Summary
Vi visar en mikrofluidik-baserad analys för att mäta tidsplanen för celler att passera genom en sekvens av micron skala förträngningar.
Abstract
Här kommer vi i detalj konstruktion, tillverkning och användning av en mikrofluidanordning för att utvärdera deformerbarheten av ett stort antal enskilda celler på ett effektivt sätt. Normalt kan data för ~ 10 2 celler förvärvas inom en 1 timme experiment. En automatiserad bildanalys programmet möjliggör effektiv efter experiment analys av bilddata, så att behandlingen vara klar inom några timmar. Vår anordning geometri är unik i det att cellerna måste deformeras genom en serie av mikron-skale förträngningar och därigenom möjliggöra den initiala deformationen och tidsberoende relaxation av individuella celler som skall analyseras. Tillämpningen av denna metod för att den mänskliga promyelocytisk leukemi (HL-60) celler demonstreras. Körning celler att deformeras genom micron skala förträngningar som använder tryckdriven strömning, observerar vi att den mänskliga promyelotiska (HL-60) celler tillfälligt täppa första sammandragning under en mediantid på 9,3 msek före passaging snabbare genom den efterföljande sammandrajoner med en median transittiden för 4,0 msek per sammandragning. Däremot, all-trans-retinsyra-behandlade (neutrofil-typ) HL-60-celler ockludera den första förträngningen endast 4,3 ms innan ympa om genom de efterföljande förträngningar med ett median transittid av 3,3 msek. Denna metod kan ge en inblick i den viskoelastiska natur celler, och i slutändan avslöja de molekylära ursprunget till detta beteende.
Introduction
Förändringar i cellform är kritiska i många biologiska sammanhang. Till exempel, erytrocyter och leukocyter deformeras genom kapillärer som är mindre än sin egen diameter 1. I metastas, måste cancerceller deformeras genom smala interstitiell luckor samt slingriga kärl och lymfatiska nätverk till utsäde på sekundära platser 2. För att undersöka den fysiska beteendet hos enskilda celler, mikrofluidikanordningar presentera en idealisk plattform som kan anpassas för att studera en rad olika cell beteenden inklusive deras förmåga att migrera genom smala spalter 3 och passivt deformeras genom micron skala förträngningar 3- 9. Polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidikanordningar är optiskt transparent, så att cell deformationer som ska visualiseras med ljusmikroskop och analyseras med hjälp av grundläggande bildbehandlingsverktyg. Dessutom kan arrayer av förträngningar definieras exakt, vilket möjliggör analys av flera celler samtidigt med engenomströmning som överstiger många existerande tekniker 10,11.
Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för undersökning cell deformerbarhet med hjälp av "Cell Deformer 'PDMS mikroflödessystem enhet. Enheten är utformad så att celler passage genom sekventiella förträngningar; denna geometri är vanligt i fysiologiska sammanhang, till exempel lung kapillärbädd 12. För att mäta cell deformerbarhet, ger transittid ett bekvämt mått som lätt mäts som den tid som krävs för en enskild cell till transit genom en enda sammandragning 4,6. För att upprätthålla ett konstant tryckfall över den förträngda kanaler under celltransit använder vi tryckdrivet flöde. Vår protokoll innehåller detaljerade instruktioner om enheten design och tillverkning, enhetens funktion av tryckdriven strömning, förberedelse och avbildning av celler, samt bildbearbetning för att mäta tiden för celler att deformeras genom en serie av förträngningar. Vi inkluderarbåde enhets design och visioner databehandlingskoden som tilläggsfiler. Som ett representativt urval av uppgifter, visar vi celltransittiden genom en serie av förträngningar som en funktion av antalet förträngningar passe. Analys av tidsplanen för celler till transit men smala förträngningar i ett mikroflödessystem enhet kan avslöja skillnader i deformerbarhet av olika celltyper 4,5,13. Enheten demonstreras här granskar unikt cell transit genom en serie micron skala förträngningar; denna design emulerar den slingrande banan att celler upplever i cirkulation och gör det också möjligt att sondera ytterligare fysikaliska egenskaper hos de celler såsom relaxationstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 mikroflödessystem enhet Design
OBS: Enheten design har fyra grundläggande funktionella regioner: inresa port, cellfilter, förträngning array, och avsluta port (Figur 1). Den övergripande designen kan tillämpas på ett brett spektrum av celltyper, med smärre justeringar dimensioner. Förutsatt här är några grundläggande designrekommendationer tillsammans med enhetens parametrar som är effektiva för ett urval av både primära och förevigade celler.
