Abstract
血清作为趋化对其中的癌细胞迁移和侵袭，促进他们的血管内进入微血管。然而，实际的分子朝向该细胞迁移仍然无法实现。本变形侵袭实验已经开发，以确定哪一个驱动器细胞迁移和侵袭的目标。这种技术比较下三个条件的侵袭索引，以确定是否一个特定的激素，生长因子，细胞因子或在介导癌细胞的侵袭性潜力的作用。这些条件包括：i）正常牛胎儿血清（FBS），ⅱ）活性炭处理的FBS（CS-FBS）的功能，从而激素，生长因子，以及细胞因子和iii）的CS-FBS +分子（表示为“X”）。相比FBS细胞侵袭与CS-FBS的显著的变化，表明激素，细胞因子和生长因子介导的变化的参与。各个分子然后可以重新添加到CS-FBS以测定他们的重新能力诗句或抢救入侵表型。此外，两个或更多的因素可以结合，以评估该添加剂或多种分子在驾驶或抑制侵袭协同效应。总体而言，该方法能够使研究者确定是否激素，细胞因子，和/或生长因子通过作为化学引诱物或侵入的抑制剂为特定类型的癌细胞的或特定的突变体在细胞侵袭的作用。通过识别特定的趋化因子和抑制剂，这个修改后的入侵检测可能有助于阐明信号通路，直接癌细胞侵袭。
Introduction
一种新颖的侵袭实验研制了具有确定具体激素，细胞因子和/或生长因子如癌细胞侵袭化学引诱物的参与的目标。肿瘤细胞侵入通过细胞外基质（ECM）的能力，是在转移表型1-3的一个标志。入侵室已被广泛用作体外的工具来研究癌细胞的侵袭和转移，并可以提供知识， 体内肿瘤的侵袭和转移的机制。 腔室包括嵌套细胞培养板的孔中的圆柱形的细胞培养插入物。插入件的底部是限定孔径的半透聚碳酸酯或聚苯乙烯膜。
在标准侵袭实验，将细胞接种到在插入膜用无血清培养基，并置于细胞培养孔被填充有血清或血清样化学引诱物送等了一个趋化的力量。移动至该力驱动细胞通过的半透膜（迁移）或可替代地，通过细胞外基质（侵入），然后可以使用常规的染料检测和定量细胞数染色的涂层。细胞数，然后根据迁移和侵袭的非侵入性的细胞系的范围内归一化。此方法允许研究者评估在各种条件，包括遗传操作不同类型的细胞的侵袭性潜力。
激素，细胞因子和生长因子是血清的关键组成部分，并越来越多地被示出为与驱动侵袭性表型4相关联。然而，在自然界，角色，和特异性这些趋化血清分子仍然介导入侵仍然无法实现。我们面临的挑战仍然是确定哪些具体因素血清或血清样趋化因子负责驾驶癌细胞侵袭以及什么分子可以抑制入侵过程。在这份报告中，我们描述了一种方法来评估潜在激素，细胞因子和/或血清中存在的生长因子的参与，如分子找到癌细胞的趋化和侵袭。
在此提出的改性协议，木炭剥离用于去除激素，细胞因子和生长因子，由2％胎牛血清（FBS），以产生2％的活性炭脱色的FBS（CS-FBS）。两个2％FBS和2％CS-FBS的被用作试剂来建立趋化力来驱动癌细胞侵袭。用2％CS-FBS的作为相比于正常的2％FBS的趋化剂能提供若干好处，包括第一，最突出的是，以研究在减少/相对缺乏激素，细胞因子和生长因子的癌症侵袭的表型的能力。它还使研究者评估是否集体去除激素，生长因子，以及CYtokines引起侵袭性指数的增加或减少。该测定然后设计，以确定是否增加一个单独的组件，被指定为“X”，可以抑制，减少，增加，或侵入索引恢复到原来的值（参见图2和3）。虽然这种方法是具体用于实现生理水平是从血清中木炭提除去的组件，还应当注意的是，木炭汽提也可以影响信号转导途径。例如，已经报道，木炭剥离能降低骨祖细胞的碱性磷酸酶活性，并通过减少MAPK活化剂5的诱导脂肪生成。木炭剥离介质是可商购，并且基于协议概述，结合木炭与葡聚糖和孵育胎牛血清O / N 6。
