Summary
Profiling molecolare delle cellule laser microdissezione e da stroma, modelli di cancro colorettale tissutale sintesi rappresenta un approccio nuovo e manipolabile per caratterizzare e sezionare la biologia distintivo all'interfaccia tra cellule tumorali al fronte invasivo e cancro associato cellule stromali.
Abstract
Invadere il cancro colorettale (CRC), le cellule hanno acquisito la capacità di liberarsi dalle loro celle sorelle, infiltrare lo stroma, e rimodellare la matrice extracellulare (ECM). Caratterizzare la biologia di questo gruppo fenotipicamente distinto di cellule potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione di eventi precoci durante la cascata metastatica.
Invasione tumorale è un processo dinamico facilitato dalle interazioni bidirezionali tra epitelio maligno e lo stroma cancro associato. Al fine di esaminare le risposte specifiche cellule al stroma-interfaccia tumore abbiamo combinato organotipica co-coltura e laser tecniche di micro-dissezione.
Modelli organotipica, in cui componenti stromali chiave come i fibroblasti sono 3 dimentioanally co-coltura con cellule epiteliali tumorali, sono strumenti sperimentali altamente manipolabile che consentono l'invasione e le interazioni tumore-stroma da studiare in near-phcondizioni ysiological.
Laser microdissezione (LMD) è una tecnica che comporta la dissezione chirurgica ed estrazione dei vari strati all'interno del tessuto tumorale, con precisione di micron.
Combinando queste tecniche con la genomica, trascrittomica e epigenetica profiling puntiamo a sviluppare una comprensione più profonda delle caratteristiche molecolari di invadere le cellule tumorali e circostante tessuto stromale, e in tal modo potenzialmente rivelare nuovi biomarcatori e opportunità per lo sviluppo di farmaci in CRC.
Introduction
Co-colture organotipiche sono modelli tissutale che aiutano a ricostruire in vivo microambiente tumorale in 3-dimensioni per giustapposizione di cellule epiteliali maligne e cellule stromali in un gel di collagene contenente componenti essenziali della matrice extracellulare 1-3. Principalmente concepito come un metodo per misurare invasione tumorale, organotypics ridurre la dipendenza da modelli animali in vivo, ed evitare le lacune di altre tecniche in vitro come saggi Transwell, in cui le cellule invasori sono costretti artificialmente in uno stato mono-disperso 2-4. L'inclusione di cellule stromali in questi modelli, quali fibroblasti, riflette il ruolo essenziale del microambiente tumorale maligna nella regolazione invasione e metastasi 3-4, tuttavia l'eterogeneità fenotipica dello stroma è tale che, al fine di massimizzare la rilevanza fisiologica di organotipico modelli, organo specifico, anatomicamente accurati ex vivofibroblasti dovrebbero essere inclusi ove possibile 3,6.
Organotypics sono una piattaforma versatile per studiare le interazioni tra tumore e le cellule stromali e sono sempre più utilizzati in nuovi modi per esaminare l'impatto sulla invasione tumorale di inibitori chimici e le alterazioni geniche mirate 7,8. Studiare il margine di tumore invasivo è una prospettiva particolarmente emozionante. In modelli organotipici, cancro colorettale fissato (CRC) linee cellulari producono tipicamente uno strato epiteliale ben stratificato, in sezione trasversale, le cellule che hanno acquisito la capacità di invadere la matrice extracellulare (ECM) sono facilmente distinguibili. Alla luce della eterogeneità micro-topografica consolidata di tumore e tumore associato cellule stromali in vivo, estrazione di queste cellule mediante microdissezione laser e studiare isolatamente, può rivelare importanti informazioni biologiche riguardanti le origini del colon-retto metastasi del cancro e come può essere più efficiente mirato. Ion la seguente metodologia, tutti i pazienti che hanno donato campioni di tessuto fornite per iscritto il consenso informato, e lo studio è stato approvato dalle istituzioni del comitato etico di ricerca regionali.
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Protocol
1. Istituzione di primaria fibroblasti culture da colon espianti
- Ottenere campioni di tessuto normale del colon umano mucosa direttamente dalla sala operatoria chirurgica, e sospendere in 7-10 ml di PBS completato con 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone.
