Abstract
रक्त सीरम कैंसर की कोशिकाओं को microvessels में अपने intravasation को सुविधाजनक बनाने, विस्थापित और आक्रमण जो की दिशा में एक chemoattractant के रूप में कार्य करता है। हालांकि, कोशिकाओं की ओर पलायन जो की दिशा में वास्तविक अणुओं मायावी रहते हैं। इस संशोधित आक्रमण परख सेल प्रवास और आक्रमण ड्राइव जो लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है। इस तकनीक में एक विशिष्ट हार्मोन, वृद्धि कारक, या साइटोकाइन एक कैंसर सेल के आक्रामक संभावित मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए तीन शर्तों के तहत आक्रमण सूचकांक तुलना करती है। इन शर्तों मैं) सामान्य भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), द्वितीय) का कोयला-छीन हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स और तृतीय) सीएस FBS के + अणु को हटा जो FBS के (सीएस-एफ बी एस), ("एक्स") चिह्नित शामिल हैं। FBS के रूप में की तुलना सीएस FBS के साथ सेल आक्रमण में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन, परिवर्तन मध्यस्थता में हार्मोन, साइटोकिन्स या वृद्धि कारकों की भागीदारी का संकेत है। व्यक्तिगत अणुओं तो फिर से करने की क्षमता परख करने के लिए सीएस FBS के लिए वापस जोड़ा जा सकता हैकविता या आक्रमण फेनोटाइप बचाव। इसके अलावा, दो या दो से अधिक कारकों additive या ड्राइविंग या आक्रमण बाधा में कई अणुओं के synergistic प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि हार्मोन, साइटोकिन्स, और / या वृद्धि कारकों कैंसर सेल की एक विशेष प्रकार या एक विशिष्ट उत्परिवर्ती के लिए chemoattractants या आक्रमण के अवरोधकों के रूप में सेवारत द्वारा सेल आक्रमण में एक भूमिका निभा निर्धारित करने के लिए अन्वेषक सक्षम बनाता है। विशिष्ट chemoattractants और अवरोधकों की पहचान करके, इस संशोधित आक्रमण परख कैंसर सेल आक्रमण प्रत्यक्ष कि रास्ते संकेतन स्पष्ट करने के लिए मदद मिल सकती है।
Introduction
एक उपन्यास आक्रमण परख विशिष्ट हार्मोन, कैंसर सेल आक्रमण में chemoattractants रूप साइटोकिन्स और / या वृद्धि कारकों की भागीदारी की पहचान करने के लक्ष्य के साथ विकसित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से आक्रमण करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता मेटास्टैटिक फेनोटाइप 1-3 की एक बानगी है। आक्रमण कक्षों बड़े पैमाने पर कैंसर सेल आक्रमण और प्रवास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया है और इन विवो ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस के तंत्र के रूप में ज्ञान प्रदान कर सकता है। कक्षों सेल संस्कृति प्लेटों के कुओं के भीतर नेस्ट बेलनाकार सेल संस्कृति आवेषण से मिलकर बनता है। आवेषण के नीचे से परिभाषित ताकना आकार के अर्द्ध पारगम्य पॉली कार्बोनेट या polystyrene झिल्ली हैं।
मानक आक्रमण परख में, कोशिकाओं सीरम मुक्त मीडिया के साथ डालने झिल्ली पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और सीरम या सीरम की तरह chemoattractants से भर रहे हैं कि सेल संस्कृति कुओं में रखा गया है करने के लिएईटी ऊपर एक chemoattractive बल। इस बल ड्राइव कोशिकाओं तो पता लगाने और कोशिकाओं की संख्या यों के लिए पारंपरिक रंगों का उपयोग कलंकित किया जा सकता है, जो बाह्य मैट्रिक्स (आक्रमण), की एक परत के माध्यम से, वैकल्पिक रूप से अर्द्ध पारगम्य झिल्ली (माइग्रेशन) के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए या। सेल नंबर तो एक noninvasive सेल लाइन में प्रवास और आक्रमण की हद के अनुसार सामान्यीकृत है। इस विधि को एक अन्वेषक आनुवंशिक जोड़तोड़ सहित स्थितियों की एक किस्म के तहत विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की आक्रामक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है।
हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों सीरम के महत्वपूर्ण घटक हैं और तेजी से आक्रामक phenotype के चार ड्राइविंग के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया जा रहा है। हालांकि, अब भी आक्रमण मध्यस्थता में इन chemoattractive सीरम अणुओं की प्रकृति, भूमिका, और विशिष्टता मायावी रहते हैं। चुनौती ड्राइविंग के लिए जिम्मेदार हैं सीरम या सीरम की तरह chemoattractants में क्या विशिष्ट कारकों का निर्धारण करने के लिए रहता हैअणुओं के आक्रमण की प्रक्रिया को बाधित कर सकता है कैंसर सेल आक्रमण के रूप में भी। इस रिपोर्ट में, हम कैंसर की कोशिकाओं की chemoattraction और आक्रमण ड्राइविंग अणुओं के रूप में, हार्मोन, साइटोकिन्स और / या सीरम में मौजूद वृद्धि कारकों के संभावित भागीदारी मूल्यांकन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है।
इस प्रस्तावित संशोधित प्रोटोकॉल में, लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग 2% लकड़ी का कोयला छीन FBS के (सीएस-एफ बी एस) उत्पन्न करने के लिए 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 2% FBS और 2% सीएस FBS के दोनों कैंसर सेल आक्रमण ड्राइव करने के लिए chemoattractive बल स्थापित करने के लिए एजेंट के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। सामान्य 2% FBS के की तुलना में एक chemoattractive एजेंट के रूप में 2% सीएस FBS के का प्रयोग पहली सहित कई लाभ देता है, और सबसे प्रमुखता, हार्मोन, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों के कम / रिश्तेदार अभाव में कैंसर के आक्रमण फेनोटाइप अध्ययन करने की क्षमता। यह भी हार्मोन, वृद्धि कारकों के सामूहिक हटाने का आकलन है कि अन्वेषक सक्षम बनाता है, और cytokines आक्रामक सूचकांक में वृद्धि या कमी का कारण बनता है। परख तो (आंकड़े 2 और 3 देखें) "एक्स" के रूप में नामित एक व्यक्ति घटक है, के अलावा, कमी, वृद्धि को रोकती हैं, या अपने मूल मूल्य के लिए आक्रामक सूचकांक बहाल कर सकते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए बनाया गया है। इस पद्धति का कोयला स्ट्रिपिंग दौरान सीरम से निकाल दिया जाता है कि घटक की शारीरिक स्तर को प्राप्त करने के लिए विशिष्ट है, यद्यपि यह भी लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग भी संकेत पारगमन रास्ते को प्रभावित कर सकते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यह लकड़ी का कोयला स्ट्रिपिंग osteoprogenitor कोशिकाओं के alkaline फॉस्फेट गतिविधि कम होती है और MAPK activators 5 की कमी के माध्यम से adipogenesis पैदा कर सकते हैं कि सूचना दी गई है। चारकोल छीन मीडिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और प्रोटोकॉल पर आधारित है कि dextran के साथ लकड़ी का कोयला जोड़ती है और भ्रूण गोजातीय सीरम हे / एन 6 के साथ incubated रेखांकित कर रहे हैं।
यह परख respo में विकसित किया गया थाएनएसई जकर एट अल। 7 द्वारा रिपोर्ट एक परिणाम के लेखकों सामान्य 2% FBS के साथ मीडिया की ओर पलायन जब अंतराल जंक्शन संचार को प्रभावित करने वाले एक उत्परिवर्ती phenotype आक्रमण सूचकांक में वृद्धि का प्रदर्शन किया है कि प्रदर्शन किया। यह वृद्धि का कोयला-छीन सीरम के प्रतिस्थापन के साथ समाप्त हो गया था। इस परिणाम से, लेखकों ने निष्कर्ष निकाला है कि एक lipophilic अणु की ओर इस उत्परिवर्ती प्रभावित माइग्रेशन (अधिक विशेष रूप से, एक हार्मोन, वृद्धि कारक, या साइटोकाइन) 7। यह सर्वविदित है कि हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकाइन ट्यूमर को बढ़ावा देने और आक्रमण चार में