Summary
Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.
Abstract
Invadir el cáncer colorrectal células (CRC) han adquirido la capacidad de liberarse de sus células hermanas, infiltrarse en el estroma, y remodelar la matriz extracelular (ECM). La caracterización de la biología de este grupo fenotípicamente distintas de células podría mejorar sustancialmente nuestra comprensión de los eventos tempranos durante la cascada metastásica.
La invasión tumoral es un proceso dinámico facilitado por interacciones bidireccionales entre epitelio maligno y el estroma cáncer asociado. Con el fin de examinar las respuestas de células específicas en el estroma interfaz tumor hemos combinado co-cultivo y técnicas de micro-disección láser organotípico.
Modelos organotípicos, en el que los componentes del estroma clave tales como los fibroblastos son 3-dimentioanally co-cultivadas con células epiteliales cancerosas, son herramientas experimentales altamente manipulables que permiten la invasión y las interacciones con el cáncer del estroma para ser estudiados en casi phcondiciones ysiological.
Microdisección láser (LMD) es una técnica que implica la disección quirúrgica y la extracción de los diversos estratos dentro del tejido del tumor, con precisión nivel de micras.
Mediante la combinación de estas técnicas con el perfil genómico, transcriptómica y epigenética nos proponemos desarrollar una comprensión más profunda de las características moleculares de la invasión de las células del tumor y el tejido circundante del estroma, y al hacerlo, potencialmente revelar nuevos biomarcadores y oportunidades para el desarrollo de fármacos en el CCR.
Introduction
Co-cultivos organotípicos son modelos de ingeniería tisular que ayuda en la reconstrucción del microambiente del tumor in vivo en en 3-dimensiones mediante la yuxtaposición de las células epiteliales malignas y células estromales en un gel de colágeno que contiene componentes de la matriz extracelular esenciales 1-3. Principalmente concebido como un método de medición de la invasión tumoral, organotypics reducir la dependencia en modelos animales in vivo, y evitar las deficiencias de otras técnicas in vitro tales como ensayos Transwell, en el que las células invasoras se ven obligados artificialmente en un estado mono-dispersado 2-4. La inclusión de las células del estroma en estos modelos, tales como fibroblastos, refleja el papel esencial de la microambiente del tumor en la regulación de la invasión maligna y metástasis 3-4, sin embargo, la heterogeneidad fenotípica de la estroma es tal que con el fin de maximizar la relevancia fisiológica de organotípicos modelos, específica de órganos, de precisión anatómica ex vivofibroblastos deberían incluirse siempre que sea posible de 3,6.
Organotypics son una plataforma versátil para estudiar las interacciones entre el tumor y las células del estroma y se utilizan cada vez más en nuevas formas de examinar el impacto en la invasión tumoral de los inhibidores químicos y alteraciones genéticas específicas 7,8. Estudiar el margen del tumor invasivo es una perspectiva particularmente emocionante. En los modelos organotípicos, cáncer colorrectal establecido (CRC) las líneas celulares se caracterizan por producir una capa epitelial bien estratificada, y en sección transversal, las células que han adquirido la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM) son fácilmente discernibles. A la luz de la heterogeneidad de micro-topográfico establecido de tumor y el tumor asociado células estromales in vivo, la extracción de estas células usando microdisección láser y el estudio de ellos en el aislamiento, puede revelar importantes conocimientos biológicos con respecto a los orígenes de la metástasis del cáncer colorrectal y cómo puede ser más eficiente apuntado. Yon la siguiente metodología, todos los pacientes que donaron muestras de tejidos por escrito el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por los comités de ética instituciones regionales de investigación.
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Protocol
1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos primarios de colon explantes
- Obtener muestras de tejido normal de la mucosa del colon humano directamente de la sala de operaciones quirúrgica, y suspender en 7-10 ml de PBS suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,25 mg / ml de Fungizone.
