Summary
Moleculaire profilering van laser gemicrodissecteerde cellen en stroma van synthetische, weefselengineering darmkanker modellen vertegenwoordigt een nieuwe benadering en manipuleerbaar te karakteriseren en ontleden de kenmerkende biologie op het grensvlak tussen tumorcellen aan de voorzijde en invasieve kanker geassocieerd stromacellen.
Abstract
Binnenvallende colorectale kanker (CRC) cellen hebben het vermogen om los te breken uit hun zus cellen, infiltreren het stroma, en de vorm van de extracellulaire matrix (ECM) verworven. Karakteriseren van de biologie van deze fenotypisch verschillende groep cellen kan ons begrip van de vroege gebeurtenissen tijdens de metastatische cascade te verbeteren.
Tumor invasie is een dynamisch proces vergemakkelijkt door bidirectionele interactie tussen kwaadaardige epitheel en kanker-geassocieerde stroma. Om cel-specifieke antwoorden te onderzoeken op de tumor stroma-koppeling die we hebben organotypische co-cultuur en laser micro-dissectie technieken gecombineerd.
Organotypische modellen waarin belangrijke stromale bestanddelen zoals fibroblasten 3-dimentioanally samen gekweekt met kanker epitheelcellen, zeer manipuleerbaar experimentele instrumenten die invasie en kanker-stroma interacties kunnen worden onderzocht in het bijna physiological voorwaarden.
Laser microdissectie (LMD) is een techniek die de chirurgische dissectie en extractie van de verschillende lagen in tumorweefsel, met micron-niveau nauwkeurig meebrengt.
Door het combineren van deze technieken met genomic, transcriptomische en epigenetische profilering willen we een beter begrip van de moleculaire kenmerken van binnenvallende tumorcellen en stromale omliggende weefsel te ontwikkelen, en daarmee potentieel te onthullen nieuwe biomarkers en de mogelijkheden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen in CRC.
Introduction
Organotypische co-culturen zijn tissue-engineered modellen die helpen bij de wederopbouw van de in vivo tumormicromilieu in 3-dimensies door naast elkaar maligne epitheliale en stromale cellen in een collageen gel met essentiële extracellulaire matrix componenten 1-3. Voornamelijk opgevat als meetmethode tumorinvasie, organotypics minder afhankelijk van in vivo diermodellen, en voorkomen dat de tekortkomingen van andere in vitro technieken zoals Transwell assays, waarbij binnendringende cellen kunstmatig gedwongen tot een mono-gedispergeerde toestand 2-4. De opname van stromale cellen in deze modellen, zoals fibroblasten, weerspiegelt de essentiële rol van de tumor micro reguleren kwaadaardige invasie en metastase 3-4, maar de fenotypische heterogeniteit van het stroma zodanig dat om de fysiologische relevantie van organotypische maximaliseren modellen, orgaan-specifieke, anatomisch correcte ex vivofibroblasten moeten worden opgenomen waar mogelijk 3,6.
Organotypics zijn een veelzijdig platform om interactie tussen tumorcellen en stromale cellen te bestuderen en worden steeds meer gebruikt in nieuwe manieren om de impact op de tumor invasie van chemische remmers en gerichte gen 7,8 veranderingen te onderzoeken. Het bestuderen van de invasieve tumor marge is een bijzonder spannend vooruitzicht. In organotypische modellen vastgesteld colorectale kanker (CRC) cellijnen meestal een goed gestratificeerde epitheel laag en in dwarsdoorsnede, cellen die het vermogen om de extracellulaire matrix (ECM) binnendringen verworven zijn gemakkelijk te onderscheiden. In het licht van de micro-topografische heterogeniteit van tumoren en tumor geassocieerde stromale cellen in vivo, extraheren deze cellen via Laser microdissectie en het bestuderen ze afzonderlijk kunnen belangrijke biologische inzichten over het ontstaan van colorectale kanker metastase onthullen hoe efficiënter kan gericht. Ikn de volgende methode, alle patiënten die weefselmonsters gaven schriftelijk toestemming, en de studie geschonken werd goedgekeurd door de instellingen regionale-ethische toetsingscommissie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vaststelling van primaire fibroblastculturen van Colonic Explantaten
- Monsters van normale humane colon mucosa weefsel direct van de chirurgische operatiekamer en schorsen 7-10 ml PBS aangevuld met 100 eenheden / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, en 0,25 ug / ml Fungizone.
