørg for at alle funksjoner er innenfor de resvedtaket har grense spesifisert av masken leverandør.
2. Rekvisita og klargjøring
MERK: Før du setter i forsøket, må være forberedt på følgende elementer. En skjematisk av hele oppsettet er gitt i figur 1.
- Dikte enheten hoved ved hjelp av standardteknikker for litografisk mikromaskinering 14,15. Kontroller høyden på de mønstrede funksjoner ved hjelp av en profilometer.
MERK: Mens mestere kan lett fabrikkert i et renrom anlegget, har noen laboratorier utviklet rimelige litografi metoder for bruk i en semi-rent miljø 16,17. - Klargjør luftkilden for trykkraft ved hjelp av en tank med komprimert luft og sekvens av luft regulatorer og fittings (Figur 1a).
- Sett opp en lufttilførsel tank og manuell regulator.
MERK: En sammensetning av 5% CO2 i luft opprettholder en lignende miljø som en typisk cellekultur incubator, men også andre gassblandinger kan også benyttes. - Sett opp en elektronisk styrt trykkregulator på linje med den manuelle regulator. Bruk en elektropneumatisk omformer for å regulere og opprettholde et stabilt trykkfall over kanalene, med trykksvingninger på mindre enn 2 kPa. Bruk den enkle kode skrevet i LabVIEW (Supplementary Information) til å angi ønsket trykk.
MERK: elektro-pneumatisk omformer bruker en intern feedback loop for å justere ventilutløpet press for å matche den angitte trykket over microfluidic enheten. - Sett opp en trykksatt kammer for å drive strømmen av cellesuspensjonen. Monter en cellesuspensjon kammer av en standard flowcytometer rør og en maskinhette som skaper en trykktett tetning på røret.
MERK: trykkammer hetten inneholder to åpninger: et innløp som er koblet til trykklufttank, og et utløp gjennom hvilke celler strømme fra det trykksatte kammer inn i anordningen (Figure 2).
- Sett opp en lufttilførsel tank og manuell regulator.
- Sett opp en invertert mikroskop utstyrt med et kamera som har en overtagelse hastighet på minst 100 rammer per sekund for å ta bilder av cellene som strømmer gjennom innsnevringen array. Grensesnitt kameraet med en video capture card og en datamaskin.
- Tilbered en lageroverflateaktive oppløsning på 10% v / v Pluronic F-127 i fosfatbufret saltvann (PBS) som tilsette en liten mengde av F127 til cellemedier løsningen vil bidra til å redusere celleadhesjon til PDMS vegger. For å forberede F127 løsningen, Vortex og varme forsiktig ved 37 ° C for å oppløse F127. Før bruk, passerer oppløsningen gjennom en 0,2 um sprøytefilter og oppbevares ved romtemperatur. Forbered overflate løsning på forhånd som virvling og filtrering vil generere bobler som vil vedvare i mer enn 24 timer.
3. microfluidic enheten fabrikasjon
- Dikte PDMS blokk med microfluidic kanaler.
- Mix PDMS grundig enTA-forhold på 1:10 (w / w) herder til basen.
- Hell blandingen over enheten master (trinn 2.1). Degas i en glassklokke med anvendt vakuum inntil innfanget boblene forsvinner, eller i ca 10-20 min.
MERK: Etter denne tid, kan det fortsatt være bobler på luften-PDMS-grensesnitt, som er vanlig; disse vil vanligvis forsvinne under stekingen. Det er meget viktig for å sikre at det ikke er noen gjenværende bobler i tilknytning til kanalene. - Bake den avgassede enheten ved 65 ° C i 4 timer. For å hindre kanaler fra å kollapse, bake enheten over natten for å ytterligere cross de PDMS for en enhet med høyere elastisitetsmodul som er mer motstandsdyktig mot kanalen kollaps. Vær imidlertid oppmerksom på at utvidet baking embrittles også PDMS og kan føre til sprekker når punching hull (trinn 3.3).
- Fjern microfluidic enheter fra master mold. Skjær individuelle microfluidic enheter ut av PDMS blokk med et barberblad og fjerne enheten fra masteneh. Start med å forsiktig løfte av ett hjørne av enheten; langsomt og forsiktig avskalling, i motsetning til løfting av PDMS blokken rett opp, reduserer belastningen på begge PDMS og master.
- Punch hull i PDMS enheten oppretter tilkoblingsporter for tilgang mellom slange og mikro. Lag hullene ved hjelp av en biopsi punch, og punch fra kanalen side gjennom til utsiden av enheten.
