Summary
Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.
Abstract
Invadir o câncer colorretal células (CRC) adquiriram a capacidade de se libertar de suas células-irmãs, infiltrar o estroma, e remodelar a matriz extracelular (ECM). Caracterizando a biologia desse grupo fenotipicamente distintos de células pode melhorar substancialmente a nossa compreensão dos eventos iniciais durante a cascata metastática.
A invasão tumoral é um processo dinâmico, facilitado pela interacção bidireccional entre epitélio maligno e o estroma cancro associado. A fim de analisar as respostas específicas de células no interface estroma do tumor que se combinaram organotípicas de co-cultura e as técnicas de micro-dissecção de laser.
Modelos organotípicas, em que constituintes do estroma-chave, tais como fibroblastos são 3-dimentioanally co-cultivados com células epiteliais cancerosas, são ferramentas experimentais altamente manipuláveis que permitem invasão e interações câncer-estroma a serem estudados em quase phcondições ysiological.
Laser microdissection (LMD) é uma técnica que implica a dissecção cirúrgica e extração de vários estratos dentro do tecido do tumor, com nível de precisão mícron.
Ao combinar estas técnicas com perfil genômico, transcriptomic e epigenética pretendemos desenvolver uma compreensão mais profunda das características moleculares de invadir as células do tumor e tecido circundante do estroma, e ao fazê-lo, potencialmente revelar novos biomarcadores e oportunidades para o desenvolvimento de drogas no CRC.
Introduction
Organotípicas co-culturas são modelos que ajudam na reconstrução do microambiente do tumor in vivo em 3-dimensões justapondo células epiteliais malignas e as células do estroma em um gel de colágeno contendo essenciais componentes da matriz extracelular 1-3 engenharia de tecidos. Principalmente concebido como um método de medir a invasão do tumor, organotypics reduzir a dependência em modelos animais in vivo, e evitar os problemas de outras técnicas in vitro tais como ensaios de Transwell, em que as células invasoras são forçados artificialmente em um estado de dispersão mono-2-4. A inclusão de células estromais nestes modelos, tais como fibroblastos, reflecte o papel fundamental do microambiente do tumor na regulação da invasão maligna e metástase 3-4, no entanto, a heterogeneidade fenotipica do estroma é de tal modo que, a fim de maximizar a relevância fisiológica de organotípicas modelos, específica do órgão, anatomicamente precisos ex vivofibroblastos devem ser incluídos na medida do possível 3,6.
Organotypics são uma plataforma versátil para estudar as interações entre células tumorais e estromais e são cada vez mais utilizados em novas maneiras de examinar o impacto sobre a invasão do tumor de inibidores químicos e alterações no gene alvo 7,8. Estudar a margem de tumor invasivo é uma perspectiva particularmente emocionante. Em modelos organotípicas, cancro colorectal estabelecido (CRC) linhas celulares produzem tipicamente uma camada epitelial bem estratificada, e em secção transversal, as células que adquiriram a capacidade de invasão da matriz extracelular (ECM) são facilmente discerníveis. À luz da heterogeneidade de micro-topográfico estabelecido de tumor e do tumor associado células estromais in vivo, extraindo estas células utilizando microdissecção laser e estudá-los de forma isolada, pode revelar percepções biológicas importantes sobre a origem da metástase do cancro colo-rectal e de como ela pode ser mais eficiente segmentado. Eun a seguinte metodologia, todos os pacientes que doaram amostras de tecido prestados consentimento informado, eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética das instituições regionais de pesquisa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Estabelecimento de culturas primárias de fibroblastos de cólon explantes
- Obtenção de amostras de tecido de mucosa de cólon normal humano directamente a partir da sala de operações cirúrgicas, e suspender em 7-10 ml de PBS suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ng / mL de Fungizone.
- No laboratório, colocar a amostra no centro de um 10 cm de prato de cultura de tecidos e lava-se 3 vezes com PBS / Pen-strep / Fungizone. Não aspirar após a lavagem final.
- Com fórceps estéreis e bisturi, cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 mm) e colocar cada peça no centro de uma cruz desenhada com a lâmina de bisturi em uma placa de 12 poços. Balance o bisturi suavemente sobre o tecido para permitir que ele aderir.
- Cultura das amostras em 750 ul de meio de crescimento de fibroblastos básico (DMEM suplementado com 20% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 292 ng / ml de L-glutamina), que deve submerge o tecido sem permitir que flutue. Evite perturbar a placa ao longo dos próximos 5 dias, exceto para re-alimentação a cada 2 dias.
- Ao longo dos 5 dias seguintes fibroblastos começam a crescer lentamente para fora a partir da borda do tecido. Em cerca de sete dias, este será mais visível. Após cerca de 3-4 semanas, e se existem suficientes fibroblastos crescem para fora, adicionar 750 ul de tripsina a cada poço. Depois de células têm destacado (o que pode demorar 5-10 min), piscina e transferir para um frasco de cultura de tecidos T-25.