- En el laboratorio, colocar la muestra en el centro de un 10 cm de placa de cultivo tisular y lavar 3 veces con PBS / Pen-Strep / Fungizone. No aspirar después del último lavado.
- Con pinzas y bisturí estériles, cortar el tejido en trozos pequeños (aproximadamente 2 mm) y colocar cada pieza en el centro de una cruz dibujada con la hoja de bisturí en una placa de 12 pocillos. Rock the bisturí suavemente sobre el tejido para permitir que se adhiera.
- Cultura los especímenes en 750 l de medios de crecimiento de fibroblastos primario (DMEM suplementado con 20% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 292 mg / ml de L-Glutamina), que debe submerge del tejido sin que le permite flotar. Evite molestar a la placa en los próximos 5 días, salvo para volver a la alimentación cada 2 días.
- Durante los siguientes 5 días fibroblastos se lentamente comenzar a crecer fuera desde el borde del tejido. En aproximadamente 7 días, este será más visible. Después de aproximadamente 3-4 semanas, y si no son suficientes los fibroblastos que crecen fuera, añadir 750 l de tripsina a cada pocillo. Después las células se han separado (que puede tardar 5-10 min), la piscina y la transferencia a un matraz de cultivo tisular T-25.
2. Preparación Organotípicos
Preparación de los fibroblastos impregnada de gel de organotípicos:
- Preparar una suspensión de células de fibroblastos que contiene 5 x 10 5 células por organotípicos en DMEM suplementado con 10% de FCS y 292 mg / ml de L-Glutamina.
- Se llevan los geles organotípicos en el hielo, en las siguientes proporciones:
- 7 volúmenes de colágeno de cola de rata: mezcla de Matrigel (01:01)
- 1 volumen de filtrado 10x DMEM
- 1 volumen de FCS
- 1 volumen de suspensión celular de fibroblastos que contiene 5 x 10 5 fibroblastos
Para 9 geles (1 ml por gel) preparar 10 ml y mezclar suavemente para evitar burbujas.
- Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera húmeda para permitir que los geles para ajustar. Después de 1 hora se añade 1 ml de DMEM (10% de FCS) / GLUT en la parte superior de los geles y volver a la incubadora durante la noche.
- Al día siguiente, el medio aspirado desde la parte superior de los geles y la placa 1 ml de medio que contiene 5 x 10 5 células epiteliales CRC.
Preparación de láminas de nylon recubierto de gel:
- Preparar estéril, hojas de nylon autoclave de 1,5 cm x 1,5 cm, por adelantado.
- El uso de pinzas estériles, colocar el número requerido de hojas de nylon en una placa de cultivo de 10 cm (por lo general 4 hojas de nylon pueden ser acomodados por plato).
- Invente gel en el hielo en el siguiente orden (250 l total deSe requiere volumen por hoja de nylon):
- 7 volúmenes de colágeno de cola de rata
- 1 volumen de filtrado 10x DMEM
- 1 volumen de FCS
- 1 volumen de DMEM 10% FCS / Superabundancia
- Si la solución es de color amarillo, neutralizar añadiendo 0,1 M de NaOH en 50 ml de alícuotas hasta que la solución se vuelve rosa.
- Añadir 250 l de esta solución a cada lámina de nylon y se incuba a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 durante 30 minutos para permitir gel se cuaje.
- Invente solución de glutaraldehído al 1% en PBS. Añadir 10 ml a cada 10 cm de placa de cultivo una vez que el gel se haya establecido y se incuba a 4 ° C durante 1 hora.
- Sábanas de nylon lava 3X en PBS y 1x en DMEM (10% de FCS) / Glu y Incubar toda la noche en DMEM / Glu en 4 ° C.
Elevar geles organotípicos en las parrillas de acero para la invasión:
- Pre-preparar rejillas de andamiaje por plegado de chapas de acero inoxidable en una formación de trípode. Esterilizar en autoclave antes de su uso.