शामिल रास्ते संकेतन कि मध्यस्थता में जाना जाता है। इस प्रकार, यह वैज्ञानिक जांचकर्ताओं क्या कारक (एस) के एक अध्ययन के तहत अपने विशेष कैंसर कोशिकाओं या म्यूटेंट के ट्यूमर आक्रमण गाड़ी चला रहे हैं यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। घटक की एकाग्रता के बीच के अंतर के हिसाब से निर्धारित परख उनके शारीरिक एकाग्रता में अलग-अलग घटकों की भूमिका का पता करने के लिए बनाया गया है और# 8220; एक्स "सामान्य FBS और सीएस FBS के में। इस परख के विकास के माध्यम से, जांचकर्ताओं को अपने सिस्टम गवर्निंग विशिष्ट आक्रामक मार्ग में और अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं।
हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स अक्सर ट्यूमर प्रमोटरों 8 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। ऐसे EGF के रूप में इन कारकों में से कुछ आक्रमण कक्षों 9 में chemoattractants के लिए प्रत्यक्ष स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, यह इन प्रत्यक्ष ट्यूमर आक्रमण कि सीरम के प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभावना लगती है। इस प्रोटोकॉल एक अन्वेषक कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामक संभावित मध्यस्थता में हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स की भागीदारी का आकलन करने के लिए अनुमति देता है जो परंपरागत इन विट्रो आक्रमण परख करने के लिए एक सरल, अभी तक महत्वपूर्ण, संशोधन का प्रस्ताव है। हालांकि, परख कीमती समय और अनुसंधान का उपयोग करने के रूप में नहीं, प्रक्रिया के विश्लेषण में एक प्रारंभिक कदम पर उनके अध्ययन के लिए प्रभावी हो जाएगा कि क्या करने के रूप में एक जवाब के साथ अन्वेषक प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैस्त्रोत अनावश्यक समझा है। इस विधि सीएस FBS के उपयोग करता है और संभावित कैंसर सेल आक्रमण कि मध्यस्थता नेतृत्व उम्मीदवार के रूप में आगे बढ़ाने के अणुओं जो के रूप में जांचकर्ताओं विवेक पर निर्भर करता है। इन विश्लेषण से परिणाम सीरम घटकों विशेष सेल लाइन या उत्परिवर्ती के लिए chemoattractants या अवरोधकों का अध्ययन किया जा रहा है के रूप में सेवा है जो की पहचान करने में उपयोगी साबित करना चाहिए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण अन्वेषक को बढ़ावा देने या कैंसर कोशिका आक्रमण बाधा या तो कुंजी संकेत दे रास्ते की पहचान में मदद कर सकते हैं; इस प्रकार भविष्य दवा डिजाइन निर्देशन।
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Protocol
1. विभिन्न मीडिया और अतिरिक्त घटकों की तैयारी
- प्रयोग करने के पहले, परीक्षण किया जाना है या तो सामान्य FBS की इसके अलावा, कोयला छीन FBS के, या लकड़ी का कोयला छीन FBS के साथ साथ घटक के साथ DMEM या अन्य निर्दिष्ट मीडिया से मिलकर मीडिया तैयार करते हैं। कई घटकों प्रत्येक प्रयोग में परीक्षण किया जा सकता है कि ध्यान दें।
- वजन और उचित शारीरिक एकाग्रता में लकड़ी का कोयला छीन सीरम में भंग किया जा करने के लिए हार्मोन, वृद्धि कारक है, या साइटोकिन्स पतला।
2. बर्फ पर कोलेजन मैट्रिक्स तैयार करें
- 200 μl 10x पीबीएस (7.4 पीएच), 5.4 μl 1 एन NaOH, डबल आसुत एच 2 ओ के 600 μl, और 1.2 मिलीलीटर कोलेजन मैं: मैं बर्फ पर निम्नलिखित बाँझ फ़िल्टर्ड घटक जोड़कर 2.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर में 2 मैट्रिक्स मिलीलीटर कोलेजन तैयार करें (कम से 3.63 मिलीग्राम / एमएल)।
- थाली करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर कोलेजन मैं समाधान रखें।
3. <परख के लिए प्रवासन / आक्रमण प्लेटें तैयार/ P>