- Välj bredden av sammandragning array kanaler (figur 1B) för att vara approximativt 30 till 50% av den genomsnittliga celldiametern; denna sammandragning-till-cell storleksförhållande leder till allvarlig cell deformation men minimal igensättning. Givet en celltyp som inte tidigare prövats, är det klokt att utforma ett utbud av sammandragning bredder från ~ 30-50% celldiametern för att hitta den optimala bredden. Som med många typer av mikroflödessystem enheter, kan mer än 120 enhets mästare formar mönstras på en syndgle 4 tums kiselskiva, som möjliggör en mängd olika anordnings mönster som skall framställas i en enda tillverkningsprocess.
- Välj kanalhöjden att vara minst 50% av celldiameter; detta garanterar cellen begränsas i 2 dimensioner. För att förhindra kanal kollapsar under bindning, se till att bildförhållandet kanalen är inte mindre än 1:10 (höjd: bredd) genom hela enheten. För kanaler som får överstiga detta bildformat, lägga stödstolpar för att förhindra kollaps. Rymdstödstolpar på ett avstånd som är minst två gånger celldiametern att den inte påverkar cellflöde.
- Inkludera ett filter på ingångsportar för att ta bort skräp och dela upp cellkluster (Figur 1B). Justera storleken och avståndet mellan filter inlägg så att avståndet som skiljer de inlägg är ungefär lika med en celldiameter.
OBS: Den undre gränsen för systemdimensionen sätts av den upplösning som litografimasken skrivs. Se till att alla funktioner är inom resolution som fastställs av masken leverantören.
2. Leveranser och beredning
OBS: Innan något experiment, ska följande vara beredd. En schematisk bild av hela installationen ges i figur 1.
- Tillverka enheten befälhavaren använda standardtekniker för litografisk mikrobearbetning 14,15. Kontrollera höjden på de mönstrade funktioner med hjälp av en profilometer.
NOTERA: Medan masters kan lätt tillverkas i en renrumsanläggning har vissa labb utvecklat billiga litografimetoder för användning i en semi-ren miljö 16,17. - Förbered luftkälla för tryckdrivet flöde, med användning av en tank med komprimerad luft och sekvensen för luftregulatorer och beslag (Figur 1A).
- Inrätta en lufttillförsel tank och manuell regulator.
ANMÄRKNING: En komposition av 5% CO2 i luft bibehåller en liknande miljö som ett typiskt cellodlings incubator, men andra gasblandningar kan också användas. - Sätt upp en elektroniskt styrd tryckregulator i-linje med manuell regulator. Använd en elektro-pneumatisk omvandlare för att reglera och upprätthålla ett stabilt tryckfall över kanalerna, med tryckfluktuationer på mindre än 2 kPa. Använd den enkla kod skriven i LabVIEW (kompletterande information) för att mata in det önskade trycket.
OBS: Den elektropneumatiska omvandlare använder en inre återkopplingsslinga för att justera ventilutloppstrycket för att matcha det angivna trycket över mikrofluidikanordning. - Sätt upp en trycksatt kammare för att driva flödet av cellsuspensionen. Sätt ihop en cellsuspension kammaren ut ur en standard flödescytometer röret och en maskinbearbetad lock som skapar en trycktät försegling på röret.
OBS: Den tryckkammarlocket innehåller två öppningar: ett inlopp som kan anslutas till tryckluftstanken och ett utlopp genom vilket celler rinner från den trycksatta kammaren i anordningen (Figure 2).
- Inrätta en lufttillförsel tank och manuell regulator.
