Summary
合成からのレーザーマイクロダイセクション細胞や間質、組織工学大腸癌モデルの分子プロファイリングは、浸潤性前面に腫瘍細胞および癌関連の間質細胞との間の界面に特徴的な生物学を特徴付け、分析する新規かつ操作可能なアプローチを表しています。
Abstract
大腸がんに侵入（CRC）細胞は、姉妹細胞から自由になる間質に浸透し、細胞外マトリックス（ECM）を改造する能力を獲得している。細胞のこの表現型が異なるグループの生物学を特徴づけることは、実質的に転移カスケード時に初期事象の我々の理解を向上させることができます。
腫瘍浸潤、悪性上皮と癌関連間質間の双方向の相互作用によって促進さ動的なプロセスである。腫瘍間質界面での細胞特異的応答を調べるために、我々は器官共培養し、レーザーマイクロダイセクション技術を組み合わせている。
線維芽細胞などのキーの間質成分が、がん上皮細胞と共培養3 - dimentioanallyである、器官のモデルは、近pHの検討が浸潤や癌間質の相互作用を可能にする、高度に操作可能な実験的なツールですysiological条件。
レーザーマイクロダイセクション（LMD）は、ミクロンレベルの精度で腫瘍組織内の様々な階層の外科解剖と抽出を伴う手法である。
ゲノム、トランスクリプトームおよびエピジェネティックなプロファイリングでこれらの技術を組み合わせることで、我々は、腫瘍細胞に侵入し、間質組織、周囲の分子特性をよく理解できるようにする、そうすることで、潜在的に、CRCにおける薬剤開発のための新規バイオマーカーと機会を明らかにすることを目指しています。
Introduction
器官型共培養物は、必須の細胞外マトリックス成 分1〜3を含むコラーゲンゲルにおける悪性上皮細胞および間質細胞を並置することによって3次元での生体内腫瘍微小環境を再構築するのを助ける組織工学モデルである。主に腫瘍浸潤を測定する方法として考えられ、organotypics インビボ動物モデルへの依存を低減し、そのような浸潤細胞が単分散状態2-4に人為的に強制されたトランスウェルアッセイのような他のインビトロ技術の欠点を回避する。線維芽細胞などのこれらのモデルにおける間質細胞の封入は、悪性の浸潤および転移3-4の調節における腫瘍微小環境の重要な役割を反映し、しかし、間質の表現型の異質性は、例えば、ある器官の生理的関連性を最大にするためにモデル、臓器の特定、解剖学的に正確なex vivoで可能な限り3,6線維芽細胞が含まれるべきである。
Organotypicsは、腫瘍細胞および間質細胞の間の相互作用を研究するための汎用プラットフォームであり、ますます化学的阻害剤および標的化遺伝子改変7,8の腫瘍浸潤に及ぼす影響を調べるために新規な方法で使用されている。浸潤性腫瘍マージンを研究することは、特にエキサイティングな見通しである。器官型モデルでは、確立された結腸直腸癌（CRC）細胞株は、典型的には、井戸重層上皮層を生成し、断面において、細胞外マトリックス（ECM）を浸潤する能力を獲得した細胞が容易に識別可能である。 インビボでの腫瘍および腫瘍関連間質細胞の確立マイクロ地形異質、レーザーマイクロダイセクションを使用して、これらの細胞を抽出し、分離して、それらを研究に照らして、大腸癌転移の起源に関する重要な生物学的な洞察を明らかにすることができるとどのようにそれがより効率的になることがあり対象とした。私N以下の方法論、組織サンプルを寄付し、すべての患者が書面によるインフォームドコンセントを提供し、研究は教育機関、地域研究倫理委員会によって承認された。
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Protocol
結腸外植片からの初代線維芽細胞培養の1。設立
- 外科手術室から直接、正常なヒト結腸粘膜組織のサンプルを得るし、PBS 7-10中に一時停止し、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25μg/ mlのファンギゾンを補った。
- 研究室では、10cmの組織培養皿の中央に試料を置き、PBS /ペンストレプトマイシン/ファンギゾンで3回洗浄する。最後の洗浄の後に吸引しないでください。
- 滅菌ピンセットやメスで、（約2mm）組織を小片にカットし、12ウェルプレート中のメスの刃を使用して描画十字の中心にそれぞれの作品を配置します。それが接着することができるように組織の上そっとメスを揺する。
- 750μlの培養中の検体は、一次線維芽細胞増殖培地submeべき（DMEM、20％ウシ胎児血清（FCS）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および292μg/ mlのL-グルタミンを補充）フロートするためにそれを可能にすることなく、組織をRGE。 2日ごとに再給紙を除き、次の5日間にわたりプレートを邪魔しないようにします。
- 次の5日間に線維芽細胞が徐々に組織の端から外に成長を開始します。約7日後に、これはより見えるようになります。後約3〜4週間、内外の成長に十分な線維芽細胞が存在する場合、各ウェルに750μlのトリプシンを追加します。細胞を、T-25組織培養フラスコに、プール、転移（5〜10分かかることがあります）取り外された後。
2。器官の準備
線維芽細胞を含浸させ、器官ゲルの調製：
