Summary
Molekylær profilering af laser mikrodissekeres celler og stroma fra syntetiske, væv-manipuleret kolorektal cancer modeller repræsenterer en ny og manipuleres tilgang til at karakterisere og dissekere den særprægede biologi på grænsefladen mellem tumorceller ved den invasive front og cancer associeret stromaceller.
Abstract
Invaderende kolorektal cancer (CRC) celler har erhvervet evnen til at bryde fri fra deres søster celler, infiltrere stroma, og remodel den ekstracellulære matrix (ECM). Karakteriserer biologi dette fænotypisk særskilt gruppe af celler væsentligt kunne forbedre vores forståelse af tidlige hændelser i løbet af metastatisk kaskade.
Tumor invasion er en dynamisk proces lettes ved tovejs interaktioner mellem ondartet epitel og cancer associeret stroma. For at undersøge celle-responser på tumorstroma-interface-vi kombineret organotypisk co-kultur og laser mikro-dissektion teknikker.
Organotypiske modeller, hvor vigtige stromale bestanddele, som f.eks fibroblaster 3-dimentioanally co-dyrket med kræft epitelceller, er meget manipuleres eksperimentelle værktøjer, der giver invasion og kræft-stroma interaktion, der skal undersøges i nær-physiological forhold.
Laser mikrodissektion (LMD) er en teknik, som indebærer kirurgisk dissektion og udvinding af de forskellige lag i tumorvæv, med micron niveau præcision.
Ved at kombinere disse teknikker med genomisk, transkriptom og epigenetisk profilering vi sigter mod at udvikle en dybere forståelse for de molekylære karakteristika af invaderende tumorceller og omgivende stromavæv, og dermed potentielt afsløre nye biomarkører og muligheder for udvikling af lægemidler i CRC.
Introduction
Organotypiske co-kulturer er væv-manipuleret modeller som støtte i at rekonstruere in vivo tumor mikromiljø i 3 dimensioner ved at sætte maligne epitelceller og stromacellerne i et kollagen gel indeholder væsentlige ekstracellulære matrixkomponenter 1-3. Hovedsagelig tænkt som en metode til måling af tumor invasion, organotypics mindske afhængigheden af in vivo dyremodeller, og undgå manglerne i andre in vitro-teknikker såsom Transwell assays, hvor invaderende celler er tvunget kunstigt ind i en mono-spredt tilstand 2-4. Inddragelsen af stromaceller i disse modeller, såsom fibroblaster, afspejler den vigtige rolle tumormikromiljøet i reguleringen malign invasion og metastase 3-4, men den fænotypiske heterogenitet af stroma er sådan, at for at maksimere den fysiologiske relevans af organotypisk modeller, orgel specifik, anatomisk korrekte ex vivofibroblaster bør medtages så vidt muligt 3,6.
Organotypics er en alsidig platform til at studere samspillet mellem tumor og stromaceller og anvendes i stigende grad på nye måder at undersøge indvirkningen på tumor invasion af kemiske inhibitorer og målrettede gen 7,8 ombygninger. Studere den invasive tumor margin er en særdeles spændende mulighed. I organotypiske modeller etableret colorectal cancer (CRC)-cellelinjer producerer typisk et godt stratificeret epitel lag og i tværsnit, celler, der har erhvervet evnen til at invadere den ekstracellulære matrix (ECM) kan let ses. I lyset af den etablerede mikro-topografisk heterogenitet tumor og tumorassocierede stromale celler in vivo, udvinde disse celler ved hjælp af Laser mikrodissektion og studere dem i isolation, kan afsløre vigtige biologiske indsigter vedrørende oprindelsen af kolorektal cancer metastaser, og hvordan det kan være mere effektivt målrettet. Jegn følgende metode, alle patienter, som doneret vævsprøver forudsat skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen blev godkendt af de institutioner, regionale videnskabsetiske komité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Etablering af Primary fibroblastkulturer fra Colon Eksplantater
- Få prøver af normal human colon slimhinde væv direkte fra kirurgisk operationsstue, og den suspenderes i 7-10 ml PBS suppleret med 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,25 ug / ml Fungizone.
- I laboratoriet anbringes prøven i centrum af en 10-cm vævskulturskål og vask 3 gange med PBS / Pen-strep / Fungizone. Aspirér ikke efter den sidste vask.
- Med steril pincet og skalpel skæres vævet i små stykker (ca. 2mm) og placere hvert stykke i midten af et kors tegnet med skalpelblad i en 12-brønds plade. Rock skalpellen forsigtigt over vævet for at tillade det til at klæbe.
- Kultur modellerne i 750 pi primære fibroblast-vækstmedium (DMEM suppleret med 20% føtalt kalveserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 292 ug / ml L-glutamin), som bør submeRGE vævet uden gør det muligt at flyde. Undgå at forstyrre pladen over de næste 5 dage, undtagen at re-foder hver 2 dage.
- I løbet af de næste 5 dage fibroblaster vil langsomt begynde at vokse ud fra kanten af vævet. På cirka 7 dage, vil dette være mere synlige. Efter ca 3-4 uger, og hvis der er tilstrækkelige fibroblaster vokser ud, tilsættes 750 ul trypsin til hver brønd. Efter cellerne er fritliggende (hvilket kan tage 5-10 min), pool og overførsel til et T-25 vævskulturkolbe.