该测定是在respo开发NSE到报告的Zucker 等人 7的结果的作者证明朝向媒体与正常的2％FBS的迁移时的突变体的表型影响间隙连接通讯证明增加的侵袭索引。这一增长与活性炭处理血清替代被淘汰。从该结果中，作者得出结论认为，这种突变影响朝向亲脂性分子迁移（更具体地，激素，生长因子，细胞因子或）7。它公知的是激素，生长因子和细胞因子介导的信号参与肿瘤促进和侵入4通路。因此，对于科学调查，以确定哪些因子（S）的驱动的肿瘤侵袭其特定的癌细胞或突变体的研究之中是重要的。该试验的目的是为解决在其生理浓度各组分的作用，因为，根据该成分的浓度之间的差来确定与在正常的FBS和CS-FBS的X“;＃8220。通过此法的发展，研究人员可以更深入地了解具体的侵入途径管理他们的系统。
激素，生长因子，和细胞因子经常被归类为促癌8。其中的一些因素，如EGF被用作化学引诱物中浸润室9直接来源。因此，它很可能是这些代表了血清肿瘤直接侵犯的主要组成部分。该协议提出了一种简单的，但显著，修改现有的体外侵袭测定法，其允许研究者评估在介导癌细胞的侵袭性潜力激素，生长因子和细胞因子的参与。但是，在测定的目的是提供一个答案的研究者以过程是否将是有效的对他们的研究在分析的早期步骤，以免使用宝贵的时间而r物资跟不上，如果认为没有必要。此方法使用的CS-FBS和依赖于研究者酌情决定哪个分子追求铅候选潜在介导癌细胞侵袭。从这些分析的结果应该被证明在确定其中血清组分充当被研究的化学引诱物或抑制剂对特定细胞系或突变体是有用的。此外，这种方法可以帮助研究者确定主要的信号通路或者促进或抑制癌细胞侵袭;从而引导未来的药物设计。
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Protocol
1.准备不同的媒体和其他组件
- 事先进行实验，制备介质选自由DMEM或其他指定的介质中，并添加任一正常胎牛血清，木炭剥离的FBS，或木炭剥离的FBS加组件进行测试。需要注意的是多个组件可以在每个实验进行测试。
- 称出并稀释的激素，生长因子，细胞因子或适当地在生理浓度溶解在木炭脱色的血清。
2.准备胶原基质上的冰
- 制备2毫升胶原I基质中2.2毫克/毫升通过在冰上加入以下无菌过滤组件：加入200μl10倍的PBS（pH为7.4），5.4微升的1N NaOH，600微升双蒸H 2 O为和1.2毫升胶原I （在3.63毫克/毫升）。
- 保持胶原蛋白I溶液在冰上，直到准备板。
3.准备迁移/侵袭板用于分析</ P>
- 对于要测试的每个细胞系，使用一种24孔室板，其中12孔含有插入。使用额外的12个孔不含有插入用于将趋化介质和转印刀片为实验的设置。
注：在平板上用聚乙烯对苯二甲酸盐（PET）膜和8微米孔径胶原基质是最适合的细胞系用在这里。然而，在预涂板一个基质胶基质也可以取代的孔径根据细胞系被调查下降。 - 清楚地标注板，采用每条件3口井被分析（FBS迁移，CS-FBS迁移，FBS侵袭，而CS-FBS侵袭以及FBS迁移的控制，非侵入性的细胞系）。通过移动通孔运动中的PET膜，并测定侵袭通过胶原或基质胶基质，然后通过在所述膜孔测定迁移。使用不同的颜色标记为每个小区条件到标识在电镀过程。
4.分装的入侵矩阵
- 仔细吸取用于入侵检测75微升胶原基质溶液进入插入物。请小心，以避免气泡。通过将一个倒枪头表面驱散气泡。
- 该板用胶原涂覆的刀片转移到37℃和5％CO 2的培养箱中30分钟，使凝胶固化。