MERK: En biopsi slag med en 0,75 mm diameter størrelse skaper hull som grensesnitt perfekt med polyetereterketon (PEEK) tubing (ytre diameter = 1/32 "eller 0,79 mm) eller polyetylen rør (PE-20, ytre diameter = 0.043" eller 1,09 mm ). Bruk en ring lys for å hjelpe visualisere hull i enheter med grunne kanaler 18. Vær sikker på at biopsi punch er skarp; etter gjentatt bruk i forkant dulls og biopsi punsj må kastes og erstattes. - Skyll PDMS enhet med isopropanol (HPLC-kvalitet) for å fjerne støv og avleiret biter av PDMS. Forsikre deg om athull er fri for rusk ved å rette en jevn strøm av ren isopropanol fra en klemme flaske gjennom hullene. Føn med filtrert luft. Etter rengjøring, sted PDMS blokker med kanaler med forsiden opp i en ren petriskål for å opprettholde enhet renslighet. Hvis det er nødvendig, butikk enheter i dette skjemaet før liming.
- Rengjør glasset underlaget ved å skylle med metanol (HPLC-kvalitet), føn med filtrert luft, og legg på en 200 ° C kokeplate for 5-10 min for å sikre at glasset er helt ren og tørr før plasma behandling.
MERK: Glasset substrat danner bunnen av hver kanal. Vanligvis en glass-slide er nok, siden en 10X eller 20X objektiv er ideell for å avbilde flere kanaler parallelt. For oppløsning høyere, binde enheten til et dekkglass (# 1.5 tykkelse). - Binde PDMS-enheten til glass-substrat.
- Oksygen plasma behandle kanalsiden av PDMS blokk og en side av en glass-slide.
MERK: Wed en håndholdt utløpsdelen ved hjelp av en behandlingstid på 1 min, men optimalisere behandlingstiden for hvert oksygen plasma apparat. - Sett kanal side av PDMS på toppen av den behandlede siden av glasset umiddelbart etter behandling.
- Hold sammen med et lett trykk for ~ 10 sek å fremme bonding. Bake hele apparatet ved en forhøyet temperatur (60-80 ° C) i minst 15 minutter for å forbedre bindestyrken.
- Oksygen plasma behandle kanalsiden av PDMS blokk og en side av en glass-slide.
4. deformeres Cells gjennom snørt Kanaler
- Inspiser microfluidic enhet under et mikroskop. Sørg for at kanalene ikke er kollapset eller ødelagt, og at både innløp og utløp hull koble direkte til enhetens kanaler ved hjelp av en lav-effekt objektiv (10X). Utpeke defekte enheter ved scoring overflaten av PDMS med et barberblad og ikke bruke dem for eksperimenter.
- Forbered prøvene cellekultur som skal undersøkes. Kultur-celler ved hjelp av standardbetingelser.
- Feller eksempel kultur HL-60-celler i RPMI-1640 medium supplert med 1% penicillin-streptomycin-løsning og 10% føtalt bovint serum i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- For heftende celler, høste dem ved trypsinering og resuspender i frisk vekst medium. Bruk en standard trypsinization protokoll; for eksempel legge ~ 0,5 ml trypsin i en kolbe med 25 cm2 kulturområde, og resuspender i ~ 30 ml friskt medium. Skille HL-60 celler i nøytrofil-type celler med all-trans retinsyre (ATRA) ved en sluttkonsentrasjon på 5 mM per 1 x 10 5 celler / ml som tidligere beskrevet 19,20.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 3 minutter, omhyggelig Aspirer supernatanten og resuspender cellene til den passende endelige densitet i fersk kulturmedium med 0,1% v / v F-127.
- Tell cellene med en Coulter-teller, hemacytometer, eller flowcytometer. Juster cellesuspensjonen til en tetthet på 1 x 10 6 5 x 10
- Plasser cellesuspensjon i et strømningscytometer røret og kobles til trykklokket. Før tilkobling av slangen til mikrofluid enhet, justere trykket til omkring 14 til 21 kPa, og i flukt inntil cellesuspensjonen kommer ut fra toppen av røret. Dette vil hjelpe til å minimalisere luftbobler i slangen og enheten.
- Sett tuppen av slangen som inneholder cellesuspensjonen inn i innløpet til enheten. Hvis enheten er bundet til et dekkglass, plasser enheten på et flatt, fast underlag som mikroskopet scenen før du kobler til slangen; dekkglass er skjør og kan ellers bryte.
- Sett et stykke slange into utløpsåpningen, og rute den til en tom tube for avfalls for eksempel en tom Falcon rør tapet til siden av objektbord. For konsistens i den generelle fluidic motstanden av anordningen mellom eksperimenter, at innløp og utløpsslangen er av samme diameter og tilnærmet samme lengde for hvert eksperiment.