- 10％FCSおよび292μg/ mlのL-グルタミンを補充したDMEM中の器官当たり5×10 5個の細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製する。
- 以下の比率で、氷上器官ゲルを構成している。
- ラットテールコラーゲンの7ボリューム：マトリゲルミックス（1:1）
- フィルタリングさ10倍のDMEM 1ボリューム
- FCSの1の体積
- 5×10 5個の線維芽細胞を含む線維芽細胞懸濁液1容量
9ゲル（ゲルあたり1ミリリットル）のために10ミリリットルを用意し、気泡を避けるために、穏やかに混合。
- 24ウェルプレートの各ウェルに1 mlを添加し、37℃で1時間インキュベート ゲルが設定できるように加湿した雰囲気の中でCと°。 1時間後、ゲルの上に1ミリリットルのDMEM（10％FCS）/供給過剰を追加し、一晩培養器に戻る。
- 次の日、ゲルおよび5×10 5のCRC上皮細胞を含む培地のプレート1ミリリットルの上から吸引媒体。
ゲルコーティングされたナイロンシートの製造：
- 事前に1.5センチメートル×1.5センチメートルを測定無菌、オートクレーブナイロンシートを準備します。
- 滅菌ピンセットを用いて、10cmの培養皿（通常は4ナイロンシートを皿ごとに収容することができる）ナイロンシートの必要な数を配置する。
- 次の順序で氷上ゲルを構成する（250μlの総ボリュームナイロンシートごとに必要となる）。
- ラットテールコラーゲンの7容積
- フィルタリングさ10倍のDMEM 1ボリューム
- FCSの1の体積
- 1体積のDMEM、10％FCS /グラット
- 溶液が黄色の場合は、溶液がピンク色に変わるまで50μlのアリコートで0.1MのNaOHを加えることによって中和する。
- 各ナイロンシートに、この溶液の250μlを加え、37℃でインキュベート °Cゲルが設定できるように30分間、5％CO 2の加湿雰囲気中。
- PBS中の1％グルタルアルデヒド溶液を構成しています。ゲルがセットされた後、各10cmの培養皿に10ミリリットルを加え、1時間4℃でインキュベートする。
- ウォッシュナイロンシートはPBSおよびDMEM中で1X（10％FCS）/グルタミン酸で3倍、4℃で、DMEM / Gluの中で一晩インキュベート
侵入用スチールグリッド上に器官ゲルを上げる。
- 三脚の形成にステンレス鋼板を折り曲げて足場グリッドを事前に準備する。使用前にオートクレーブ。
- 6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置し、エタノールで滅菌ピンセットを使用してください。
- 各グリッド上に、コラーゲン側最上でゲルコーティングされたナイロンシートを置きます。
- 慎重にエタノールで滅菌スパチュラを用いて上げたナイロンシートを24ウェルプレートからの器官のゲルを移す。
- ナイロンシートが媒体に接触しているが、水没しないまで、10％FCSを補充したDMEM、10％FCS /ウェルで供給過剰を埋める。媒体は器官ゲルに接触していないことを確認してください。
- 2日毎に培地を交換し、5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で14日間インキュベートする。
3。器官固定
- 井戸からナイロンシートを含む全器官を取り出して、ラップフィルム上に置きます。
- 器官ときれいな使い捨てメスを用いてナイロンシートを二等分し、室温で24時間、ホルムアルデヒド中で両方の半分を修正。
- 70％のイーサンとホルムアルデヒドを交換してくださいオール24時間後と前に、パラフィンに包埋切片、および染色を一晩のままにしておきます。
侵略的マージンの4。レーザーマイクロダイセクション
- 膜上10μmの厚さにセクションでは、スライドをマウントした。
- 1分間のキシレンを適用することにより脱パラフィン切片、次いでキシレンを除去し、さらに1分間、75％エタノールで固定する。
- 1分間0.125％クレシルバイオレット溶液でエタノールと汚れを取り除きます。クレバイオレットは、上皮細胞が強調表示され、間質から簡単に区別することを可能にする。
- クレシルバイオレットを除去し、100％エタノールでリンスする前にさらに1分間100％エタノールを加える。 30分間空気乾燥スライドを可能にします。
- 選択したプラットフォーム（ 例えばライカASシステム）を用いたレーザーマイクロダイセクションを実施しています。
- 顕微鏡ステージ上に下向き顕微解剖するために染色部をガラススライドを置きます。
- 回収カセットに0.5ミリリットルマイクロチューブをマウントし、50μlを加える顕微解剖組織収集先となるキャップの細胞溶解緩衝液（ 例えば、DNA、RNAまたはタンパク質溶解緩衝液）。
- 直視下、関心のある組織を同定するためにジョイスティックを使用して、ソフトウェア·インタフェースを使用して、腫瘍の浸潤先端部での顕微解剖するセルを強調表示する、染色された有機部に注釈を付ける。
- 強調表示されたセクションを切り出し、マイクロチューブのキャップ内に顕微解剖した組織を推進する必要があり、どちらも、発射するレーザーを指示します。
- 一旦十分な材料が収集され、収集カセットを取り出すマイクロ遠心チューブを閉じ、チューブの底に溶解緩衝液を描画するために穏やかに回す。