- प्रत्येक कोशिका लाइन परीक्षण किया जा करने के लिए, 12 कुओं आवेषण होते हैं, जिसमें एक 24 अच्छी तरह से चैम्बर प्लेट का उपयोग करें। Chemoattractant मीडिया को जोड़ने और प्रयोगात्मक सेट अप के लिए सम्मिलित करता है स्थानांतरित करने के लिए सम्मिलित करता है शामिल नहीं है कि अतिरिक्त 12 कुओं का प्रयोग करें।
नोट: सेल लाइनों यहाँ का उपयोग करने के लिए एक पॉलीथीन teraphthalate (पीईटी) झिल्ली और 8 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ प्लेटों पर एक कोलेजन मैट्रिक्स इष्टतम है। हालांकि, प्रीकोटेड प्लेटों में एक Matrigel मैट्रिक्स भी सेल लाइन की जांच की जा रही है के अनुसार कमी हुई छेद के आकार के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। - स्पष्ट रूप से (एक नियंत्रण, noninvasive सेल लाइन के लिए FBS के प्रवास, सीएस FBS के प्रवास, FBS के आक्रमण, और सीएस-FBS के आक्रमण के साथ ही FBS के पलायन) विश्लेषण किया जा रहा हालत प्रति तीन कुओं का उपयोग कर, प्लेट लेबल। एक कोलेजन या Matrigel मैट्रिक्स के माध्यम से और फिर झिल्ली में छिद्रों के माध्यम से आंदोलन द्वारा एक पीईटी झिल्ली में छिद्रों के माध्यम से आंदोलन, और परख आक्रमण से परख माइग्रेशन। एक करने के लिए प्रत्येक कोशिका हालत के लिए अलग अलग रंग मार्कर का उपयोगचढ़ाना प्रक्रिया में आईडी।
4. आक्रमण मैट्रिक्स बांटना
- ध्यान से आवेषण में कोलेजन मैट्रिक्स समाधान के 75 μl आक्रमण assays के लिए इस्तेमाल किया जा विंदुक। बुलबुले से बचने के लिए सावधानी बरतें। सतह के लिए एक औंधा विंदुक टिप लगाने से बुलबुले फैलाने।
- जमना को जेल सक्षम करने के लिए 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर कोलेजन लेपित आवेषण के साथ प्लेट हस्तांतरण।
5. प्लेट झिल्ली या आक्रमण मैट्रिक्स पर कोशिकाओं
- इस बीच, Trypsinize कोशिकाओं और 10% FBS के साथ मीडिया जोड़ें। स्पिन कोशिकाओं को एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर और सीरम मुक्त मीडिया में 3x कुल्ला।
- सीरम मुक्त मीडिया में resuspend। एक hemocytometer या स्वचालित स्लाइड काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना। 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सीरम मुक्त मीडिया जोड़ें।
- कोलेजन मैट्रिक्स (30 मिनट के बाद) जम गया है, के साथ मीडिया के 700 μl जोड़ने या तो2% परिभाषित FBS के या अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए FBS के लकड़ी का कोयला-छीन लिया। प्रति प्लेट 12 इंसर्ट का:
- तीन आवेषण मीडिया के साथ कोलेजन और कुओं है + 2% FBS
- तीन आवेषण मीडिया के साथ कोलेजन और कुओं है + 2% सीएस FBS के
- तीन आवेषण मीडिया + 2% FBS के साथ कोई कोलेजन और कुओं है
- तीन आवेषण मीडिया के साथ कोई कोलेजन और कुओं है + 2% सीएस FBS के
- जांच की जा रही कारकों की संख्या पर और हर हालत के लिए इसी एक नहीं कोलेजन नियंत्रण के साथ आधार अतिरिक्त प्लेटों का प्रयोग करें।
- सभी माइग्रेशन और आक्रमण आवेषण में डालने के प्रति 500 μl कोशिकाओं चढ़ाना, 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल में सम्मिलित करता सेल निलंबन जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 22 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
6. पलायन और हमलावर कोशिकाओं की संख्या यों
- अलग कुओं में मेथनॉल लगानेवाला, eosin, और hemotoxylin, का उपयोग कुओं का सेट अप धुंधला।
- प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं और मैट्रिक्स दूर करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करें।प्रत्येक के लिए अच्छी तरह दूसरी झाड़ू आवेदन के साथ Rrepeat।
- संदंश के साथ, उत्तराधिकार में 3 समाधान में से प्रत्येक में प्रत्येक डालने 1 सेकंड के लिए 5 बार डुबकी।
- सम्मिलित करता है / एन ओ सूखे की अनुमति दें।