- El uso de fórceps esterilizados en etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.
- Coloque una lámina de nylon recubierto de gel con la parte superior de colágeno, en cada cuadrícula.
- Transferir cuidadosamente los geles organotípicos de la placa de 24 pocillos a la lámina de nylon planteado usando una espátula esterilizada en etanol.
- Llenar el pocillo con DMEM 10% de FCS / GLUT suplementado con 10% de FCS hasta que la lámina de nylon está en contacto con el medio, pero no sumergido. Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico.
- Incubar durante 14 días a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO 2, en sustitución de los medios de comunicación cada 2 días.
3. Organotípicos Fijación
- Retire toda organotípico incluyendo lámina de nylon del bien y colocar en papel film.
- Biseccionar organotípico y lámina de nylon con un bisturí desechable limpio y fijar las dos mitades en formol durante 24 horas a temperatura ambiente.
- Reemplace formaldehído con 70% ethanol después de 24 horas y dejar toda la noche antes de la inclusión en parafina, seccionando y tinción.
4. Microdisección láser del Margen Invasiva
- Sección a 10 micras de espesor sobre una membrana de diapositivas montadas.
- Desparafinar secciones mediante la aplicación de xileno durante 1 minuto, luego retire Xileno y fijan en etanol al 75% durante 1 min.
- Eliminar el etanol y tinción con solución de violeta de cresilo 0,125% durante 1 min. Cresil violeta resalta las células epiteliales y permite una fácil discriminación de la estroma.
- Eliminar violeta de cresilo y aplicar etanol al 100% durante 1 min antes de enjuagar con etanol al 100%. Permitir diapositivas secar al aire durante 30 min.
- Realizar microdisección láser utilizando plataforma elegida (por ejemplo, el sistema Leica AS).
- Coloque la placa de vidrio con la sección manchada que se microdissected boca abajo en la platina del microscopio.
- Montar un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el casete de la colección y añadir 50 l detampón de lisis celular (por ejemplo, ADN, ARN o proteína de tampón de lisis) a la tapa en la que el tejido microdissected recogerá.
- Bajo visión directa, utilice el joystick para identificar el tejido de interés, y el uso de la interfaz de software, realizar anotaciones en la sección orgánica de colores, destacando las células que se microdissected en el frente de invasión tumoral.
- Instruir al láser para disparar, que debe tanto cortar la sección resaltada e impulsar el tejido microdissected en la tapa del tubo de microcentrífuga.
- Una vez que el material suficiente se ha recogido, expulse el cassette colección, cerrar el tubo de microcentrífuga y girar suavemente para sacarla del tampón de lisis a la parte inferior del tubo.
- Coloque las muestras en hielo hasta microdisección se ha completado. Procesar muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés.
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Representative Results
Hemos aplicado el método anterior para múltiples combinaciones de líneas celulares de CRC y células del estroma. Un ejemplo que se presenta aquí es las líneas de células SW480 epitelial CRC con ex vivo fibroblastos primarios de colon humano. Co-cultivos 3-dimensionales se construyen (Figura 1), se sometieron a microscopía de láser y microdisección de captura (Figura 2), y se analizaron por microARN (miARN) de perfiles (Figura 3) para la comparación de miRNAs expresados diferencialmente entre células en la parte delantera del tumor invasivo y los de los (no invasora) zonas tumorales estratificadas.