- マイクロダイセクションが完了するまで氷上にサンプルを置きます。適切な方法による処理サンプルは、目的の分析物を抽出する。
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Representative Results
我々は、CRC細胞株及び間質細胞の複数の組み合わせに対して、上記の方法を適用した。ここで紹介する一つの例は、一次ヒトex vivoで結腸線維芽細胞と上皮SW480 CRC細胞株である。 3次元共培養物は、浸潤性腫瘍前線におけるセル間の差次的に発現されるmiRNAの比較のために顕微鏡およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ 図2）に供した（ 図1）は 、構成されており、マイクロRNA（miRNAの）プロファイリング（ 図3）によって分析される成層（非侵入）は、腫瘍のゾーンのもの。
図1。器官モデルの回路図と写真表現。CRC細胞を含む合成間質層上に播種する線維芽細胞および細胞外マトリックスの必須成分。細胞は、無菌のステンレス製のグリッド上に器官ゲルを上昇させることにより作成された気液界面での共培養。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2器官の間質に侵入SW480 CRC細胞のLMDクレバイオレットは、CRC上皮細胞（A）を強調するために使用されている。;浸潤性腫瘍の島々は、その後、（B）に定義されています。レーザー解剖の前に（C）を発生し、切断片を収集装置（D）に搬送される。非浸潤細胞および間質細胞を、同じ方法を用いて同定し、単離する。w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3マイクロRNAマイクロアレイデータ。配列は635の波長でのCy5を検出するためのGenePixプロ3.0.5スキャナーを用いてスキャンした。平均蛍光強度を標準化し、レーザ間で計算発現比は、重層上皮層に侵襲マージンCRC細胞および非侵襲マージンCRC細胞をマイクロダイセクション。侵襲性のマージン細胞および非侵襲的な利益率のセル間の差分miRNA遺伝子の発現を示すされています代表的な実験からの2倍の変更-データは倍変化し、データ値+ /によって並べ替えられた。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、特に上皮細胞および間質細胞の3次元共培養構築物における転移性進行の最も初期の段階で癌関連間質に侵入する能力を獲得した腫瘍細胞を分離し、特性化する方法について説明します。
ex vivoでのヒト結腸繊維芽細胞を含有する合成基質と並置CRC上皮細胞からなる共培養モデルは3次元でCRC浸潤を研究するために使用した。 インビボ条件の模倣上皮細胞に置き換え、種々の解剖学的起源のex vivoでの線維芽細胞を用いて間質を構築することによって、他の癌のシナリオに適合させることができるこの生理学的に関連するシステム。 in vivoで結腸間質は、様々なセル画で複雑 で動的な組織であるようにこのアプローチの1つの制限は、唯一の線維芽細胞を用いた間質コンパートメントの過度の単純化であるL成分。一例としては、原発腫瘍材料の大幅な量で存在しますが、このモデルには存在しない免疫由来細胞である。それにもかかわらず、（上皮内の個々の遺伝子および間質コンパートメントの発現またはノックダウン以上により）細胞成分を実験的に操作することができる容易さと相まって、このモデルの信頼性の高い再現性は、この貴重でコスト効果の高いモデルを比較します生体内の実験において従来に。
本稿では、我々はまた、このモデル系において腫瘍浸潤性前面のCRC細胞が浸潤性前面に同一のセルに異なるmiRNA発現プロファイルをしない表現し、重層上皮層に位置していることを明らかにした。これは器官共培養モデルからのレーザー顕微解剖組織は、転移の早い段階でプロセスを研究するための有効なアプローチであること概念実証を表しています。焦点彼REはmiRNAが強く、多数の悪性疾患の病因に関与しているため、miRNA発現のみにした上皮内および癌関連間質細胞がCRC 2,3,5で重要な結果をもたらすの両方式を規制緩和。またmiRNAは、それらのルーチン病理組織学的研究室9,10従来の処理を施したヒト組織上の診断や予後判定のための強力なバイオマーカー作り、従来のアーカイブホルマリン固定パラフィン包埋組織からの抽出と分析に安定している。しかし、我々の方法論は、非常に簡単に、さらにこのアプローチの汎用性を重視し、ゲノムおよびプロテオーム解析のために適合させることができる。
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Disclosures
著者らは、利害の相反を開示していない。
Acknowledgments
MBは、MRCの交わりから助成金によってサポートされています。 KPとAHMはウェセックス医学研究および癌研究イギリス/ RCS（イングランド）（C28503/A10013）からの助成金によってサポートされています。我々はサウサンプトン組織化学研究ユニットの大学の支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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