- या तो मैं) के किनारों के आसपास सावधानी से काटने, एक स्केलपेल के साथ फिल्टर को हटाने और coverslip और विसर्जन के तेल के साथ एक स्लाइड पर माउंट, या द्वितीय) सम्मिलित करता हे / एन उल्टे सूखी और माइक्रोस्कोपी के लिए सीधे सम्मिलित करता है का उपयोग करने की अनुमति देते हैं।
- अगले दिन, एक 20x उद्देश्य के साथ एक खुर्दबीन के नीचे स्लाइड या सम्मिलित करता है को देखने और फिल्टर के विभिन्न क्षेत्रों से 5 छवियों को ले। स्थिरता में सुधार करने के लिए, चार बाहरी क्षेत्रों और एक केंद्र ले।
- ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सभी स्थितियों के लिए कोशिकाओं की गणना और नीचे फार्मूले को लागू होते हैं।
- इस प्रकार के रूप प्रतिशत आक्रमण का निर्धारण करते हैं:
मैं = एक डालने कोलेजन के माध्यम से हमलावर कोशिकाओं की # मीन
नियंत्रण डालने के माध्यम से पलायन कोशिकाओं की # = ख मतलब
% आक्रमण = (ए / बी) * 100 - इस प्रकार के रूप में 2% FBS के में आक्रमण सूचकांक का निर्धारण:
कोशिकाओं की% आक्रमण (2% FBS के में) assayed किया जा रहा = ग
% (2% FBS) में नियंत्रण noninvasive कोशिकाओं के आक्रमण = D
आक्रमण सूचकांक (एफ बी एस) = (सी / डी) - इस प्रकार के रूप में 2% सीएस FBS के में आक्रमण सूचकांक का निर्धारण:
कोशिकाओं की% आक्रमण = ई (2% सीएस FBS के में) assayed किया जा रहा है
% (2% सीएस-एफ बी एस) में नियंत्रण noninvasive कोशिकाओं के आक्रमण = च
आक्रमण सूचकांक (सीएस-एफ बी एस) = (ई / एफ)
7. दोहराएँ प्रायोगिक प्रोटोकॉल + एक्स एन कई कारकों संयुक्त साथ लकड़ी का कोयला-छीन FBS के लिए FBS के लकड़ी का कोयला-छीन की तुलना
- "एक्स" या घटकों के संयोजन के लिए विभिन्न उपकरणों का उपयोग कर के रूप में जरूरत प्रक्रिया को कई बार दोहराएँ।
- प्रवास और आक्रमण प्रभाव के लिए प्रत्येक कारक "एक्स" के योगदान को निर्धारित करने के लिए गणना लागू करें।
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Representative Results
आक्रमण सूचकांक एक noninvasive सेल लाइन को सामान्य बनाने के अनुसार हर हालत के लिए गणना की है। हमारे प्रयोगों के लिए, हम 1205Lu मेलेनोमा सेल लाइन और स्थापित संस्करण स्थिर सेल लाइनों हमारे आक्रामक लाइनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1205Lu कोशिकाओं को एक तार्किक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो 10 प्राप्त किए गए जिसमें से premalignant noninvasive संस्करण, WM793 का उपयोग करें। कि डर्मिस के प्राथमिक घटक है, क्योंकि हम भी आक्रमण मैट्रिक्स के रूप में कोलेजन मैं उपयोग। इष्टतम आक्रमण मैट्रिक्स सेल लाइन पर आधारित है और इन विवो साथ सामंजस्य की हद तक परिणाम 11 अलग-अलग होता है जिससे यह पिछले एक अध्ययन के अनुसार है। इस आक्रमण परख अन्वेषक प्राप्त हो सकता है संभव परिणामों के अनुसार रेखाचित्र के रूप में उल्लिखित है। प्रारंभ में, 2% FBS के लिए आक्रमण सूचकांक इस परख (आंकड़े 1 और 2) को आगे बढ़ाने के क्रम में सीएस FBS के लिए आक्रमण सूचकांक की तुलना में काफी अधिक है या कम होना चाहिए। एक महत्वपूर्ण incr हैंको कम या आक्रमण सूचकांक में कमी का कोयला-छीन FBS के साथ स्पष्ट है, इस परख अन्वेषक (आंकड़े 2 और 3) के लिए उपयोगी नहीं है। इस वृद्धि का कोयला-छीन FBS के साथ समाप्त हो रहा है, तो अन्वेषक पहले से ही बढ़ाया आक्रमण एक हार्मोन, वृद्धि कारक, या साइटोकाइन (आंकड़े 2 और 3) की ओर निर्देशित है कि ज्ञान है। फिर, अन्वेषक विशिष्ट ट्यूमर के प्रकार और chemoattractants के रूप में जो उम्मीदवार (एस) के वर्तमान प्रशंसनीय तंत्र का निर्धारण करने के उत्परिवर्तन के बारे में जानकारी का उपयोग करना चाहिए। अन्वेषक 2% FBS और 2% सीएस FBS के (तालिका 