Figura 1. Esquema y representaciones fotográficas del modelo organotípico. Células CRC se siembran en una capa estromal sintética que contiene fibroblastos y componentes de la matriz extracelulares esenciales. Las células son co-cultivadas en una interfase aire-líquido creado por elevar el gel organotípico sobre una rejilla de acero inoxidable estéril. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
.. Figura 2 LMD de células SW480 CRC que invaden el estroma organotípico cresil violeta se utiliza para resaltar CRC células epiteliales (A); islas tumorales invasoras se definen entonces (B); antes de la disección con láser se produce (C) y la pieza cortada se transporta a un dispositivo de recogida (D). Las células no invasoras y las células estromales son identificados y aislados utilizando la misma metodología.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. MicroRNA datos de microarrays. Matrices fueron escaneados utilizando un escáner GenePix Pro 3.0.5 para detectar Cy5 a una longitud de onda de 635 nm. La media de intensidad de fluorescencia se normalizaron y expresión ratios calculados entre el láser microdissected células CRC márgenes invasivas y células CRC margen no invasivas en las capas epiteliales estratificadas. Los datos fueron ordenados por el cambio veces y los valores de datos + / - 2 veces el cambio de un experimento representativo se presentan mostrando diferencial miARN expresión de genes entre las células y las células invasoras margen de margen no invasivos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Aquí se describe un método para aislar y caracterizar las células tumorales que han adquirido la capacidad de invadir el estroma asociado cáncer durante las primeras etapas de la progresión metastásica en un constructo de co-cultivo de 3 dimensiones de células epiteliales y estromales específicamente.
Se utilizaron modelos de co-cultivo formadas por células epiteliales CRC yuxtapuestos con un estroma sintética que contiene ex vivo fibroblastos colon humano para estudiar la invasión CRC en 3-dimensiones. Este sistema fisiológicamente relevante que imita las condiciones in vivo pueden ser adaptados para otros escenarios de cáncer mediante la sustitución de las células en el epitelio y el estroma mediante la construcción de fibroblastos in vivo ex de diversos orígenes anatómicas. Una limitación de este enfoque es la simplificación excesiva del compartimiento del estroma utilizando sólo células de fibroblasto, como el estroma del colon in vivo es un tejido complejo y dinámico con diferentes CELl constituyentes. Un ejemplo son las células inmunitarias derivadas, que están presentes en cantidades significativas en el material de tumor primario pero ausente de este modelo. A pesar de esto, la reproducibilidad fiable de este modelo junto con la facilidad con la que los constituyentes de las células puede ser manipulado experimentalmente (por ejemplo, por sobre-expresión o desmontables de genes individuales en los compartimentos epiteliales y estromales), hacen de este un modelo valioso y rentable en comparación a convencional en la experimentación in vivo.
En este manuscrito también hemos demostrado que las células de CRC en el frente invasivo del tumor en este modelo de sistema expresan diferentes perfiles de expresión de miRNA de las células idénticas, no en el frente invasivo y situados en las capas epiteliales estratificadas. Esto representa una prueba de concepto que el láser microdissected tejido a partir de modelos de co-cultivo organotypic es un enfoque válido para estudiar los procesos tempranos en la metástasis. El enfoque seOD era exclusivamente sobre la expresión de los genes miARN, desde miRNAs están fuertemente implicados en la patogénesis de numerosas enfermedades malignas y desregulado expresión tanto en el epitelio y el cáncer de células del estroma asociado tienen consecuencias importantes en CRC 2,3,5. Además miRNAs son estables a la extracción y análisis de tejido incluido en parafina fijado con formalina de archivo convencional, lo que los biomarcadores poderosas para el diagnóstico y pronóstico en los tejidos humanos sometidos a un tratamiento convencional en laboratorios histopatológicos de rutina 9,10. Sin embargo, nuestra metodología muy fácilmente podría ser adaptado para el análisis genómico y proteómico, enfatizando aún más la versatilidad de este enfoque.
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Disclosures
Los autores describen posibles conflictos de interés.
Acknowledgments
MB es apoyada por subvenciones de una beca MRC. KP y AHM son apoyados por subvenciones del Wessex de Investigación Médica y de Investigación del Cáncer del Reino Unido / RCS (Inglaterra) (C28503/A10013). Estamos agradecidos por el apoyo de la Universidad de la Unidad de Investigación Histoquímica Southampton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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