- In laboratorio, porre il campione al centro di 10 cm piatto di coltura tissutale e lavare 3 volte con PBS / Pen-strep / Fungizone. Non aspirare dopo il lavaggio finale.
- Con pinze sterili e bisturi, tagliare il tessuto in piccoli pezzi (circa 2 mm) e posizionare ogni pezzo al centro di una croce disegnata con il bisturi in un 12-pozzetti. Rock the bisturi dolcemente sul tessuto per permettergli di aderire.
- Cultura esemplari in 750 microlitri mezzi di crescita dei fibroblasti primari (DMEM integrato con siero del 20% di vitello fetale (FCS), 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 292 mg / ml L-glutammina), che dovrebbe submerge tessuto senza consenta di galleggiare. Evitare di disturbare la piastra per i prossimi 5 giorni se non per ri-alimentazione ogni 2 giorni.
- Nel corso dei prossimi 5 giorni fibroblasti lentamente inizia a crescere fuori dal bordo del tessuto. A circa 7 giorni, questo sarà più visibile. Dopo circa 3-4 settimane, e se ci sono sufficienti fibroblasti crescita fuori, aggiungere 750 microlitri tripsina a ciascun pozzetto. Dopo che le cellule hanno staccato (che può richiedere 5-10 min), la piscina e il trasferimento di un tessuto pallone di T-25 cultura.
2. Organotipica Preparazione
Preparazione del fibroblasto impregnato gel organotipico:
- Preparare una sospensione cellulare di fibroblasti contenente 5 x 10 5 cellule per organotipico in DMEM supplementato con 10% FCS e 292 ug / ml di L-glutammina.
- Portare i gel organotipica sul ghiaccio, nei seguenti rapporti:
- 7 volumi di collagene Rat-coda: Matrigel mix (1:1)
- 1 volume di filtrato 10x DMEM
- 1 volume di FCS
- 1 volume di sospensione cellulare di fibroblasti contenente 5 x 10 5 fibroblasti
Per 9 gel (1 ml per gel) preparare 10 ml e mescolare delicatamente per evitare le bolle.
- Aggiungere 1 ml a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e incubare per 1 ora a 37 ° C in atmosfera umidificata per consentire gel per impostare. Dopo 1 ora aggiungere 1 ml di DMEM (10% FCS) / Glut sopra i gel e tornare alla incubatore notte.
- Il giorno seguente, medio aspirato dalla parte superiore dei gel e piastra 1 ml di supporto contenente 5 x 10 5 cellule epiteliali CRC.
Preparazione del gel spalmato fogli di nylon:
- Preparare sterile, teli di nylon in autoclave misura 1,5 centimetri x 1,5 centimetri, in anticipo.
- Utilizzando pinze sterili, inserire il numero di fogli di nylon in una capsula di Petri 10 centimetri (di solito 4 fogli di nylon possono essere ospitati a piatto).
- Portare gel su ghiaccio nel seguente ordine (250 microlitri totaleè necessaria volume per foglio di nylon):
- 7 volumi di collagene Rat-coda
- 1 volume di filtrato 10x DMEM
- 1 volume di FCS
- 1 volume di DMEM 10% FCS / Glut
- Se la soluzione è gialla, neutralizzare con l'aggiunta di 0,1 M NaOH in aliquote di 50 microlitri finché la soluzione diventa rosa.
- Aggiungere 250 ml di questa soluzione a ciascun foglio di nylon e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2 per 30 min per permettere gel per impostare.
- Portare soluzione di glutaraldeide 1% in PBS. Aggiungere 10 ml di ciascuna capsula di Petri 10 centimetri una volta che il gel ha impostato e incubare a 4 ° C per 1 ora.
- Fogli di nylon Lavare 3x in PBS 1x e in DMEM (10% FCS) / Glu e incubare una notte in DMEM / Glu a 4 ° C.
Alzando gel organotipica su griglie in acciaio per l'invasione:
- Pre-preparare le griglie ponteggio mediante piegatura lamiere di acciaio inox in una formazione treppiede. Autoclave prima dell'uso.