5.板上的细胞上膜或入侵矩阵
- 同时，trypsinize细胞和有10％FBS补充培养基。自旋细胞在200×g离心5分钟，在台式离心机和在无血清培养基冲洗3次。
- 重悬在无血清培养基。计数细胞用血细胞计数器或自动幻灯片计数器。添加无血清培养基以5×10 4个细胞/ ml的终浓度。
- 当胶原基质凝固（30分钟后），加入700μl的媒体无论是2％FBS的定义或活性炭处理的FBS到每个孔中。每盘12个刀片：
- 3插入有胶原蛋白和井媒体+ 2％FBS
- 3插入有胶原蛋白和井媒体+ 2％CS-FBS
- 3插入没有胶原蛋白和井媒体+ 2％FBS
- 3插入没有胶原蛋白和井媒体+ 2％CS-FBS
- 使用取决于被测试的因子的数目和与对应于每个状态的无胶原控制附加平板上。
- 添加细胞悬浮液的刀片以5×10 4个细胞/ ml，在所有的迁移和侵袭插入电镀每个刀片500微升的细胞。
- 孵育细胞22小时，在37℃。
6.量化迁移和侵入细胞的数量
- 使用甲醇固定液，曙红，和苏木，在分开的井孔中的设置染色。
- 用棉签从每孔除去细胞和基质。Rrepeat为每个井第二拭子应用。
- 用钳子，沾每次插入1秒5次到各3解决方案连续。
- 允许插入干O / N。
- 任我）去除过滤器，用手术刀，小心地切割周围的边缘，并安装在盖玻片和浸油的幻灯片，或ii）允许插入干O / N反转，直接使用插入显微镜。
- 第二天，查看幻灯片或插入与20X物镜的显微镜下，并采取5张从过滤器的不同区域。为了提高一致性，需要4外场和一个中心。
- 计数细胞用于使用ImageJ的软件的所有条件，并适用于下面的公式。
- 确定百分入侵如下：
平均＃细胞通过胶原侵入我插入=一
平均＃细胞通过控制插入的迁移= B
％入侵=（A / B）×100 - 确定入侵指数在2％FBS如下：
％侵袭细胞被测定（在2％FBS）= C
％侵袭控制非侵入细胞（2％FBS）= D
浸润指数（FBS）=（C / D） - 确定入侵指数在2％CS-FBS如下：
％侵袭的细胞被检测（在2％CS-FBS）= E
％入侵控制非侵入性的细胞（2％CS-FBS）的= F
入侵指数（CS-FBS）=（E / F）
7.重复实验协议比较活性炭处理FBS为活性炭处理FBS + X n，其中多因素综合
- 如使用不同的组件为“X”或组分的组合需要重复该过程多次。
- 应用计算，以确定各因素“X”的迁移和侵袭影响的贡献。
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Representative Results
入侵指数是根据归一化，以一种非侵入性的细胞系计算每个条件。对于我们的实验中，我们使用1205LU黑素瘤细胞系，建立了变体的稳定细胞株作为我们的侵入线以及癌前无创变型中，WM793从中1205LU细胞衍生10用作一个逻辑控制。我们还利用I型胶原作为基质侵入，因为这是真皮的主要成分。这是根据先前的研究，从而最优侵袭基质变化的基础上的细胞系和一致性的与体内的程度的结果11。这种侵袭实验是根据可能的结果研究者可能获得所概述示意。最初，为2％FBS的侵袭指数应该比为CS-FBS的侵袭指数显著更高或更低，以便对本测定法（ 图1和2）。如果显著增量缓和或减少入侵指数与活性炭处理的FBS明显看出，该测定是不是为研究者（ 图2和3）是有用的。如果此增加与活性炭处理的FBS消除，研究者已经具有增强的入侵朝向激素，生长因子，或细胞因子（ 图2和3）的知识。