- Konfigurera ett inverterat mikroskop utrustat med en kamera som har en upptagningshastighet av åtminstone 100 bilder per sekund för att fånga bilder av cellerna som strömmar genom strypningen array. Gränssnitt kameran med ett videokort och en dator.
- Förbered ett lager ytaktiv lösning av 10 vikt / vikt% Pluronic F-127 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) såsom tillsats av en liten mängd av F127 till cellmedielösning kommer att hjälpa till att minimera celladhesion till PDMS väggarna. För att förbereda F127 lösningen, virvel och värm försiktigt vid 37 ° C för att lösa upp F127. Före användning, låt lösningen genom ett 0,2 um sprutfilter och förvara i rumstemperatur. Förbered tensidlösningen i förväg som virvelbildning och filtrering kommer att generera bubblor som kommer att kvarstå i mer än 24 timmar.
3 mikroflödessystem enhet Fabrication
- Tillverka PDMS block med mikrofluidiska kanaler.
- Blanda PDMS noggrant enta förhållandet 1:10 (vikt / vikt) härdare till basen.
- Häll blandningen över enheten master (Steg 2.1). Degas i en glaskupa med anbringat vakuum tills de infångade bubblorna försvinner, eller under omkring 10 till 20 min.
OBS: Efter denna tid, kan det fortfarande finnas bubblor på luft PDMS gränssnitt, vilket är normalt; rör sig vanligen försvinner under gräddningen. Det är mest kritiska för att säkerställa att det inte finns några kvarstående bubblor angränsande till kanalerna. - Baka den avgasade anordningen vid 65 ° C under 4 tim. För att förhindra att kanalerna från att kollapsa, baka enheten över natten för att ytterligare tvärbinda PDMS för en enhet med en högre elasticitetsmodul som är mer resistent mot kanal kollaps. Observera dock att förlängd bakning embrittles också PDMS och kan leda till sprickbildning vid stansning hål (Steg 3.3).
- Ta mikrofluidikanordningar från master mögel. Skär enskilda mikrofluidikanordningar av PDMS blocket med ett rakblad och ta bort enheten från mastener. Börja med att försiktigt lyfta upp ena hörnet på enheten; långsam och mild peeling, till skillnad från att lyfta PDMS blocket rakt upp, minskar belastningen på både PDMS och master.
- Stansa hål i PDMS-enheten för att skapa anslutningsportar för tillträde mellan slang och mikrokanaler. Skapa hålen med en biopsistans och stansa från kanalens sida genom att den yttre sidan av anordningen.
OBS: En biopsi stans med en 0,75 mm hålstorlek skapar hål som gränssnitt perfekt med polyetereterketon (PEEK) slang (ytterdiameter = 1/32 "eller 0,79 mm) eller polyeten slang (PE-20, ytterdiameter = 0,043" eller 1,09 mm ). Använd en ring ljus för att visualisera hål i enheter med grunda kanaler 18. Se till att biopsistans är skarp; efter upprepad användning i framkant dämpar och biopsistans ska kasseras och bytas ut. - Skölj PDMS enheten med isopropanol (HPLC-kvalitet) för att ta bort damm och förvarade bitar av PDMS. Kontrollera attstansade hål är fritt från skräp genom att rikta en stadig ström av ren isopropanol från en klämflaska genom hålen. Föna med filtrerad luft. Efter rengöring, placera PDMS block med kanaler sidan upp i en ren petriskål för att upprätthålla enhetens renlighet. Vid behov, lagra enheter i denna form tills bindning.
- Rengör glassubstrat genom sköljning med metanol (HPLC-kvalitet), föna med filtrerad luft och placera på en 200 ° C kokplatta i 5-10 min för att säkerställa att glaset är helt rena och torra innan plasmabehandling.
OBS: Den glassubstratet bildar botten av varje kanal. Typiskt en glasskiva räcker, eftersom en 10X eller 20X objektiv är perfekt för avbildning flera kanaler parallellt. För högre upplösning avbildning, binda enheten till ett täckglas (# 1.5 tjocklek). - Binda PDMS enheten till glassubstratet.