- Utilizzare pinze sterilizzate in etanolo da mettere una griglia in acciaio in ciascun pozzetto di una piastra ben sei.
- Collocare un foglio di nylon gel-rivestito con il lato superiore collagene, su ogni griglia.
- Trasferire accuratamente i gel organotipici dalla piastra a 24 pozzetti per il foglio di nylon sollevata con una spatola sterilizzato in etanolo.
- Riempire il pozzetto con DMEM 10% FCS / Glut supplementato con 10% FCS fino foglio di nylon è in contatto con il mezzo ma non sommersa. Assicurarsi che il mezzo non tocchi il gel organotipica.
- Incubare per 14 giorni a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2, sostituirà supporti ogni 2 giorni.
3. Organotipica Fixation
- Rimuovere tutta organotipica compreso foglio di nylon da bene e mettere su pellicola trasparente.
- Bisecare organotipica e foglio di nylon con un bisturi monouso pulito e fissare le due metà in formaldeide per 24 ore a temperatura ambiente.
- Sostituire formaldeide con il 70% ethanolo dopo 24 ore e lasciare per una notte prima di incorporare in paraffina, sezionamento e colorazione.
4. Microdissezione laser del Margine invasiva
- Sezione di 10 pm di spessore su una membrana diapositive intelaiate.
- Deparaffinare sezioni applicando xilene per 1 minuto, poi togliere xilene e fissare nel 75% di etanolo per un ulteriore 1 min.
- Rimuovere etanolo e macchia con 0,125% soluzione Cresyl Violet per 1 min. Cresyl Violet evidenzia le cellule epiteliali e consente una facile discriminazione dallo stroma.
- Rimuovere violetto cresolo e applicare il 100% di etanolo per circa 1 minuto prima del risciacquo con etanolo al 100%. Lasciare i vetrini asciugare all'aria per 30 min.
- Condurre microdissezione laser con piattaforma scelta (ad esempio il sistema Leica AS).
- Posizionare il vetrino con la sezione macchiata da microdissezione a faccia in giù sul palco microscopio.
- Montare una provetta da 0,5 ml microcentrifuga nel cassetto di raccolta ed aggiungere 50 ml ditampone di lisi cellulare (ad esempio DNA, RNA o proteina tampone di lisi) al cappuccio in cui il tessuto microdissezione raccoglierà.
- Sotto visione diretta, utilizzare il joystick per identificare tessuto di interesse, e utilizzando l'interfaccia software, annotare la sezione organica macchiato, mettendo in evidenza le cellule da microdissezione al fronte invasione tumorale.
- Istruire il laser al fuoco, che dovrebbero entrambe tagliare la sezione evidenziata e spingere il tessuto microdissezione nel tappo della provetta.
- Una quantità sufficiente di materiale è stato raccolto, estrarre la cassetta di raccolta, chiudere la provetta e centrifugare delicatamente per disegnare il tampone di lisi al fondo della provetta.
- Mettere i campioni in ghiaccio fino microdissezione è completa. Campioni di processo tramite un metodo adeguato per estrarre l'analita di interesse.
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Representative Results
Abbiamo applicato il metodo di cui sopra per più combinazioni di linee cellulari e cellule stromali CRC. Un esempio qui presentato è linee cellulari epiteliali SW480 CRC con ex vivo fibroblasti umani primari del colon. Co-colture 3-dimensionali sono costruiti (Figura 1), sottoposto alla microscopia e cattura microdissezione laser (Figura 2), e analizzati mediante microRNA (miRNA) profiling (Figura 3) per il confronto dei miRNA differenzialmente espressi tra cellule nella parte anteriore tumore invasivo e quelli nelle stratificati (non invadente) zone tumorali.