- Forsiktig rampen opp trykket til ca 28 kPa eller til cellene strømme gjennom kanalene. Plasser-enheten, slik at flere kanaler står i synsfeltet, og er vinkelrett på bunnen av skjermen. Hvis kameraet er begrenset av datastørrelse, erverve flere videoer for å generere et tilstrekkelig antall uavhengige datapunkter. Juster bildefrekvensen som er nødvendig for den ønskede datautgang. For å fange opp endringer i cellen form, bruke hurtig bildebehandling høy på 300 bilder per sekund (fps); å måle transittider av celler, kan du bruke bildefrekvens på ca 100 fps.
5. Data Analysis
- Åpne filen Master_script.m (Nedlastbar Supplemental File) og kjør programmet.
- Velg den første videoen som skal analyseres fra Windows Utforsker-vinduet som vises. Angi bildefrekvensen for det valgte video og trykker på enter.
MERK: En figur vises som ber brukeren om å velge en rektangulær beskjæring vindu for den første videoen. - Velg et vindu som omfatter alle kanalene fra venstre til høyre og krysser kanalene rett over det første pære av rekke kanaler øverst og nederst (figur 3).
- Velg innsnevring regioner fra det beskårede bildet. Legg spesielt merke til å opprettholde en fast piksel avstanden mellom nederste og øverste vindusgrense for hver video valgt.
MERK: Det øverste vinduet kanten angir den øverste innsnevring og nederste vinduet kanten angir nederste innsnevring (figur 4); mellom restriksjonar er rundet fra denne brukerens input. Deretter viser algoritmen de segmentation av celler for de første 50 rammer fra hver video (figur 5). - Overvåk øvre venstre bilde (figur 5A) tett for å fastslå om algoritmen er nøyaktig lokalisere celler; en binarized bilde er overlagret på videokilde for å demonstrere plasseringen av identifiserte cellene.
MERK: De ulike vinduer, (Tall 5B-5D) er for code diagnose og demonstrere videobilder etter spesifikke bildebehandlingsoperasjoner. - Velg den neste videoen som skal behandles fra Windows Explorer-vinduet.
MERK: Algoritmen vil gjenta trinn 05.02 til 05.05 for hver video valgt. - Velg Avbryt Når alle videoer er lagt via Windows Utforsker-vindu til å instruere den funksjonen som videolisten er komplett.
MERK: Algoritmen skal utføre de gjenværende virksomhet uten brukermedvirkning. Dette vil ta ca 1-2 timer avhengig av antall videoer bearbeidet og data performance. Ved ferdigstillelse vil algoritmen produsere et histogram av transitt tid data og lagre dataene i katalogen som en MATLAB .mat fil og en Microsoft Excel XLS-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke formbarhet av ulike celletyper, menneske myelogen leukemi celler (HL-60), differensierte nøytrofile celler, mus lymfocyttceller og menneskelige eggstokkreft cellelinjer (OVCAR8, HEYA8) er evaluert ved hjelp av "Cell Deformer 'microfluidic teknikk. Representative resultater for overføringstiden av HL-60-og nøytrofil-type HL-60-celler som viser tidsskalaen for en enkelt celle til transitt gjennom en rekke innsnevringer, som vist i figur 6. Transittiden måles for en populasjon av individuelle celler hos hver 7 mikrometer innsnevring i en serie på 7 innsnevringer ved et drivende trykk på 28 kPa (figur 6).
Som vist i figur 6, HL-60-celler midlertidig okkluderer den første innsnevring for en median tid på 9,3 ms før passering gjennom de etterfølgende innsnevringer. I motsetning til dette, neutrofil-type HL-60-celler som okkluderer den første innsnevring i bare 4,3 ms føraging. Jo kortere overføringstiden av HL-60 celler er i samsvar med deres reduserte elastiske og viskøse moduler, som bestemmes av atomic force mikroskopi 21 og mikropipette aspirasjon 22. Disse resultatene er også i overensstemmelse med de reduserte nivåer av mechanoregulating protein, Lamin A, som avgjør transittider av celler gjennom mikron-skala hull 23. En gang gjennom den første innsnevring, celler transitt raskere gjennom de resterende innsnevringer, 2-7, med en median overføringstiden av 4,0 msek for HL-60-celler og 3,3 msek for nøytrofil-typeceller (figur 6). Mens HL-60-celler fremdeles oppviser litt lengre, men betydelige transittider (C2-C7, p = 1.7E-9), fordelingen av transittider for innsnevringer 2-7 er nesten identiske for hver celletype. Observasjonen av den lengre tid som kreves for transitt den første innsnevring kan gjenspeile at de viskoelastiske cellene ikke helt slappe til sin opprinnelige form on disse ~ msek tidsrammer. Dette problemet kan også forklares med irreversible strukturendringer som utvikler inne i cellen, og letter deres transitt gjennom de påfølgende mikron-skala hullene. Viktigere, ved å sammenligne transittiden blant cellepopulasjoner, selv for første innsnevring, kan avsløre forskjeller i sin formbarhet 23.