- Syre plasma behandla sidokanal av PDMS-block och en sida av en glasskiva.
OBS: Wed en handhållen urladdningsenhet, använd en behandlingstid på 1 min, men optimera behandlingstiden för varje syreplasmaapparaten. - Placera sidokanal av PDMS på toppen av den behandlade sidan av glaset omedelbart efter behandling.
- Håll tillsammans med lätt tryck för ~ 10 sek för att främja bindning. Baka hela anordningen vid en förhöjd temperatur (60-80 ° C) under åtminstone 15 min för att förbättra bindningsstyrkan.
- Syre plasma behandla sidokanal av PDMS-block och en sida av en glasskiva.
4 deformerande celler genom förträngda kanaler
- Inspektera mikrofluidikanordning under ett mikroskop. Se till att kanalerna inte kollapsat eller brytas och att både inlopp och utlopp hål ansluter direkt till enheten kanalerna med hjälp av en låg effekt mål (10X). Utse defekta enheter genom att göra poäng ytan av PDMS med ett rakblad och inte använder dem för experiment.
- Förbered cellodlingsprover som skall analyseras. Kultur-celler med användning av standardbetingelser.
- Feller exempelvis odlings HL-60-celler i RPMI-1640-medium kompletterat med 1% penicillin-streptomycin-lösning och 10% fetalt bovint serum i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- För anhängare celler, skörda dem genom trypsinisering och återsuspendera i färskt odlingsmedium. Använd en vanlig trypsinization protokoll; till exempel lägga till ~ 0,5 ml trypsin till en kolv med 25 cm 2 odlingsområde, och slamma i ~ 30 ml färskt medium. Deri HL-60 celler till neutrofil-typ celler genom all-trans-retinsyra (ATRA) vid en slutlig koncentration av 5 | iM per 1 x 10 5 celler / ml såsom beskrivits tidigare 19,20.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 3 min, försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna till den lämpliga slutliga densiteten i färskt odlingsmedium med 0,1% vol / vol F-127.
- Räkna cellerna med användning av en Coulter-räknare, hemacytometer eller flödescytometer. Justera cellsuspension till en densitet av 1 x 06-5 oktober x 10
- Placera cellsuspensionen i en flödescytometer röret och ansluta till trycklocket. Innan du ansluter slangen till mikroflödessystem enhet, justera trycket till ca 14-21 kPa och spola tills cellsuspensionen kommer ut ur spetsen på slangen. Detta kommer att hjälpa till att minimera luftbubblor i slangen och anordningen.
- In spetsen på slangen innehållande cellsuspensionen in i inloppsanordningen. Om enheten är bunden till ett täckglas, placera enheten på en plan, fast yta såsom mikroskop scenen innan du ansluter slangen; täckglas är skör och kan annars gå sönder.
- Sätt en bit slang into utgångsöppningen och dra den till ett tomt rör för insamling av avfall som ett tomt Falcon rör tejpade på sidan av mikroskop scenen. För enhetlighet i den övergripande fluid ingångsresistans mellan experiment, se till att slangen inloppet och utloppet är av samma diameter och ungefär samma längd för varje experiment.
- Ramp försiktigt upp trycket till ca 28 kPa eller tills cellerna flyter genom kanalerna. Placera apparaten så att multipla kanaler är i synfältet och är vinkelräta mot den nedre delen av skärmen. Om kameran är begränsad av datastorlek, skaffa flera videoklipp för att generera ett tillräckligt antal oberoende datapunkter. Justera bildhastighet som behövs för den önskade datautgång. För att fånga upp förändringar i cellform, med hög hastighet bildbehandling på 300 bilder per sekund (fps); att mäta transittider celler, använder bildhastighet på ca 100 fps.
5. Data Analysis
- Öppna filen Master_script.m (Nedladdningssupple File) och kör programmet.
- Välj den första videon som ska analyseras från Windows Explorer-fönstret som visas. Ange bildhastigheten för den valda videon och tryck på enter.