- In het laboratorium, plaatst het monster in het midden van een 10-cm weefselkweek schotel en was 3 keer met PBS / Pen-Strep / Fungizone. Niet aspireren na de laatste wasbeurt.
- Met steriele pincet en scalpel, snijd het weefsel in kleine stukjes (ongeveer 2 mm) en plaats elk stuk in het midden van een kruis getekend met de scalpel in een 12-wells plaat. Rock the scalpel voorzichtig over het weefsel om deze te hechten.
- Cultuur de monsters in 750 ui primaire fibroblast groeimedium (DMEM aangevuld met 20% foetaal kalfserum (FCS), 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine en 292 ug / ml L-glutamine), die moet submerge het weefsel, zonder waardoor het zweven. Vermijd het verstoren van de plaat over de komende 5 dagen behalve opnieuw voeden om de 2 dagen.
- Gedurende de volgende 5 dagen fibroblasten langzaam beginnen te groeien van de rand van het weefsel. Op ongeveer 7 dagen, zal dit meer zichtbaar. Na ongeveer 3-4 weken, en als er voldoende fibroblasten groeien, voeg 750 ul trypsine aan elk putje. Na cellen hebben losgemaakt, zwembad en overdracht (die 5-10 minuten kan duren) een T-25 weefselkweek kolf.
2. Organotypische Voorbereiding
Bereiding van de fibroblast geïmpregneerde organotypische gel:
- Bereid een fibroblast celsuspensie bevattende 5 x 10 5 cellen per organotypische in DMEM gesupplementeerd met 10% FCS en 292 pg / ml L-Glutamine.
- Vormen de organotypic gels op het ijs, in de volgende verhoudingen:
- 7 volumes Rat-Tail Collageen: Matrigel mix (01:01)
- 1 volume gefilterde 10x DMEM
- 1 volume FCS
- 1 deel fibroblast celsuspensie bevattende 5 x 10 5 fibroblasten
9 gels (1 ml per gel) bereiden 10 ml en meng zachtjes om luchtbellen te vermijden.
- Voeg 1 ml aan elk putje van een 24-wells plaat en incubeer 1 uur bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer om gels te stellen. Na 1 uur wordt 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut bovenop de gel en overnacht terug naar de incubator.
- De volgende dag, zuigen medium vanaf de bovenkant van de gels en plaat 1 ml medium dat 5 x 10 5 CRC epitheelcellen.
Voorbereiding van de gel coating nylon lakens:
- Bereid steriele, geautoclaveerd nylon lakens meet 1,5 cm x 1,5 cm, op voorhand.
- Met steriele tang, plaats het vereiste aantal nylon bladen in een 10 cm kweekschaal (meestal 4 nylon platen kunnen worden ondergebracht per schaal).
- Make up gel op het ijs in de volgende volgorde (250 ul totaalvolume gewenst per nylon vel):
- 7 volumes Rat-Tail Collageen
- 1 volume gefilterde 10x DMEM
- 1 volume FCS
- 1 volume DMEM 10% FCS / Glut
- Als de oplossing geel, neutraliseren door 0,1 M NaOH in 50 pi fracties tot de kleur omslaat roze.
- Voeg 250 ul van deze oplossing aan elke nylon plaat en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 30 minuten om gel te stellen.
- Make up 1% glutaaraldehyde-oplossing in PBS. Voeg 10 ml elk 10 cm kweekschaal nadat de gel is vastgesteld en incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Wash nylon vellen 3x in PBS en 1 x in DMEM (10% FCS) / Glu en incubeer overnacht in DMEM / Glu bij 4 ° C.
Raising organotypic gels op stalen roosters voor invasie:
- Pre-bereiden steigers netten door het vouwen van roestvrijstalen platen in een statief formatie. Autoclaaf voor gebruik.