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av det eksperimentelle oppsettet. . A. 'Cell Deformer' enhet i den eksperimentelle oppsett som viser tilkobling av eksterne enheter B. Enheten utformingen har 4 funksjonelle regioner: entry port, cellefilter, innsnevring array, og exit port. Arkitektur av microfluidic enhet som viser de viktigste funksjonene; innfelt viser en fallende lys bilde av den innsnevrede kanaler. Skala, 10 μ ; Moh.
Figur 2. tekniske tegninger for en tilpasset cap å trykkcelle mediene i et flowcytometer tube.
Figur 3. demonstrasjon av hvordan du velger den regionen av interesse for videobilde beskjæring.
Figur 4. demonstrasjon av hvordan du velger innsnevring steder.
51474fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Observasjon vinduet brukes til å bekrefte at algoritmen identifiserer riktig celle steder som de behandler gjennom innsnevring array. A. Binarized bildet legges oppå kildevideo for å vise plasseringen av cellene B. Difference bildet,. C. Bottom lue filtrert bilde, D. Median filtrert.
Figur 6. Representative transitt tidsmålinger som funksjon av innsnevring nummer. A. HL-60 celler utviser en lengre transporttid gjennom første innsnevring enn B. Atrå-behandlet HL-60 (nøytrofile-type) celler. En sammenligning av den transform passage time (log10) gjennom den første innsnevring vurdert på bakgrunn av parametriske Mann-Whitney test avslørerforskjellen er signifikant, p = 1.47E-5. Celler typisk transitt gjennom den første innsnevring saktere enn de etterfølgende innsnevringer. Dataene er vist her for celler i transitt gjennom 7 mikrometer-store innsnevringer ved et drivende trykk på 28 kPa. Celletetthet, gjennomsnittlig cellediameter, og konsentrasjon av overflateaktivt er gitt i tabell 1 HL-60, N = 77.; Atrå-behandlet HL-60, N = 97. Resultatene ble kopiert i uavhengige eksperimenter i løpet av tre ulike dager.
Figur 7. Oversikt over MATLAB script for å måle transittiden. Den første sløyfen krever brukermedvirkning og observasjon for de første 50 rammer for hver video. Etter den første sløyfen, vil hele programmet kjøres uten brukermedvirkning og automatisk samler og data tomter befolknings.
Tabell 1. Tidligere studert cellesystemer og deres driftsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en omfattende eksperimentell prosedyre for å analysere deformasjon av celler i transitt gjennom snørt microfluidic kanaler ved hjelp av trykkraft. En MATLAB script muliggjør automatisert databehandling (Supplemental Material); en oppdatert versjon av koden er opprettholdt ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). I videre forstand kan de teknikker som er presentert her tilpasses i mange cellebaserte assays microfluidic, herunder virkningen av cytoskeletal og atom avstivende midler 24,23 samt analysering av deformerbarhet av kreftcelletyper 4,5. Tatt sammen med høyere oppløsning mikros til bilde subcellulære deformasjoner, gir denne metoden en kraftig tilnærming for å studere celle mekaniske egenskaper og endringer som oppstår i fysiologiske og patologiske tilstander.
Automatisk Cell prosesseringsalgoritme
Figur 7, og settet med MATLAB funksjoner er gitt i tilleggsinformasjon. I korte trekk, blir brukeren bedt om å velge alle videoene til å analysere; beskjære hver video for regionen av interesse; og angi en bildefrekvens på settet med videoer; Deretter, prosesserer programvaren automatisk videodata for å bestemme gangtiden for hver celle for hver innsnevring. Det er visse krav til skriptet for å operere: cellene skal strømme fra toppen av rammen til bunnen av rammen i video; microfluidic enhet posisjon og lysforholdene bør ikke endres nevneverdig over varigheten av videoen; og videoene må være i AVI-format. Viktigere, sporingsalgoritme inneholder celler som både går inn og passage i tidsvinduet for en enkelt video-opptak, som er ca 8 sek. Derfor er en hvilken som helstobjekter som har en lengre transporttid er ekskludert fra analysen. Ved å utføre bakgrunn subtraksjon, blir gjenstander som er til stede gjennom hele video fjernet fra analysen. Koden implementerer også en mindre størrelse cutoff, som kan stilles inn av brukeren. Størrelsen cutoff for videoanalyse var 5 piksler, som tilsvarer en cellediameter på 2,7 mikrometer.