OBS: En siffra visas som uppmanar användaren att välja en rektangulär beskärning fönster för den första videon. - Välj ett fönster som omfattar alla kanalerna från vänster till höger och skär kanalerna precis ovanför den första glödlampan av uppsättningen av kanaler vid toppen och botten (fig 3).
- Välj de förträngnings regioner den beskurna bilden. Var särskilt uppmärksam för att upprätthålla ett fast pixel avståndet mellan den övre och nedre fönstret gräns för varje video valt.
OBS: Den övre fönsterkanten anger den översta sammandragning och nedre fönsterkant anger den nedersta sammandragning (Figur 4); mellanliggande förträngningar approximeras från denna användare input. Härnäst visar algoritmen de aregmentation av celler för de första 50 bildrutor i varje video (Figur 5). - Övervaka den övre vänstra bilden (figur 5A) noggrant för att bestämma om algoritmen är exakt lokalisera celler; en binära bilden är överlagrad på käll video för att visa platsen för identifierade celler.
OBS: De olika fönster, (figur 5B-5D) är för kod diagnos och demonstrera bildrutor efter specifika bildbehandlingsoperationer. - Välj nästa video som ska bearbetas från Windows Explorer-fönstret.
OBS: Algoritmen kommer att upprepa steg 5,2-5,5 för varje video valt. - Välj Avbryt när alla önskade videor har lagts via Windows Explorer-fönstret för att instruera den funktion som videolistan är klar.
OBS: Algoritmen utför den kvarvarande verksamheten utan att användaren behöver. Detta kommer att ta ca 1-2 timmar beroende på hur många filmer som behandlas och dator performance. Efter avslutad, kommer algoritmen producerar ett histogram av tidsdata transitering och spara data i katalogen som en MATLAB .mat fil och ett Microsoft Excel xls-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka deformerbarhet olika celltyper, humana myeloida leukemiceller (HL-60), differentierade neutrofila celler, mus lymfocytceller och humana äggstockscancercellinjer (OVCAR8, HEYA8) utvärderas med hjälp av "Cell Deformer" mikroflödesteknik. Representativa resultat för transittiden för HL-60 och neutrofil-typ HL-60 celler visar tidsskalan för en enda cell till transit genom en serie av förträngningar, som visas i figur 6. Transit tiden mäts för en population av enskilda celler vid varje 7 um sammandragning i en serie av 7 förträngningar vid ett drivtryck av 28 kPa (Figur 6).
Som visas i figur 6, HL-60 celler täppa tillfälligt den första sammandragning under en mediantid på 9,3 msek före passaging genom de efterföljande förträngningar. Däremot neutrofil-typ HL-60 celler täppa den första sammandragning endast 4,3 millisekunder innanpassaging. Den kortare transittid av HL-60-celler är i överensstämmelse med deras reducerade elastiska och viskösa moduler, som bestäms med atomkraftsmikroskopi 21 och mikropipett aspiration 22. Dessa resultat överensstämmer också med de minskade nivåerna av mechanoregulating protein, lamin A, som avgör transittider av celler genom mikrometerskala gap 23. En gång genom den första sammandragning, celler transit snabbare genom de återstående förträngningar, 2-7, med en mediantransittiden för 4,0 msek för HL-60 celler och 3,3 msek för neutrofila-typ celler (Figur 6). Medan HL-60 celler uppvisar fortfarande något längre men betydande transittider (C2-C7, p = 1,7E-9), fördelningen av transittider för förträngningar 2-7 är nästan identiska för varje celltyp. Observationen av den längre transit tid som krävs för det första sammandragning kan spegla att de viskoelastiska cellerna inte helt slappna av till sin ursprungliga form on dessa ~ ms tidsramar. Detta kan också förklaras med irreversibla strukturförändringar som utvecklas i cellen, och underlätta deras transitering genom de efterföljande micron skala luckor. Viktigt är, genom att jämföra transittid bland cellpopulationer, även för den första förträngningen, kan avslöja skillnader i deras deformerbarhet 23.