然后，研究者必须利用有关特定肿瘤类型和变异，以确定哪些候选人（S）目前可行的机制趋化因子的信息。研究者可以开始通过尝试的一个或几个部件分别在生理浓度通过添加成分在2％FBS和2％CS-FBS的（ 表1）的浓度差。如果一个组件加入到活性炭处理血清显著增加降低入侵潜力相比单独的木炭脱色的血清，即候补中，“X”，可以作为一个部分或完整救助者取决于增加的程度（ 图2和3）。两个或多个部件可以被组合以实现一种添加剂或协同增加，（表示为X 1 + X 2 + X 3 ...）（ 图3）。一个因素这降低侵袭的程度将被分类为抑制因子（ 图2 - 4）。在我们的实验中，我们发现，使用突变体黑素瘤细胞系（1205LU T154A）朝向与其激素，生长因子，细胞因子和除去的趋化迁移的造成的肿瘤的侵袭性的降低。三种激素进行了测试，以确定一个可能的“X”。这些包括雌激素（雌二醇），孕激素和甲状腺激素（T 4）。两个这些激素对入侵指数（孕酮和甲状腺激素）没有任何影响，而雌激素被确定为抑制因子（ 图4）。据中列出的可能结果图3中，本例中的实验结果表明，减少与条件2和抑制与状态3.它是可能的雌激素会进一步在该试验中使用的，因为它可能在通路的识别该螯合某些信令因素重要对于未来的药物设计策略。另外的实验将在生长因子和细胞因子被引导，以确定可作为“表型的救援”亲入侵化学引诱物的其他成分。这两个亲侵入和抑制分子的识别可共同阐明侵入潜力调查的细胞系和突变的变种。
图1.实验装置和设计。模型的建立起来用于实验的过程表示细胞铺板要么到直接在PET膜或的Collagen层在无血清培养基。这些细胞要么迁移或通过胶原基质向其中按照协议修改，并描述为条件1，2趋化入侵，然后3.迁移或侵入细胞固定和染色。 请点击此处查看大图版本这个数字。
图从一个标准的入侵检测膜结果2，潜在的结果。这种模型表明潜在的结果，该调查可能会遇到的入侵检测以及如何解释这些结果。每个圆圈是一个代表性的结果为使用相同的3个条件一个染色滤波器被图1中所概述。每个点代表通过入侵已经通过的小区矩阵和彩色在膜的底部。这些细胞会进行适当量化，并据此进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.数据解释的入侵与CS-FBS±X.本纲要描述了入侵指数的计算，如何确定实验的结论。 CS-FBS的是木炭脱色的血清和X是指加入到文中所述的CS-FBS的介质的各个组件。作者设定的标准偏差（SD）作为接受变异由于在我们的条件下的实验误差。但是，根据被观察的条件和重复的次数，这个因子可以调整，以成为统制的范围内iCal的意义的调查。该实验可以重复使用多个“X”分子，（记为X 1 + X 2 + X 3 ...）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.侵袭测定的结果。该图描绘了使用从1205LU转移性黑素瘤细胞建立了一个突变体变体的细胞系3时所得到的实验结果。是添加的激素的浓度如下：雌激素（0.566微克/毫升），孕激素（0.001纳克/毫升），甲状腺激素（0.283微克/分升）。用于这些实验的对照，非侵入性的细胞系WM793B。此实验重复3次，具有相似的结果，并有代表性的曲线图被示出。
FBS猫＃16000
CS FBS猫＃12676
CS FBS猫＃SH30068
表中的选择激素，生长因子和细胞因子在牛和人血清的浓度范围1。实施例2％FBS和2％CS-FBS的之间的浓度差表示添加以达到生理浓度的量。