2. Organotípicas Preparação
Preparação do fibroblasto impregnado em gel organotípica:
- Prepara-se uma suspensão de células de fibroblasto, contendo 5 x 10 5 células por organotípicas em DMEM suplementado com FCS a 10% e 292 ug / ml de L-Glutamina.
- Completar os géis organotípicas no gelo, nas seguintes proporções:
- 7 volumes de Rat-Tail Colágeno: Matrigel mistura (1:1)
- 1 volume de filtrado 10x DMEM
- 1 volume de FCS
- Um volume de suspensão de células de fibroblasto, contendo 5 x 10 5 fibroblastos
Para 9 géis (1 ml por gel) preparar 10 ml e misture com cuidado para evitar bolhas.
- Adicionar 1 ml a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar durante 1 hora a 37 ° C em uma atmosfera húmida para permitir que os geles para definir. Depois de 1 hora adicionar 1 mL de DMEM (FCS a 10%) / Glut no topo dos géis e retornar para a incubadora durante a noite.
- No dia seguinte, o meio aspirado a partir do topo do gel e da placa 1 ml de meio contendo 5 x 10 5 células epiteliais CRC.
Preparação de folhas de nylon revestido de gel:
- Prepare-se estéril, folhas de nylon autoclavados medindo 1,5 cm x 1,5 cm, com antecedência.
- Utilizando fórceps estéreis, colocar o número requerido de folhas de nylon em uma placa de cultura de 10 centímetros (geralmente quatro folhas de nylon podem ser acomodados por prato).
- Make up gel no gelo na seguinte ordem (250 mL total devolume é necessário por folha de nylon):
- 7 volumes de Rat-Tail Colágeno
- 1 volume de filtrado 10x DMEM
- 1 volume de FCS
- 1 volume de DMEM 10% de FCS / Glut
- Se a solução é amarela, neutralizar por adição de 0,1 M de NaOH em 50 mL alíquotas até a solução torna-se rosa.
- Adicionar 250 ul desta solução para cada uma das folhas de nylon e incubar a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 durante 30 min para permitir que o gel para definir.
- Perfazer solução de glutaraldeído a 1% em PBS. Adicionam-se 10 ml a cada 10 centímetros placa de cultura, uma vez que o gel se definir e incubar a 4 ° C durante 1 hora.
- Folhas de nylon de lavagem 3x em PBS 1x e em DMEM (FCS a 10%) / Glu e incubar durante a noite em DMEM / Glu a 4 ° C.
Levantando géis organotípicas para grades de aço para invasão:
- Pré-preparar grades andaimes dobrando chapas de aço inoxidável em uma formação tripé. Autoclave antes do uso.
- Use uma pinça esterilizada em etanol para colocar uma grade de aço em cada poço de uma placa de seis bem.
- Colocar uma folha de nylon revestido com gel de colagénio com o lado superior, em cada grelha.
- Transferir cuidadosamente os géis organotípicas da placa de 24 cavidades para a folha de nylon levantadas usando uma espátula esterilizada em etanol.
- Encher o poço de DMEM com 10% de FCS / Glut suplementado com FCS a 10% até que a folha de nylon está em contacto com o suporte, mas não submersa. Certifique-se que o meio não toca o gel organotípica.
- Incubar durante 14 dias a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, substituindo mídia a cada 2 dias.
3. Organotípicas Fixation
- Remover todo organotípica incluindo folha de nylon bem e coloque em película aderente.
- Bisseccione organotípica e folha de nylon com um bisturi descartável limpo e corrigir as duas metades em formol por 24 horas à temperatura ambiente.
- Substitua formaldeído com 70% ethanol depois de 24 horas e deixe durante a noite antes da inclusão em parafina, corte e coloração.
4. Laser Microdissecção da margem invasiva
- Secção de 10 um de espessura para uma membrana de lâminas montado.
- Retire a parafina seções aplicando xileno por 1 min, em seguida, retire xileno e corrigir em etanol 75% por mais 1 min.
- Remover etanol e mancha com 0,125% solução Cresyl Violeta por 1 min. Cresyl Violeta destaca células epiteliais e permite fácil discriminação do estroma.
- Retirar violeta de cresilo e aplicar etanol a 100% durante mais 1 min antes da lavagem com etanol a 100%. Deixar as lâminas de ar seco por 30 min.
- Conduzir microdissecção a laser usando plataforma escolhida (por exemplo, o sistema Leica AS).
- Coloque a lâmina de vidro com a parte manchada para ser microdissectados a face para baixo no palco microscópio.
- Montar um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml na cassete de recolha e adicionar 50 ul detampão de lise celular (por exemplo, DNA, RNA ou proteína de tampão de lise) na tampa na qual o tecido microdissecção irá recolher.
- Sob visão direta, utilize o joystick para identificar tecido de interesse, e usando a interface do software, anotar a seção de produtos orgânicos manchado, com destaque para as células a serem microdissectados na frente de invasão tumoral.
- Instrua o laser para o fogo, que deve tanto cortar a seção de destaque e impulsionar o tecido microdissecção na tampa do tubo de microcentrífuga.