- Een tang gesteriliseerd in ethanol een stalen rooster plaatst in elk putje van een zes puts plaat.
- Plaats een gel-gecoat nylon blad met de collageen kant naar boven, op elk rooster.
- Breng zorgvuldig de organotypic gels van de 24-wells plaat op de gestelde nylon plaat met behulp van een spatel gesteriliseerd in ethanol.
- Vul het goed met DMEM 10% FCS / Glut gesupplementeerd met 10% FCS tot nylon plaat in contact met het medium maar niet ondergedompeld. Zorg ervoor dat het medium niet de organotypic gel raken.
- Incubeer gedurende 14 dagen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, de vervanging van media om de 2 dagen.
3. Organotypische Fixation
- Verwijder gehele organotypic inclusief nylon laken van goed en leg op vershoudfolie.
- Halveer organotypic en nylon blad met een schone wegwerpbistouri en bevestig beide helften in formaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
- Vervang formaldehyde met 70% ethanol na 24 uur en laat het een nacht voorafgaand aan de inbedding in paraffine, snijden, en vlekken.
4. Laser Microdissection van de Invasieve Marge
- Sectie om 10 urn-dikte op membraan gemonteerde dia's.
- Deparaffinize secties door toepassing Xyleen gedurende 1 min, verwijder xyleen en oplossen in 75% ethanol gedurende nog 1 minuut.
- Verwijder de ethanol en vlek met 0,125% cresylviolet oplossing gedurende 1 minuut. Cresylviolet hoogtepunten epitheelcellen en maakt een gemakkelijke discriminatie van het stroma.
- Verwijder cresylviolet en toepassing van 100% ethanol nog 1 min voor spoelen met 100% ethanol. Laat dia's aan de lucht drogen gedurende 30 minuten.
- Voeren laser microdissection behulp gekozen platform (bv. de Leica AS systeem).
- Plaats het glaasje met de gekleurde coupe te gemicrodissecteerde gezicht naar beneden op de microscoop podium.
- Monteer een 0,5 ml microcentrifugebuis in de collectie cassette en voeg 50 ulcellysis buffer (bijvoorbeeld DNA, RNA of eiwit lysisbuffer) aan de kap waarin gemicrodisseceerde weefsel verzamelen.
- Onder direct zicht, gebruik de joystick om weefsel van belang te identificeren, en het gebruik van de software-interface, annoteren de gebrandschilderde organisch gedeelte, met de nadruk cellen worden gemicrodissecteerde op de tumor invasie front.
- Instrueer de laser te vuren, die zowel dient knip de gemarkeerde sectie en stuwen gemicrodissecteerde weefsel in de dop van de microcentrifugebuis.
- Nadat voldoende materiaal verzameld, verwijdert het verzamelen cassette, sluit de microcentrifugebuis en draai langzaam naar lysisbuffer vestigen op de bodem van de buis.
- Leg monsters op ijs tot microdissection is voltooid. Proces monsters op een gepaste manier aan de analyt van belang te halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben de bovenstaande methode toegepast om meerdere combinaties van CRC cellijnen en stromale cellen. Een voorbeeld hier gepresenteerd is SW480 epitheliale CRC cellijnen met primaire menselijke ex vivo colon fibroblasten. 3-dimensionale co-kweken worden geconstrueerd (Figuur 1), onderworpen aan microscopie en laser capture microdissectie (figuur 2), en microRNA (miRNA) profilering (figuur 3) geanalyseerd voor vergelijking van differentieel tot expressie miRNAs tussen cellen bij de invasieve tumor voorkant en die in de gelaagde (niet-binnendringende) tumor zones.
Figuur 1. Schematische en fotografische voorstellingen van de organotypische model. Worden CRC cellen gezaaid op een synthetische stromale laag met fibroblasten en essentiële extracellulaire matrixcomponenten. Cellen zijn co-gekweekt bij een lucht-water grensvlak gemaakt door het opvoeren van de organotypische gel op een steriele roestvrij stalen rooster. Klik hier voor grotere afbeelding.