Figura 1. Schema e rappresentazioni fotografiche del modello organotipica. Cellule di CRC vengono seminate su uno strato stromale sintetico contenente fibroblasti e componenti essenziali della matrice extracellulare. Le cellule sono co-coltura ad una interfaccia aria-liquido creato dalla elevando il gel organotipica su una griglia in acciaio inox sterile. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
.. Figura 2 LMD di cellule SW480 CRC invadono lo stroma organotipica Cresyl Violet viene utilizzato per evidenziare CRC cellule epiteliali (A); isole tumorali invasive vengono poi definiti (B); prima dissezione laser verifica (C) e il pezzo tagliato viene trasportato in un dispositivo di raccolta (D). Cellule non-invasione e cellule stromali sono identificati e isolati utilizzando la stessa metodologia.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. MicroRNA dati di microarray. Array sono state scannerizzate con un Pro 3.0.5 scanner GenePix per rilevare Cy5 alla lunghezza d'onda di 635 nm. Intensità di fluorescenza media sono stati normalizzati e rapporti di espressione calcolati tra laser microdissezionate invasive margine cellule di CRC e cellule CRC margini non invasive negli strati epiteliali stratificati. I dati sono stati ordinati per fold change e valori di dati + / - 2 fold change da un esperimento rappresentativo sono presentati mostrando espressione genica miRNA differenziale tra le cellule margine invasive e cellule margini non invasive. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Qui si descrive un metodo per isolare e caratterizzare specificamente le cellule tumorali che hanno acquisito la capacità di invadere il cancro stroma associato durante le prime fasi della progressione metastatica in un 3-dimensionale di co-coltura costrutto delle cellule epiteliali e stromali.
Modelli di co-coltura costituiti da cellule epiteliali CRC giustapposti con una stroma sintetico contenente ex vivo fibroblasti umano del colon sono stati usati per studiare CRC invasione in 3-dimensioni. Questo sistema fisiologicamente rilevanti che simula le condizioni in vivo possono essere adattati per altri scenari cancro sostituendo cellule nell'epitelio e stroma costruzione ex vivo utilizzando fibroblasti di varie origini anatomiche. Un limite di questo approccio è la semplificazione del compartimento stromale utilizzando solo cellule di fibroblasti, come lo stroma del colon in vivo è un tessuto complesso e dinamico con vari celcostituenti l. Un esempio è le cellule immunitarie-derivati, che sono presenti in quantità significative in materiale tumore primario ma assente da questo modello. Nonostante questo, la riproducibilità affidabile di questo modello accoppiato con la facilità con cui i costituenti cellulari può essere manipolata sperimentalmente (ad esempio mediante sovraespressione o knockdown di singoli geni nei compartimenti epiteliali e stromali), fanno un modello valido e conveniente rispetto al convenzionale sperimentazione in vivo.
In questo manoscritto abbiamo anche dimostrato che le cellule di CRC al fronte invasivo del tumore in questo sistema modello esprimono diversi profili di espressione miRNA di cellule identiche, non al fronte invasivo e situate in strati epiteliali stratificati. Ciò rappresenta una prova di concetto che microdissezione laser tessuto dai modelli di co-coltura organotipica è un valido approccio per studiare i primi processi in metastasi. Il fuoco hare era esclusivamente su miRNA, dal momento che i miRNA sono fortemente implicati nella patogenesi di numerose neoplasie e deregolamentato espressione sia in epiteliali e cancro associato cellule stromali hanno conseguenze importanti in CRC 2,3,5. Inoltre miRNA sono stabili per l'estrazione e analisi incluso in paraffina tessuto fissato in formalina ed archiviazione tradizionale, che li rende potenti biomarcatori per la diagnosi e la prognosi su tessuti umani sottoposti a trattamento convenzionale nei laboratori di routine istopatologiche 9,10. Tuttavia, la nostra metodologia potrebbe facilmente essere adattato per l'analisi genomica e proteomica, enfatizzando ulteriormente la versatilità di questo approccio.
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Disclosures
Gli autori evidenziano alcun potenziale conflitto di interesse.
Acknowledgments
MB è sostenuto da sovvenzioni da una borsa di studio MRC. KP e AHM sono supportati da finanziamenti provenienti dal Wessex Medical Research e Cancer Research UK / RCS (Inghilterra) (C28503/A10013). Siamo grati per il sostegno dell'Università di Southampton Histochemistry Unità di Ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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