1) के बीच एकाग्रता अंतर पर घटक जोड़कर शारीरिक एकाग्रता में एक या कई घटकों को व्यक्तिगत रूप से कोशिश कर रहा द्वारा शुरू कर सकते हैं। एक घटक लकड़ी का कोयला-छीन सीरम में जोड़ा तो लकड़ी का कोयला-छीन अकेले सीरम, कि उम्मीदवार, "एक्स" की तुलना में आक्रमण संभावित कम हो जाती है की काफी एक आंशिक या के रूप में सेवा कर सकता है, बढ़ता हैवृद्धि की हद (आंकड़े 2 और 3) के आधार पर पूरा बचानेवाला। दो या अधिक घटकों एक additive या synergistic वृद्धि को प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है, चित्रा (3) (एक्स के रूप में 1 + x 2 + एक्स 3 ... चिह्नित)। आक्रमण की हद तक कम हो जाती है, जो एक कारक (- 4 आंकड़े 2) एक निरोधात्मक कारक के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। हमारे प्रयोगों में, हम अपने हार्मोन, वृद्धि कारक है, और हटाया साइटोकिन्स के साथ एक chemoattractant की ओर पलायन एक उत्परिवर्ती मेलेनोमा सेल लाइन (1205Lu T154A) के उपयोग के ट्यूमर invasiveness में कमी के कारण होता है कि पता चला है। तीन हार्मोन एक संभव "एक्स" की पहचान के लिए परीक्षण किया गया। ये एस्ट्रोजन (एस्ट्राडियोल), प्रोजेस्टेरोन, और थायराइड हार्मोन (टी -4) शामिल हैं। एस्ट्रोजन निरोधात्मक कारक (चित्रा 4) के रूप में पहचान की थी, जबकि इन हार्मोनों के दो, आक्रमण सूचकांक (प्रोजेस्टेरोन और थायराइड हार्मोन) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। में सूचीबद्ध संभावित परिणामों के अनुसारचित्रा 3, इस उदाहरण में प्रयोगात्मक परिणाम यह निश्चित संकेत दे कारकों पृथक कि रास्ते की पहचान करने में महत्वपूर्ण हो सकता है, क्योंकि यह एस्ट्रोजन इस परख में आगे का उपयोग किया जाएगा संभावना है कि हालत 2 के साथ एक कमी और दशा 3 के साथ एक अवरोध का प्रदर्शन भविष्य दवा डिजाइन रणनीतियों के लिए। अतिरिक्त प्रयोगों "फेनोटाइप बचाव" समर्थक आक्रमण chemoattractants के रूप में सेवा कर सकता है कि अन्य घटकों की पहचान करने के लिए वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स में निर्देशित किया जाएगा। दोनों के समर्थक आक्रामक और निरोधात्मक अणुओं की पहचान सामूहिक रूप से जांच के तहत सेल लाइनों और उत्परिवर्ती वेरिएंट के लिए आक्रामक संभावित स्पष्ट हो सकता है।
चित्रा 1. प्रायोगिक स्थापना और के डिजाइन। मॉडल सीधे पीईटी झिल्ली या सी पर या तो चढ़ाया कोशिकाओं दिखा प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए स्थापितसीरम मुक्त मीडिया में ollagen परत। कोशिकाओं या तो पलायन या प्रोटोकॉल के अनुसार संशोधित और दशा 1, 2 के रूप में वर्णन किया गया है जो एक chemoattractant की ओर कोलेजन मैट्रिक्स के माध्यम से हमला कर, और 3. माइग्रेट या आक्रमण कोशिकाओं तो तय है और दाग रहे हैं कर रहे हैं। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।
एक मानक आक्रमण परख झिल्ली परिणाम से 2. संभावित परिणामों चित्रा। इस मॉडल अन्वेषक आक्रमण परख और कैसे इन परिणामों की व्याख्या करने के लिए मुठभेड़ हो सकता है कि संभावित परिणामों को दर्शाता है। प्रत्येक वृत्त चित्र 1 में रेखांकित कर रहे हैं कि एक ही तीन शर्तों का उपयोग एक दाग फिल्टर के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम है। प्रत्येक डॉट आक्रमण के माध्यम से पारित कर दिया गया है कि एक सेल का प्रतिनिधित्व करता हैमैट्रिक्स और झिल्ली के तल पर दाग। कोशिकाओं को उचित मात्रा निर्धारित है और तदनुसार विश्लेषण किया जाएगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. डेटा व्याख्या सीएस FBS के ± एक्स के साथ आक्रमण के लिए इस रूपरेखा आक्रमण सूचकांक की गणना प्रयोगात्मक निष्कर्ष का निर्धारण कैसे करें। सीएस FBS के लकड़ी का कोयला-छीन