Figur 1 Schematisk illustration av experimentuppställning. . A. "Cell Deformer" enhet i experimentuppställning som visar de perifera anslutningar B. Enheten design har fyra funktionella regioner: inresa port, cellfilter, förträngning array, och avsluta port. Arkitektur av mikroflödessystem enhet som visar sina främsta egenskaper; infällda bilden visar en transmitterad ljusbild av den förträngda kanaler. Skala, 10 μ ; M.
Figur 2. Tekniska ritningar för en anpassad lock för att trycksätta cellmedier som finns i en flödescytometer rör.
Figur 3 Demonstration av hur man väljer regionen av intresse för video bildruta beskärning.
Figur 4 Demonstration av hur man väljer förträngnings platser.
51474fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5 Observation fönster som används för att verifiera att algoritmen identifierar korrekt cellplatser som de bearbetar genom förträngningen array. A. binära bilden överlagras på källvideon för att visa placeringen av cellerna B. Skillnad bild;. C. Botten hatt filtrerad bild, D. Median filtreras.
Figur 6. Representativa transittidsmätningar som en funktion av sammandragning nummer. A. HL-60 celler uppvisar en längre transittid genom den första sammandragning än B. ATRA-behandlade HL-60 (neutrofil-typ)-celler. En jämförelse av den transformerade passagetiden (log10) genom den första sammandragning utvärderat enligt nonparametric Mann-Whitney testet avslöjarSkillnaden är signifikant, p = 1.47E-5. Celler typiskt transit genom den första sammandragning långsammare än de efterföljande förträngningar. Data visas här för celler som transiteras genom 7 pm-omfattande förträngningar vid ett drivande tryck av 28 kPa. Cell densitet, medelcelldiameter, och koncentrationen av ytaktivt medel ges i Tabell 1 HL-60, N = 77. ATRA-behandlade HL-60, N = 97. Resultat replikeras i oberoende experiment under loppet av tre olika dagar.
Figur 7 Översikt av MATLAB-skript för att mäta tiden transit. Den första slingan kräver åtgärder från användaren och observation för de första 50 bildrutor för varje video. Efter den första slingan, kommer hela programmet körs utan att användaren behöver och automatiskt sammanställer och tomter befolkningsuppgifter.
Tabell 1 Tidigare studerade cellsystem och deras driftsförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi en omfattande experimentell förfarande för att analysera deformationen av celler som transiteras genom dragna mikrofluidikkanaler använder tryckdriven strömning. Ett MATLAB-skript möjliggör automatisk databehandling (Supple Material); en uppdaterad version av koden bibehålls ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mer allmänt kan de metoder som presenteras här anpassas i många cellbaserade mikroflödesanalyser, inklusive effekten av cytoskeletal och nukleära förstyvningsmedel 24,23 samt analys deformerbarheten cancercelltyper 4,5. Tillsammans med högre upplösning mikroskopi för att bilden subcellulära deformationer, ger denna metod en kraftfull metod för att studera cell mekaniska egenskaper och förändringar som inträffar i fysiologiska och patologiska tillstånd.
Automatisk Cell Processing Algorithm
figur 7, och uppsättningen av MATLAB-funktioner finns i Tilläggsinformation. I korthet är användaren instrueras att välja alla videoklipp att analysera; beskära varje video för regionen av intresse; och ange en bildhastighet för uppsättningen av filmer; därefter bearbetar programvaran automatiskt videodata för att bestämma transittiden för varje cell för varje sammandragning. Det finns vissa krav för att skriptet ska fungera: celler bör flöda från toppen av ramen till botten av ramen i videon; mikroflödessystem enhet position och ljusförhållandena inte förändras nämnvärt under hela videon; och video ska vara i avi-format. Viktigt inkluderar spårningsalgoritm celler som både in och passage i tidsfönstret för en videoinspelning, vilket är ca 8 sek. Därför måste allaobjekt som har en längre transittid exkluderas från analysen. Genom att utföra bakgrundssubtraktion är objekt som är närvarande genom hela videon bort från analysen. Koden genomför också en lägre storleksgräns, som kan ställas in av användaren. Storleken cutoff för videoanalys var 5 pixlar, vilket motsvarar en celldiameter på 2,7 um.