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Discussion
肿瘤转移是一个多步骤的过程。细胞必须通过基底膜断裂，intravasate成要么淋巴系统或血液微血管，它们被运到远处位点。肿瘤细胞然后外渗和移成macrometastasis 12。通过上皮间质转化（EMT），肿瘤侵袭和转移的进展已增强了类固醇激素13,14，生长因子15-18和细胞因子19-21。这些分子是如此关键，解决肿瘤进展的信号通路，即化验的发展，以解决他们在肿瘤侵入的潜在作用是对破译复杂的信号通路中的重要一步。
用活性炭处理血清的该测定具有比现有的方法的一个优点，因为它的目的是确定要向其肿瘤细胞迁移的驱动力。先前试剂盒使用正常的原发性乳腺癌成纤维细胞浸润室已经出版。在这项研究中，作者使用活性炭处理的媒体和在基质胶室其中没有造成侵如预期，因为细胞不会致瘤性加回雌激素。然而，在存在或不存在雌激素的巨噬细胞条件培养基的存在下显著和类似的程度22增加的侵袭。而该测定是相似，它用于入侵检测与在不存在或雌激素的存在木炭脱色的血清，这不是一个肿瘤测定，并针对巨噬细胞和成纤维细胞22之间的旁分泌相互作用的研究。用活性炭处理媒体另一个检测，以表明加入雌激素水平低的增加乳腺癌细胞的增殖而引起的耐激酶抑制剂23。我们的研究中是独一无二的，因为它适用于各种类型的癌细胞的设计来研究的侵袭测定个别激素，生长因子和细胞因子可以单独或组合的效果。此外，受现有文献，我们已经确定需要激素的浓度添加到活性炭处理血清以达到生理相关水平（ 表1）。在加入在通常存在于血清中的各个组件中，“X”是该测定的一个重要参数。而该测定可能似乎由激素，生长因子，和细胞因子在血清中的水平出版的限制，研究者可以使用ELISA测定来确定的其他因素的水平。
而该协议是专用于使用I型胶原，基质胶也可以，如果研究者已使用矩阵始终被取代。我们优选使用胶原蛋白I的原因是因为它是被定义的单个组分和是真皮的主要成分。此外，我们使用75微升100μ克/ ml的胶原蛋白，以使侵入基质。这也可以被修改，以达到预期的效果。最好是，以优化的浓度，使细胞的合理数量可以在过滤器上进行计数。如果细胞是高度侵入性的，这可能是最好使用100微升的胶原蛋白I的矩阵或增加的胶原蛋白的浓度。虽然这一技术有助于研究者获得的重要信息，如果肿瘤细胞侵入朝其由血清的木炭提除去一个趋化它才有用。如果有结果的控制和活性炭处理的血清之间没有区别，那么检测就不值得追求。该法还解决了结果个体趋化因子和趋化的抑制。此外，在可能的结果（ 图3）的比较，我们使用标准偏差作为接受实验误差的每个实验的水平。然而，实际的VAL的UE可以通过基于标准偏差或标准误差和显著的p值的调查来确定。
而且，从该测定收集的信息可以证明在药理学抑制剂的设计，以一定的信号通路是有用的。例如，如果一种或多种激素，生长因子，和/或细胞因子被发现牵连入侵机制对特定的肿瘤细胞变异，比现有的药理剂可用于或一种新的药物设计来抑制该途径。该试验也是一种有效的工具，用于研究特定的肿瘤突变，以及是否改变氨基酸残基或它的位置保持相同的亲和力是通过该测定确定了的趋化。以这种方式，我们的测定法提供了一种新的方法，以提供线索，癌细胞以及可能的方法，以防止肿瘤侵袭的入侵机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
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