सीरम है और एक्स पाठ में वर्णित सीएस FBS के मीडिया में जोड़ा व्यक्तिगत घटकों को दर्शाता है। लेखकों की वजह से हमारे परिस्थितियों में प्रयोगात्मक त्रुटि को स्वीकार कर लिया परिवर्तनशीलता के रूप में मानक विचलन (एसडी) की स्थापना की। हालांकि, निगरानी में स्थिति और प्रतिकृति की संख्या पर निर्भर करता है, इस पहलू सांख्यिकीविद की सीमा के भीतर होना करने के लिए समायोजित किया जा सकता हैअन्वेषक के लिए राजनैतिक महत्व। प्रयोग एकाधिक "एक्स" अणुओं के साथ दोहराया जा सकता है, (एक्स के रूप में निरूपित 1 + x 2 + एक्स 3 ...)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. आक्रमण परख का परिणाम है। यह ग्राफ 1205Lu मेटास्टैटिक मेलेनोमा कोशिकाओं से स्थापित एक उत्परिवर्ती संस्करण सेल लाइन 3 का उपयोग करते समय प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामों को दर्शाया गया है। एस्ट्रोजन (0.566 स्नातकोत्तर / एमएल), प्रोजेस्टेरोन (0.001 एनजी / एमएल), थायराइड हार्मोन (0.283 माइक्रोग्राम प्रति / डीएल): जोड़ा हार्मोन की सांद्रता इस प्रकार हैं। इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नियंत्रण, noninvasive सेल लाइन WM793B था। इस प्रयोग को इसी तरह के परिणाम के साथ तीन बार दोहराया गया था, और एक प्रतिनिधि ग्राफ दिखाया गया है।
FBS के बिल्ली # 16000
सीएस FBS के बिल्ली # 12,676
सीएस FBS के बिल्ली # SH30068
टेबल गोजातीय और मानव सीरा में चुनिंदा हार्मोन, वृद्धि कारक है और साइटोकिन्स की एकाग्रता पर्वतमाला के 1. उदाहरण हैं। 2% FBS और 2% सीएस FBS के बीच एकाग्रता फर्क शारीरिक सांद्रता को प्राप्त करने के लिए जोड़ा राशि का प्रतिनिधित्व करता है।
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Discussion
ट्यूमर मेटास्टेसिस एक multistep प्रक्रिया है। कोशिकाओं, तहखाने झिल्ली के माध्यम से तोड़ने वे दूर के स्थानों पर ले जाया जाता है, जिसमें लसीका प्रणाली या रक्त या तो microvessels, में intravasate चाहिए। ट्यूमर कोशिकाओं को फिर extravasate और एक macrometastasis 12 में उपनिवेश। Mesenchymal संक्रमण (EMT), ट्यूमर आक्रमण, और मेटास्टेसिस को उपकला के माध्यम से प्रगति स्टेरॉयड हार्मोन 13,14 द्वारा बढ़ाया गया है, वृद्धि 15-18, और साइटोकिन्स 19-21 कारकों। इन अणुओं एक परख के विकास के ट्यूमर आक्रामक क्षमता में उनकी भूमिका का पता करने के लिए कि जटिल संकेत दे रास्ते का गूढ़ रहस्य की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है, ट्यूमर प्रगति के संकेतन मार्ग को संबोधित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं।
यह ट्यूमर कोशिकाओं पलायन कर रहे हैं, जो करने के लिए प्रेरणा शक्ति की पहचान करना है, क्योंकि लकड़ी का कोयला-छीन सीरम का उपयोग करने का यह परख मौजूदा तरीकों पर एक फायदा है। पिछले एक परख हैआक्रमण कक्षों में सामान्य प्राथमिक स्तन fibroblasts का उपयोग करते हुए प्रकाशित किया गया। इस अध्ययन में, लेखकों का कोयला-छीन मीडिया का इस्तेमाल किया और कोशिकाओं tumorigenic नहीं थे क्योंकि उम्मीद के रूप में आक्रमण का कारण नहीं था जो Matrigel कक्षों में वापस एस्ट्रोजन गयी। हालांकि, उपस्थिति या एस्ट्रोजन के अभाव में बृहतभक्षककोशिका वातानुकूलित मीडिया की उपस्थिति काफी है और इसी तरह की एक हद से 22 आक्रमण में वृद्धि हुई। इस परख यह अभाव या एस्ट्रोजन की उपस्थिति में लकड़ी का कोयला-छीन सीरम के साथ आक्रमण assays के लिए प्रयोग किया जाता है कि इसी तरह की थी, जबकि यह एक ट्यूमर परख नहीं था और मैक्रोफेज और fibroblasts 22 के बीच पैराक्राइन बातचीत के अध्ययन के निर्देश पर किया गया था। लकड़ी का कोयला-छीन मीडिया का इस्तेमाल किया एक और परख एस्ट्रोजन के निम्न स्तर