Eftersom höghastighetsvideo datafiler kan vara betydande (~ 500 MB), är programmet beräkningsintensiv. Koden är mest effektivt köra använder en stationär dator med minst 6 GB RAM och en 64-bitars styrkrets med antingen en lokal hårddisk med minst en 1 TB kapacitet eller ansluten till en stor extern hårddisk eller dataserver med USB 3.0 , FireWire eller Ethernet-anslutning. Data matas ut i ett histogram format för snabb visualisering av resultat; Det är också i tabellen som data som lagras i en MATLAB (.mat) datafil och i ett Excel-ark.
Den kod som är presented erbjuder ett enkelt sätt att jämföra cellpopulationer genom analys av transittiden för celler till passagen genom varje sammandragning. För mer detaljerad analys kan koden utökas för att undersöka andra parametrar inklusive cellstorlek, bildförhållande, samt avkoppling tid. Tidigare studier visar endast en svag beroende cellstorlek på transittiden 6.
Enhetsrelaterade fallgropar
Tilltäppta kanaler är ett stort hinder i varje flödesexperiment. Celladhesion på enhetens väggar försämrar flödet av celler genom förträngda kanaler: celler kan observeras att smeta ut längs kanalväggarna. För att förhindra vidhäftning, är väsentligt korrekt ytbehandling med F-127.
Ytegenskaperna hos PDMS förändring med tiden efter plasmabehandling, vilket gör PDMS temporärt hydrofila 25,26. Under loppet av en vecka, hydrofila PDMS ytor från långsamtgenerera till deras naturliga hydrofoba ytenergi; Detta kan utmana avlägsnande av luftbubblor genom kanalerna. Enheter bör därför användas inom sju dagar efter plasmabehandling. Viktigast bör tiden mellan plasmabehandling och formbarhet analysen vara enhetligt för alla experiment.
Även om vi har lyckats särskilja transittider mellan olika celltyper som använder enheter tillverkade med ett glas golv och tre PDMS väggar kan enheter även tillverkas så att de har enhetliga ytegenskaper på alla fyra kanalväggarna 27. PDMS-enheten kan vara bunden till ett glassubstrat spinnbelagd med ett tunt PDMS skikt: blanda härdare att basera vid ett förhållande av 1: 5 (vikt / vikt), häll på anordningen mögel, och härda i 20 min vid 65 ° C . Samtidigt rotationsbestryka ett tunt lager av 01:20 (v / v) härdare att basera på glassubstrat; baka vid 85 ° C under 4 min. Placera PDMS-enheten på PDMS-belagda slide, avsluta baka över nattenför att fullborda bindningen. Denna metod är också värdefullt om en plasmamaskin för glas-PDMS bindning inte är tillgänglig.
Cellrelaterade fallgropar.
höna förbereder cellsuspensionen, är tätheten av celler kritisk: om celltätheten är för låg, kommer celltransitevenemang vara sällsynta; Om celltätheten är för hög, kommer det att finnas flera celler ympa om en enda kanal samtidigt, kommer tryckfallet över en enda cell inte att vara konsekvent, och det blir svårt att avgränsa individuella celler med en automatiserad skript.
Medan experimenten utförs typiskt inom 30 min av cellsuspensioner förbereds, kan cellerna sedimentera till botten av tryckkammaren över längre tider av> 30 min. För att undvika sedimentering över längre tidsperioder, kan tryckkammaren och anslutande slangar regelbundet roteras. För längre experiment kan en liten magnetisk omrörarstav tillsättas till cell suspension, med en omrörningsplatta belägen under tryckkammaren för att agitera cellerna och förhindra sedimentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Lloyd Ung för konstruktiv insats i tidiga versioner av denna teknik, Dr Jeremy Agresti för tryck cap design tips, och Dr Dongping Qi för hans hjälp vid tillverkning av trycklock. Vi är tacksamma för laboratorier M. Teitell och P. Gunaratne för att få olika cellprover för att testa. Vi är tacksamma till National Science Foundation (KARRIÄR Award DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, och UCLA klinisk och translationell Science Institute för att stödja detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
