Summary
합성, 조직 공학 대장 암 모델에서 레이저 microdissected 세포 및 기질의 분자 프로파일은 침습적 전방 및 암 관련 기질 세포에서 종양 세포 간의 계면에서 독특한 생물학을 특성화하고 해부 소설과 같은 처리 방식을 나타낸다.
Abstract
대장 암에 침입 (CRC) 세포는 자신의 여동생 세포에서 무료로 휴식 기질에 침투하고, 세포 외 기질 (ECM)를 개조 할 수있는 능력을 획득했다. 세포의 표현형이 서로 다른 그룹의 생물학을 특성화하는 것은 실질적으로 전이 놓기 동안 초기 사건에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
종양의 침략 악성 상피 암 관련 기질 사이의 양방향 상호 작용에 의해 촉진 역동적 인 과정이다. 우리는 공동의 문화와 레이저 마이크로 해부 기술의 Organotypic을 결합했다 종양의 기질 인터페이스에서 세포 고유의 반응을 조사하기 위해.
이러한 섬유 아세포와 같은 주요 기질 성분 3 dimentioanally 암 상피 세포와 공동 배양 된의 Organotypic 모델, 가까운 산도에서 공부하는 침략과 암 - 기질 상호 작용을 가능하게 높은 처리 가능한 실험 도구입니다ysiological 조건.
레이저 미세 절제 (LMD)는 미크론 수준의 정밀도를 가진 종양 조직 내에서 다양한 계층의 외과 절개 및 추출을 수반하는 기술입니다.
게놈 transcriptomic과 성적인 프로파일과 이러한 기술을 결합함으로써 우리는 종양 세포를 침입 및 간질 조직을 주변의 분자 특성에 대한 깊은 이해를 개발하고, 그렇게함으로써 잠재적으로 새로운 바이오 마커 및 CRC에있는 약물 개발을위한 기회를 공개하는 것을 목표로하고 있습니다.
Introduction
의 Organotypic 공동 배양하는 중요한 세포 외 기질 구성 요소 1-3를 포함하는 콜라겐 겔에 악성 상피 세포와 기질 세포를 병치하여 3 차원 생체 내 종양 미세 환경을 재구성에 도움 조직 공학적 모델입니다. 주로 종양의 침략을 측정하는 방법으로 잉태, organotypics 생체 내 동물 모델에 대한 의존도를 줄이고, 이러한 침입 세포가 단 분산 상태 2-4로 인위적으로 강제되는없이 Transwell 분석과 같은 다른 생체 기술의 단점을 피할 수 있습니다. 이러한 섬유 아세포와 같은 이러한 모델에서 기질 세포의 포함은, 악성 침윤과 전이 3-4 조절에 종양 미세 환경의 필수적인 역할을 반영하지만 기질의 표현형 이질성은하다의 Organotypic의 생리 학적 관련성을 최대화하기 위해 모델, 장기 별, 해부학 적으로 정확한 생체가능하면 3,6 섬유 아 세포가 포함되어야한다.
Organotypics 종양 및 간질 세포 사이의 상호 작용을 연구 할 수있는 다양한 플랫폼이며, 점점 화학 억제제의 종양 침윤에 미치는 영향 및 표적 유전자 변경 7,8를 검사하는 새로운 방법으로 사용된다. 침략 종양 마진을 공부하는 것은 특히 흥미로운 전망이다. 의 Organotypic 모델 확립 결장암 (CRC) 세포주는 일반적으로 잘 성층 상피 층을 생산하고, 단면에서, 세포 외 기질 (ECM)를 침입 할 수있는 능력을 획득 한 세포가 쉽게 식별 할 수있다. 레이저 미세 절제를 사용하여 분리를 공부하고이 세포를 추출 종양 및 생체 내에서 종양 관련 기질 세포의 설립 마이크로 지형 이성의 빛으로, 대장 암 전이의 기원에 관한 중요한 생물 학적 통찰력을 보여줄 수 있습니다, 어떻게보다 효율적으로 될 수있다 대상. 나는N 다음과 같은 방법론은 조직의 동의서를 작성 샘플을 제공하고, 연구를 기증 한 모든 환자는 지역 연구 윤리위원회 기관에 의해 승인되었습니다.