.. Figuur 2 LMD van SW480 CRC cellen invasie van de organotypische stroma wordt cresylviolet gebruikt om CRC epitheelcellen (A) te markeren; invasieve tumor eilanden worden dan gedefinieerd (B); voordat laser dissectie optreedt (C) en de gesneden stuk wordt getransporteerd naar een verzameling apparaat (D). Niet-binnendringende cellen en stromale cellen worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van dezelfde methode.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. MicroRNA microarray. Arrays werden gescand met een GenePix Pro 3.0.5 scanner Cy5 detectie bij een golflengte van 635 nm. Gemiddelde fluorescentie-intensiteiten werden genormaliseerd en expressie verhouding berekend tussen laser gemicrodissecteerde invasieve marge CRC cellen en niet-invasieve marge CRC cellen in de gelaagde epitheliale lagen. De gegevens werden gesorteerd per voudige verandering en data waarden + / - 2 voudige verandering van een representatief experiment worden gepresenteerd tonen differentiële miRNA genexpressie tussen de invasieve marge cellen en niet-invasieve marge cellen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een methode om specifiek te isoleren en karakteriseren van tumorcellen die het vermogen om kanker geassocieerde stroma binnendringen in de vroegste stadia van metastatische progressie in een 3-dimensionale co-cultuur construct van epitheliale en stromale cellen verkregen.
Co-cultuur modellen uit CRC epitheelcellen afgewisseld met een synthetisch stroma die ex vivo humane colon fibroblasten werden gebruikt om CRC invasie studeren in 3 dimensies. Deze fysiologisch relevante systeem dat in vivo omstandigheden nabootst kan worden aangepast voor andere kanker scenario door substitutie cellen in het epitheel en stroma construeren met ex vivo fibroblasten verschillende anatomische oorsprong. Een beperking van deze benadering is de simplificatie van het stromale compartiment met alleen fibroblastcellen, als in vivo colon stroma is een complex en dynamisch weefsel met variërende cell bestanddelen. Een voorbeeld is het immuun-afgeleide cellen, die in aanzienlijke hoeveelheden aanwezig in primaire tumor materiaal, maar afwezig in dit model zijn. Desondanks betrouwbare reproduceerbaarheid van dit model in combinatie met het gemak waarmee de celbestanddelen kan experimenteel gemanipuleerd (bijv. door overexpressie of knockdown van individuele genen in epitheliale en stromale compartiment), maken dit een waardevolle en kosteneffectieve model vergeleken conventionele in vivo experimenten.
In dit manuscript hebben we al aangetoond dat CRC cellen in de tumor invasieve front in dit modelsysteem uiten verschillende miRNA expressie profielen op identieke cellen niet aan de invasieve voorzijde en gelegen in gelaagde epitheellagen. Dit is een proof of concept dat laser gemicrodissecteerde weefsel van organotypische co-cultuur modellen is een goed uitgangspunt om vroeg processen te bestuderen in metastase. De focus hijre was uitsluitend miRNA expressie, aangezien miRNAs sterk betrokken bij de pathogenese van talrijke maligniteiten en gedereguleerde expressie zowel in epitheliale en kanker geassocieerde stromacellen hebben belangrijke gevolgen CRC 2,3,5. Bovendien miRNAs zijn stabiel tot extractie en analyse van conventionele archivering formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel, waardoor ze krachtige biomarkers voor diagnose en prognose op menselijk weefsel onderworpen aan conventionele verwerking in routinematige histopathologische laboratoria 9,10. Toch konden onze methodologie heel gemakkelijk worden aangepast voor genomics en proteomics analyse, verder de nadruk op de veelzijdigheid van deze aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beschrijven de auteurs geen potentiële belangenconflicten.
Acknowledgments
MB wordt ondersteund door subsidies van een MRC gemeenschap. KP en AHM worden ondersteund door subsidies van Wessex Medical Research en Cancer Research UK / RCS (Engeland) (C28503/A10013). Wij zijn dankbaar voor de steun van de Universiteit van Southampton Histochemistry Research Unit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