- Uma vez que o material tenha sido recolhida suficiente, ejectar a cassete de recolha, a fechar o tubo de microcentrífuga e girar suavemente para desenhar o tampão de lise para o fundo do tubo.
- Coloque as amostras em gelo até microdissection está completa. Processe as amostras por um método adequado para extrair a substância a analisar de interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temos aplicado o método de cima para várias combinações de linhas celulares de CRC e células estromais. Um exemplo apresentado aqui é linhagens de células SW480 epitelial CRC com ex vivo fibroblastos humanos primários do cólon. 3-dimensional co-culturas são construídas (Figura 1), e submetido a microscopia de captura laser de microdissecção (Figura 2), e analisados por microRNA (miRNA) perfis (Figura 3) para a comparação destes pequenos RNAs de expressão diferencial entre células na frente do tumor invasivo e aqueles nos estratificadas (não invasoras) zonas tumorais.
Figura 1. Esquema e representações fotográficas do modelo organotípica. Células CRC são semeados em uma camada estromal sintético contendo fibroblastos e componentes essenciais da matriz extracelular. As células são co-cultivados em uma interface ar-líquido criado por elevar o gel organotípica dentro de uma grade de aço inoxidável estéril. Clique aqui para ver imagem ampliada.
.. Figura 2 LMD de células SW480 CRC invadindo o estroma organotípica Cresyl violeta é usado para destacar CRC células epiteliais (A); ilhas de tumores invasivos são então definidos (B); antes da dissecação do laser ocorre (C) e a peça cortada é transportada para um dispositivo de recolha (D). As células não-invasoras e células estromais são identificados e isolados utilizando a mesma metodologia.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Dados microarray MicroRNA. Matrizes foram digitalizados usando um scanner de Pro 3.0.5 GenePix para detectar Cy5 em um comprimento de onda de 635 nm. Intensidades fluorescentes médios foram normalizados e os rácios de expressão calculados entre a laser microdissectados células CRC margem invasivos e células CRC margem não-invasivos nas camadas epiteliais estratificadas. Os dados foram ordenadas por mudança vezes e valores de dados + / - 2 vezes a mudança a partir de um experimento representativo são apresentados mostrando a expressão de genes miRNA diferencial entre as células de margem invasivos e células de margem não-invasivos. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar especificamente as células tumorais que tenham adquirido a capacidade de invadir o estroma associado câncer durante os primeiros estágios da progressão metastática em um 3-dimensional construção de co-cultura de células epiteliais e estromais.
Modelos de co-cultura composto por células epiteliais CRC justapostos com um estroma sintético contendo ex vivo fibroblastos cólon humanos foram usados para estudar a invasão CRC em 3 dimensões. Este sistema fisiologicamente relevante, que simula as condições in vivo pode ser adaptado para outros cenários de cancro através da substituição de células no epitélio e estroma da construção utilizando ex vivo de fibroblastos de várias origens anatómicas. Uma limitação deste método é a simplificação excessiva do compartimento estromal utilizando apenas as células de fibroblasto, como in vivo estroma do cólon é um tecido complexo e dinâmico com cel variandol constituintes. Um exemplo é as células derivadas-imunes, os quais estão presentes em quantidades significativas no material de tumor primário, mas ausente deste modelo. Apesar disso, a reprodutibilidade confiável deste modelo, juntamente com a facilidade com que os componentes celulares podem ser manipulados experimentalmente (por exemplo, por mais de expressão ou knockdown de genes individuais nas epiteliais e estromais compartimentos), fazem deste um modelo valioso e de baixo custo em comparação a convencional na experimentação in vivo.
Neste manuscrito, também demonstraram que as células CRC no tumor invasivo frente neste sistema modelo expressar diferentes perfis de expressão de miRNA de células idênticas não na frente invasiva e situado em camadas epiteliais estratificadas. Isto representa uma prova de conceito de que o laser tecido microdissectados a partir de modelos de co-cultura organotípicas é uma abordagem válida para estudar os processos iniciais em metástase. O foco elere era exclusivamente sobre a expressão de miRNA, desde miRNAs estão fortemente implicados na patogênese de diversas doenças malignas e desregulamentado expressão tanto em células epiteliais e do estroma de câncer associado ter consequências importantes no CRC 2,3,5. Além disso miRNAs são estáveis para extração e análise do tecido embebido em parafina fixado em formalina de arquivo convencional, tornando-os poderosos biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico em tecidos humanos submetidos a processamento convencional em laboratórios histopatológicos de rotina 9,10. No entanto, a nossa metodologia poderia muito facilmente ser adaptado para a análise genômica e proteômica, enfatizando ainda mais a versatilidade desta abordagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não divulgar os potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
MB é suportado por financiamento da concessão de uma bolsa de estudo do MRC. KP e AHM são suportados por financiamento da concessão de Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (Inglaterra) (C28503/A10013). Somos gratos pelo apoio da Universidade de Southampton Unidade de Pesquisa histoquímica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