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Protocol
대장의 Explants에서 주요 섬유 아세포 문화 1. 설립
- 직접 수술 수술실에서 정상적인 인간의 대장 점막 조직의 샘플을 확보, 7 ~ 10에서 중단 PBS의 ML 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 및 / ㎖ Fungizone 0.25 μg로 보충.
- 실험실에서, 10-cm 조직 배양 접시의 중앙에 시료를 배치하고 PBS / 펜 연쇄상 / Fungizone로 3 회 세척 하였다. 최종 세척 후 흡인하지 마십시오.
- 멸균 집게와 메스로 (약 2 mm) 작은 조각으로 조직을 잘라 12 - 웰 플레이트에 메스 블레이드와 그린 크로스의 중심에 각 조각을 배치합니다. 이 준수 할 수 있도록 조직에 부드럽게 메스 록.
- 농경 750 μL의 시료는 일차 섬유 아세포 성장 배지 subme한다 (DMEM은 20 % 송아지 태아 혈청 (FCS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신 및 292 ㎍ / ml의 L-글루타민)플로트를 사용하지 않고 조직을 RGE. 2 일마다 재 공급을 제외하고 향후 5 일 동안 플레이트를 방해하지 마십시오.
- 향후 5 일 동안 섬유 아 세포는 천천히 조직의 가장자리에서 밖으로 성장하기 시작합니다. 대략 7 일째에, 이것은 더 볼 수 있습니다. 밖으로 성장 충분한 섬유 아 세포가 있는지 후 약 3 ~ 4 주와, 각 웰에 750 ㎕의 트립신을 추가합니다. 세포는 T-25 조직 배양 플라스크에, 수영장 및 전송 (5 ~ 10 분의 시간이 걸릴 수 있음) 분리 한 후.
2.의 Organotypic 준비
섬유 아세포 임신의 Organotypic 겔의 제조 :
- 10 % FCS 및 292 ㎍ / ml의 L-글루타민이 보충 된 DMEM에서의 Organotypic 당 5 × 105 세포를 포함하는 섬유 아세포의 세포 현탁액을 준비한다.
- 다음과 같은 비율로, 얼음의 Organotypic 젤 메이크업 :
- 쥐 꼬리 콜라겐의 7 권 : 리겔의 혼합 (1:1)
- 필터링 10 배 DMEM의 1 볼륨
- FCS의 1 볼륨
- 5 × 5 섬유 아세포를 함유하는 섬유 아세포의 세포 현탁액 1 부피
9 젤 (젤 당 1 ㎖)의 경우 10 ㎖를 준비하고 거품을 피하기 위해 조심스럽게 섞는다.
- 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL를 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 젤이 설정할 수 있도록 가습 분위기에서 C를 °. 1 시간 후 젤 위에 1 ML DMEM (10 % FCS) / 과잉 추가 하룻밤 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 다음 날, 젤 및 5 × 5 CRC 상피 세포를 포함하는 미디어의 판 1 ㎖의 상단에서 대기음 매체.
겔 코팅 된 나일론 시트의 제조 :
- 1.5 cm 크기의 멸균 나일론 시트는 사전에, 1.5 cm를 멸균 x 다음 준비합니다.
- 무균 핀셋을 사용하여, 10cm 배양 접시 (통상 4 나일론 시트 인 접시 당 수용 할 수있다)에 나일론 시트의 필요 개수를 배치.
- 다음과 같은 순서로 얼음 젤 메이크업 (250 μL의 총볼륨은) 나일론 장에 필요합니다 :
- 쥐 꼬리 콜라겐의 7 권
- 필터링 10 배 DMEM의 1 볼륨
- FCS의 1 볼륨
- 1 DMEM의 볼륨 10 % FCS / 공급 과잉
- 액이 황색 인 경우,이 솔루션은 분홍색으로 변할 때까지 50 μL 씩 분주 0.1 M NAOH를 추가하여 중화.
- 각 나일론 시트에이 솔루션을 250 μl를 추가하고 37 품어 ° C 젤이 설정할 수 있도록 30 분 동안 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서.
- PBS에 1 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) 솔루션을 구성한다. 젤이 설정되면 각 10cm 배양 접시에 10 mL를 넣고 1 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다.
- 세척 나일론 시트는 PBS와 DMEM에 1X (10 % FCS) / 글루의 3 배, 4 ℃에서 DMEM / 글루에서 하룻밤 배양
침공 강철 격자에의 Organotypic 젤을 올리기 :
- 삼각대 형성에 스테인리스 강판을 접어 발판 그리드를 미리 준비합니다. 사용 전에 압력솥.