Siden høyhastighets video datafiler kan være betydelig (~ 500 MB), er programmet beregningskrevende. Koden er mest effektivt kjøre bruker en stasjonær datamaskin med minst 6 GB RAM og en 64-bit-brikkesett med enten en lokal harddisk med minst en 1 TB kapasitet eller tilkobles med en stor ekstern harddisk eller dataserver med en USB 3.0 , FireWire, eller Ethernet-tilkobling. Data sendes ut i et histogram format for rask visualisering av resultater; det er også ordnet som data som er lagret i en MATLAB (.mat) datafil og i et Excel-regneark.
Koden som er presented en enkel måte å sammenlikne cellepopulasjoner ved analyse av transittiden for celler til passasjen gjennom hver innsnevring. For mer detaljerte analyser, kan koden bli utvidet til å undersøke andre parametere inkludert cellestørrelse, størrelsesforholdet, så vel som avslapning tidsskala. Tidligere studier viser bare en svak avhengighet av cellestørrelse på transitt tid seks.
Enhetsrelaterte fallgruvene
Okkluderte kanaler er en stor hindring i noen flyt eksperiment. Celleadhesjon til enhetens vegger vil forstyrre strømmen av celler gjennom de innsnevrede kanaler: celler kan observeres for å smøre ut langs kanalveggene. For å hindre vedheft, er avgjørende skikkelig overflatebehandling med F-127.
Overflateegenskaper PDMS endring med tid etter plasma behandling, som gjengir PDMS midlertidig hydrofile 25,26. I løpet av en uke, hydrofile PDMS flater sakte utelattgenerere til deres naturlige hydrofobe overflateenergi; Dette kan utfordre fjerning av luftbobler gjennom kanalene. Enhetene bør derfor brukes innen syv dager plasma behandling. Viktigst, bør tiden mellom plasma-behandling og deformerbarheten analysen være konsistent på tvers av alle eksperimenter.
Mens vi har lykkes skilles transittider mellom forskjellige celletyper som bruker enheter fabrikkert med et glassgulv og tre PDMS vegger, kan enhetene også være fabrikkert slik at de har uniform overflateegenskaper på alle fire kanalvegger 27. Den PDMS-enheten kan være bundet til et glass-substrat spincoated med et tynt lag PDMS: bland herder for å basere i et forhold på 1: 5 (vekt / vekt), helles ut på enheten mugg, og herde i 20 min ved 65 ° C . I mellomtiden spincoat et tynt lag av 1:20 (w / w) herder til å basere på glass-substrat; bake ved 85 ° C i 4 min. Plasser PDMS enhet på PDMS-belagt lysbilde, og være ferdig over nattenå fullføre bonding. Denne metoden er også verdifullt dersom en plasma-maskin for glass PDMS-binding ikke er tilgjengelig.
Cell-relaterte fallgruver.
høne forbereder cellesuspensjonen, er tettheten av celler kritisk: hvis celletettheten er for lav, vil cellen transitt tilfelle være sjeldne; Hvis celletettheten er for høy, vil det være flere celler aging en enkelt kanal samtidig, vil trykkfallet over en enkelt celle ikke være konsistent, og det vil være vanskelig å avgrense individuelle celler med en automatisert script.
Mens eksperimenter blir typisk utført i løpet av 30 min av cellesuspensjoner blir fremstilt, kan cellene utfeller til bunnen av trykk-kammeret over lengre perioder med> 30 min. For å unngå settling over lengre tidsperioder, kan trykkammeret og tilkoble slangen være periodisk rotert. For lengre eksperimenter, kan en liten magnetisk oppsikt bar legges til cell suspensjon, med en røreplate plassert under trykk-kammeret for å agitere cellene og forhindre settling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Lloyd Ung for konstruktive innspill i tidlige versjoner av denne teknikken, Dr. Jeremy Agresti for trykklokket design tips, og Dr. Ping Qi for hans hjelp i fabrikasjon trykklokket. Vi er takknemlige for laboratorier av M. Teitell og P. Gunaratne for å gi en rekke celleprøver for testing. Vi er takknemlige for National Science Foundation (KARRIERE Award DBI-1254185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, og UCLA Clinical og Translasjonell Science Institute for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