के अलावा स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में वृद्धि हुई है लेकिन अवरोधकों 23 kinase के लिए प्रतिरोध के कारण होता है कि दिखाने के लिए। यह अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए लागू एक आक्रमण परख है कि में हमारे अध्ययन से अद्वितीय हैअकेले या संयोजन में या तो अलग-अलग हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स का असर। इसके अलावा, उपलब्ध साहित्य के अधीन है, हम physiologically प्रासंगिक स्तर (1 टेबल) प्राप्त करने के लिए लकड़ी का कोयला-छीन सीरम में जोड़ने के लिए आवश्यक हार्मोन की सांद्रता निर्धारित किया है। सीरम में सामान्य रूप से उपस्थित स्तरों पर अलग-अलग घटक, "एक्स" के अलावा परख का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। इस परख सीरम में हार्मोन, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स के प्रकाशित स्तरों द्वारा सीमित किया जा करने के लिए लग सकता है, अन्वेषक अतिरिक्त कारकों के स्तर को निर्धारित करने के लिए एलिसा assays के उपयोग कर सकते हैं।
प्रोटोकॉल कोलेजन मैं प्रयोग करने के लिए विशिष्ट है जबकि अन्वेषक लगातार कि मैट्रिक्स का उपयोग किया गया था, तो Matrigel भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यह परिभाषित किया गया है जो एक घटक है और dermis के प्राथमिक घटक है क्योंकि हम कोलेजन मैं का उपयोग करना पसंद कारण है। इसके अलावा, हम 100 μ के 75 μl का उपयोगग्राम / मिलीलीटर कोलेजन आक्रमण मैट्रिक्स बनाने के लिए। यह भी वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह कोशिकाओं की एक उचित संख्या फिल्टर पर गिना जा सकता है कि इतनी एकाग्रता का अनुकूलन के लिए सबसे अच्छा है। कोशिकाओं अत्यधिक आक्रामक हैं, तो यह मैट्रिक्स के लिए कोलेजन मैं के 100 μl का उपयोग करने के लिए या कोलेजन एकाग्रता बढ़ाने के लिए बेहतर हो सकता है। इस तकनीक के अन्वेषक महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं ट्यूमर कोशिकाओं सीरम की लकड़ी का कोयला-स्ट्रिपिंग द्वारा हटा दिया जाता है, जो एक chemoattractant की दिशा पर हमला कर रहे हैं, यह केवल उपयोगी है। नियंत्रण और लकड़ी का कोयला-छीन सीरम के लिए परिणाम के बीच कोई अंतर नहीं है, तो परख का पीछा लायक नहीं होगा। परख भी व्यक्ति chemoattractants के साथ ही कीमोटैक्सिस के दमन के लिए परिणाम संबोधित करते हैं। इसके अलावा, संभव परिणामों की तुलना (चित्रा 3) में, हम एक प्रयोग के लिए स्वीकार कर लिया प्रयोगात्मक त्रुटि के स्तर के रूप में मानक विचलन का इस्तेमाल किया। हालांकि, वास्तविक वैलUES मानक विचलन या मानक त्रुटि और एक महत्वपूर्ण पी मूल्य के आधार पर अन्वेषक द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
इसके अलावा, इस परख से gleaned जानकारी कुछ संकेत दे रास्ते के लिए औषधीय inhibitors के डिजाइन में उपयोगी साबित हो सकता है। उदाहरण के लिए, एक या एक से अधिक हार्मोन, वृद्धि कारक है, और / या साइटोकिन्स अगर इस्तेमाल किया जा सकता है एक मौजूदा औषधीय एजेंट या उस मार्ग को बाधित करने के लिए डिजाइन एक नई दवा की तुलना में, विशेष रूप से एक ट्यूमर सेल उत्परिवर्तन के लिए आक्रमण तंत्र में फंसा हो पाया है। परख भी विशेष रूप से ट्यूमर उत्परिवर्तन के अध्ययन के लिए और एमिनो एसिड अवशेषों फेरबदल या अपनी स्थिति इस परख द्वारा की पहचान की थी कि chemoattractant के लिए एक ही समानता रखता है कि क्या एक प्रभावी उपकरण है। इस तरह, हमारे परख ट्यूमर आक्रमण को रोकने के लिए कैंसर की कोशिकाओं और संभवतः विधियों के आक्रमण तंत्र के रूप में सुराग प्रदान करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
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