- 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 철강 격자를 배치 에탄올 소독 집게를 사용합니다.
- 각 그리드에, 최상위 콜라겐면 젤 코팅 된 나일론 시트를 놓습니다.
- 조심스럽게 에탄올 소독 주걱을 사용하여 제기 나일론 시트를 24 웰 플레이트에서의 Organotypic 젤을 전송합니다.
- 나일론 시트 매체와 접촉하지만 침수되지 때까지 10 % FCS와 보충 DMEM 10 % FCS / 공급 과잉으로 잘 입력합니다. 매체의 Organotypic 젤을 만지지 않도록하십시오.
- 2 일마다 미디어를 교체, 5 % CO 2의 습한 분위기에서 37 ° C에서 14 일 동안 배양한다.
3.의 Organotypic 고정
- 우물에서 나일론 시트를 포함한 전체의 Organotypic를 제거하고 집착 필름에 배치합니다.
- 의 Organotypic 깨끗한 일회용 메스를 사용하여 나일론 시트를 양분하고 실온에서 24 시간 동안 포름 알데히드의 두 반쪽을 고정합니다.
- 70 %의 에탄과 포름 알데히드를 교체올 24 시간 후 전에, 파라핀에 삽입 구획 및 염색에 하룻밤 둡니다.
침략적인 여백의 4. 레이저 미세 절제
- 막 상에 10 ㎛ 두께로 섹션 슬라이드를 장착.
- 1 분 동안 크실렌을 적용하여 Deparaffinize 섹션은 다음 추가로 1 분 동안 크실렌을 제거하고 75 %의 에탄올에 고정합니다.
- 1 분 0.125 % 크레 실 바이올렛 용액을 에탄올과 얼룩을 제거합니다. 크레 실 바이올렛 상피 세포를 강조하고 기질에서 쉽게 차별을 허용합니다.
- 크레 실 바이올렛을 제거하고 100 % 에탄올로 세척하기 전에 추가로 1 분 동안 100 % 에탄올을 적용합니다. 30 분 동안 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다.
- 선택 플랫폼 (예를 들어, 라이카 AS 시스템)를 사용하여 레이저 미세 절제를 실시한다.
- 현미경 무대에 얼굴을 아래로 microdissected 할 스테인드 섹션 유리 슬라이드를 놓습니다.
- 컬렉션 카세트에 0.5 ㎖ microcentrifuge 관을 장착하고 50 μL의 추가microdissected 조직을 수집 할에 대한 상한에 세포 용해 버퍼 (예 : DNA, RNA 또는 단백질의 용해 버퍼).
- 직시 하에서, 그 조직을 식별하기 위해 조이스틱을 사용하고, 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 종양 침윤 전면 microdissected 할 셀을 강조 더러워 유기 부분을 주석.
- 강조 표시된 부분을 잘라해야 모두 발사 레이저를 지시하고 microcentrifuge 관의 뚜껑에 microdissected 조직을 추진.
- 일단 충분한 자료를 수집 한, 컬렉션 카세트를 꺼내 microcentrifuge 관을 닫고 튜브의 바닥에 용해 버퍼를 그리는 부드럽게 회전.
- 미세 절제가 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다. 적절한 방법으로 처리 샘플은 관심의 분석을 추출 할 수 있습니다.
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Representative Results
우리는 CRC 세포주 및 간질 세포의 여러 조합에 상기 방법을 적용했다. 여기에 제시 한 예는 인간의 기본 생체 대장 섬유 아세포와 상피 CRC SW480 세포주이다. 3 차원의 공동 문화는 침략 종양 전면 세포 사이의 차등 발현의 miRNAs의 비교 현미경과 레이저 캡처 미세 절제 (그림 2)을 실시한다 (그림 1), 건설 및 마이크로 RNA (miRNA의) 프로파일 (그림 3)에 의해 분석 성층 (비 침입) 종양 영역에서 그.