2.. Organotypisk Fremstilling
Fremstilling af fibroblast imprægneret organotypisk gel:
- Forbered en fibroblastcellelinie suspension indeholdende 5 x 10 5 celler pr organotypisk i DMEM suppleret med 10% FCS og 292 pg / ml L-glutamin.
- Udgør de organotypiske geler på is, i følgende forhold:
- 7 mængder af Rat-Tail Collagen: Matrigel mix (1:1)
- 1 volumen filtreret 10x DMEM
- 1 volumen FCS
- 1 rumfang fibroblastcellelinie suspension indeholdende 5 x 10 5 fibroblaster
For 9 geler (1 ml pr gel) forberede 10 ml og bland forsigtigt for at undgå bobler.
- 1 ml til hver brønd i en 24-brønds plade og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i en befugtet atmosfære for at give geler at indstille. Efter 1 time tilsættes 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut oven på gelerne og vende tilbage til inkubatoren natten over.
- Den følgende dag aspireres mediet fra toppen af geler og plade 1 ml medier indeholdende 5 x 10 5 CRC epitelceller.
Udarbejdelse af gel belagt nylon ark:
- Fremstille sterile, autoklaveres nylon ark måler 1,5 cm x 1,5 cm, på forhånd.
- Ved hjælp af steril pincet, placerer den påkrævede antal nylon ark i en 10 cm dyrkningsskål (normalt kan rummes 4 nylon ark pr fad).
- Make up gel på is i følgende rækkefølge (250 ul totalvolumen er påkrævet per nylon ark):
- 7 volumener Rat-Tail Collagen
- 1 volumen filtreret 10x DMEM
- 1 volumen FCS
- 1 rumfang af DMEM 10% FCS / Glut
- Hvis opløsningen er gul, neutraliseres ved tilsætning af 0,1 M NaOH i 50 pi alikvoter, indtil opløsningen bliver lyserødt.
- Tilføj 250 pi af denne løsning til hver nylon plader og inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 i 30 minutter for at tillade gelen at indstille.
- Make up 1% glutaraldehyd i PBS. 10 ml til hver 10 cm dyrkningsskål når gelen er indstillet og inkuberes ved 4 ° C i 1 time.
- Vask nylon ark 3x i PBS og 1x i DMEM (10% FCS) / Glu og inkuberes natten over i DMEM / Glu ved 4 ° C.
Raising organotypiske geler på stål gitre til invasion:
- Pre-forberede stilladser net ved at folde plader i rustfrit stål i et stativ formation. Autoklave før brug.
- Pincet steriliseret i ethanol for at placere et stålgitter i hver brønd på en seks brønds plade.
- Placer en gel-belagt nylon ark med kollagen side opad, på hver grid.
- Overføre forsigtigt organotypiske geler fra 24-brønds plade til den hævede nylonlagnet anvendelse af en spatel steriliseret i ethanol.
- Fyld brønden med DMEM 10% FCS / Glut suppleret med 10% FCS indtil nylonlagnet er i kontakt med mediet, men nedsænkes ikke. Sørg for, at mediet ikke rører organotypiske gel.
- Der inkuberes i 14 dage ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 erstatte mediet hver 2 dage.
3.. Organotypisk Fiksering
- Fjern hele organotypiske herunder nylon ark fra godt og placere på plastfolie.
- Gennemskære organotypisk og nylon ark med en ren engangs skalpel og løse begge halvdele i formaldehyd i 24 timer ved stuetemperatur.
- Udskift formaldehyd med 70% ethanol efter 24 timer og overlade natten over forud for indlejring i paraffin, sektionering og farvning.
4.. Laser mikrodissektion af Invasiv Margin
- Sektion til 10 um tykkelse på membranen monterede dias.
- Afparaffiner sektioner ved at anvende Xylen i 1 min, derefter fjerne Xylen og fix i 75% ethanol i yderligere 1 min.
- Fjern ethanol og pletten med 0,125% cresylviolet opløsningen i 1 min. Cresylviolet fremhæver epitelceller og tillader nem diskrimination fra stroma.
- Fjern cresylviolet og anvende 100% ethanol i yderligere 1 min før skylning med 100% ethanol. Lad dias lufttørre i 30 min.
- Gennemføre laser mikrodissektion hjælp valgte platform (f.eks Leica AS system).
- Anbring objektglasset med den farvede del skal mikrodissekeres forsiden nedad på mikroskop scenen.
- Monter en 0,5 ml mikrocentrifugerør i indsamlingen kassette og der tilsættes 50 ulcellelysering buffer (fx DNA, RNA eller protein lysebuffer) til hætten i hvilken mikrodissekeres væv vil indsamle.
- Under direkte udsyn bruge joysticket til at identificere væv af interesse, og ved hjælp af software interface, anmærke den farvede organisk sektion, fremhæve celler, der skal mikrodissekeres på tumorinvasion front.