그림 1. 도식과의 Organotypic 모델의 사진 표현은. CRC 세포를 포함하는 합성 기질 층에 씨앗을 품고있다 섬유 아 세포와 중요한 세포 외 기질의 구성 요소. 세포는 멸균 스테인레스 스틸 그리드에의 Organotypic 젤을 올려서 만든 공기 - 액체 계면에 공동 배양. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
..의 Organotypic 기질을 침해 SW480 CRC 세포의 그림 2 LMD 크레 실 바이올렛은 CRC 상피 세포 (A)를 강조하는 데 사용됩니다; 침략 종양 제도는 다음 (B) 정의된다; 레이저 절개는 (C)가 발생하고, 절단 된 부분은 수집 장치 (D)로 이송되기 전에. 비 침략 세포 및 간질 세포가 식별과 동일한 방법을 이용하여 분리된다.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 마이크로 RNA 마이크로 어레이 데이터. 어레이는 635 ㎚의 파장에서 Cy5에 검출하는 제품, GenePix Pro는 3.0.5 스캐너를 사용하여 스캔 하였다. 평균 형광 강도가 정상화되었습니다와 레이저 사이의 계산 된 표현 비율은 층상 상피 층의 침략 마진 CRC 세포와 비 침습 마진 CRC 세포를 microdissected. 침략 마진 세포와 비 침습 마진 세포 사이의 차이의 miRNA 유전자 발현을 보여주는 제시 대표적인 실험에서 2 배의 변화 - 데이터는 배 변화와 데이터 값 + /으로 분류되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 우리가 특별히 분리하고 상피와 기질 세포의 3 차원 공동 문화 구조의 전이성 진행의 초기 단계에서 암 관련 기질을 공격 할 수있는 능력을 획득 한 종양 세포의 특성을하는 방법을 설명합니다.
생체 인간의 대장 섬유 아 세포를 포함하는 합성 기질과 나란히 CRC 상피 세포로 구성된 공동 문화 모델은 3 차원에서 CRC의 침략을 연구하는 데 사용되었습니다. 생체 내 조건에서의 모방은 상피 세포를 대체하고 다양한 해부학 적 기원의 생체 섬유 아 세포를 사용하여 기질을 구성하여 다른 암의 시나리오에 적용 할 수있는이 생리 학적으로 관련 시스템. 생체 내에서 대장의 기질이 변화 CEL와 복잡하고 역동적 인 조직이기 때문에이 방법의 한 가지 제한은 단지 섬유 아세포의 세포를 사용하여 기질 구획의 지나친 단순화이다L 성분. 한 가지 예는 기본 종양 물질에 상당한 수량에 존재하지만이 모델에서 결석 면역 유래 세포입니다. 그럼에도 불구하고, 쉽게 결합이 모델의 신뢰성 재현성있는 세포 성분이 실험적으로 (상피와 간질 구획의 개별 유전자의 발현 또는 최저에 의해 예를 들어)를 조작 할 수 있습니다,이 가치 있고 비용 효율적인 모델을 비교합니다 생체 내 실험에서 기존에.
이 논문에서 우리는 또한이 모델 시스템에서 종양의 침략 앞에 CRC 세포가 침략 앞에 동일한 세포에 다른 miRNA의 발현 프로파일을하지 표현하고 층상 상피 층에 자리 잡고 있음을 보여 주었다. 이것은의 Organotypic 공동 문화 모델에서 레이저 microdissected 조직이 전이의 초기 과정을 연구하기위한 유효한 방법임을 개념의 증거를 나타냅니다. 초점 그다시의 miRNA가 강하게 다수의 악성 종양의 병인에 연루되어 있기 때문에, miRNA의 발현에 독점적이며 상피에서 암 관련 기질 세포가 CRC 2,3,5 중요한 결과를 모두 표현을 규제 완화. 또한의 miRNAs 그들 일상적인 조직 병리학 실험실 9,10 종래의 가공을 실시하고 인체 조직에 대한 진단 및 예지에 대한 강력한 생체하고, 기존의 기록 포르말린 고정 파라핀 조직에서 추출 및 분석에 안정. 그러나, 우리의 방법론은 아주 쉽게 추가이 방법의 다양성을 강조, 게놈과 프로테옴 분석에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그 잠재적 인 충돌을 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
MB는 MRC의 교제에서 보조금에 의해 지원됩니다. KP와 AHM은 웨 섹스 의학 연구 및 암 연구 UK / RCS (영국) (C28503/A10013)에서 보조금에 의해 지원된다. 우리는 사우 샘프 턴 조직 화학 연구 단위의 대학의 지원에 대한 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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