- Instruer laser til brand, som både bør skære den markerede sektion og fremdrive mikrodissekeres væv i hætten på mikrocentrifugerør.
- Når tilstrækkeligt materiale er blevet indsamlet, skubbe indsamling kassette, lukke mikrocentrifugerør og spin forsigtigt at trække lyseringspuffer til bunden af røret.
- Anbring prøverne på is indtil mikrodissektion er færdig. Proces prøver ved en passende metode til at udtrække analytten af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har anvendt den ovennævnte fremgangsmåde til flere kombinationer af CRC-cellelinier og stromaceller. Et eksempel præsenteres her, er SW480 epitelial CRC cellelinjer med primære humane ex vivo colon fibroblaster. 3-dimensionelle co-kulturer er konstrueret (figur 1), underkastet mikroskopi og laseropfangnings-mikrodissektion (figur 2), og analyseret ved microRNA (miRNA) profilering (figur 3) til sammenligning af differentielt udtrykte miRNA mellem celler på den invasive tumor foran og de i lagdelte (ikke-invaderende) tumor zoner.
Figur 1.. Skematisk og fotografiske gengivelser af organotypiske model. Er CRC celler seedede på en syntetisk stromal lag, der indeholder fibroblaster og væsentlige ekstracellulære matrixkomponenter. Celler er co-dyrket på en luft-væske grænsefladen skabt ved at hæve organotypiske gel på en steril rustfrit stål gitter. Klik her for at se større billede.
.. Figur 2. LMD af SW480 CRC celler invaderer organotypiske stroma cresylviolet bruges til at fremhæve CRC epitelceller (A); invasive tumor øer er så defineret (B); før laser dissektion forekommer (C), og det afskårne stykke er transporteret til en opsamlingsindretning (D). Ikke-invaderende celler og stromaceller identificeres og isoleres ved hjælp af den samme metode.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 3.. MicroRNA microarray data. Arrays blev scannet ved hjælp af en GenePix Pro 3.0.5 scanner til at opdage Cy5 ved en bølgelængde på 635 nm. Mean fluorescerende intensiteter var normaliseret og udtryk nøgletal beregnet mellem laser mikrodissekeres invasive margin CRC celler og non-invasive CRC celler margin i stratificerede epitel lag. Data blev ordnet efter fold forandring og dataværdier + / - 2 gange ændring fra et repræsentativt eksperiment præsenteres viser forskellen miRNA genekspression mellem de invasive margin celler og ikke-invasive margin celler. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåde til specifikt at isolere og karakterisere tumorceller, som har erhvervet evnen til at invadere cancer associeret stroma i de tidligste stadier af metastatisk progression i en 3-dimensionel co-kultur konstruktionen af epitel og stromaceller.
Vævsmodeller består af CRC epitelceller sammenstillet med en syntetisk stroma indeholdende ex vivo humane colon fibroblaster blev anvendt til at undersøge CRC invasion i tre dimensioner. Denne fysiologisk relevante system, som efterligner in vivo betingelser kan tilpasses til andre kræft scenarier ved at erstatte celler i epitel og konstruere stroma under anvendelse ex vivo fibroblaster af forskellige anatomiske oprindelse. En begrænsning ved denne fremgangsmåde er den forsimpling af det stromale rum udelukkende med fibroblastceller, som in vivo colon stroma er et komplekst og dynamisk væv med varierende cell vælgere. Et eksempel er immun-afledte celler, som er til stede i betydelige mængder i primær tumor materiale, men fraværende fra denne model. På trods af dette, pålidelig reproducerbarhed denne model kombineret med den lethed, hvormed de cellebestanddele kan eksperimentelt manipuleres (f.eks ved overekspression eller knockdown af individuelle gener i epitel og stroma rum), gør dette til et værdifuldt og omkostningseffektiv model sammenlignet konventionel in vivo eksperimenter.
I dette manuskript viste også vi, at CRC cellerne på tumor invasive front i dette modelsystem udtrykker forskellige miRNA udtryk profiler til identiske celler ikke på den invasive front og beliggende i stratificerede epitel lag. Dette repræsenterer et proof of concept, at laser mikrodissekeres væv fra organotypiske vævsmodeller er en gyldig metode til at studere tidlige processer i metastaser. Fokus hanre var udelukkende på miRNA udtryk, da miRNA er stærkt impliceret i patogenesen af talrige maligniteter og dereguleret udtryk både i epitel og cancer associeret stromaceller har vigtige konsekvenser i CRC 2,3,5. Desuden miRNA er stabile for udvinding og analyser fra konventionel arkivers formalin paraffinindlejret væv, hvilket gør dem magtfulde biomarkører for diagnosticering og prognosticering på humant væv udsat for konventionel behandling i rutinemæssige histopatologiske laboratorier 9,10. Dog kunne vores metodologi meget let tilpasses til genomisk og proteom analyse, yderligere at understrege den alsidighed af denne fremgangsmåde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
MB er støttet af tilskud fra en MRC fællesskab. KP og AHM understøttes af tilskud fra Wessex Medical Research og Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013). Vi er taknemmelige for den støtte fra University of Southampton Histochemistry Research Unit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
