Abstract
סרום דם משמש כchemoattractant כיוון שתאי הסרטן להגר ולפלוש, להקל intravasation לmicrovessels. עם זאת, המולקולות בפועל כיוון שבו התאים לנדוד להישאר חמקמקות. assay פלישה שונה זו פותח כדי לזהות מטרות שנוהגות נדידת תאים ופלישה. טכניקה זו משווה את מדד הפלישה תחת שלושה תנאים כדי לקבוע אם הורמון מסוים, גורם גדילה, או ציטוקינים משחק תפקיד בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. תנאים אלה כוללים אני) בסרום שור עוברי נורמלי (FBS), ii)-הפשיט פחם FBS (CS-FBS), אשר מסיר הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים וiii) מולקולת CS-FBS + (מסומן "X"). שינוי משמעותי בפלישת תא עם CS-FBS בהשוואה לFBS, מצביע על מעורבותם של הורמונים, ציטוקינים או גורמי גדילה בתיווך השינוי. אז יכולות להיות הוסיפו בחזרה מולקולות בודדות לCS-FBS לassay יכולתם מחדשפסוק או להציל את הפנוטיפ הפלישה. יתר על כן, ניתן לשלב שתיים או יותר גורמים כדי להעריך את התוסף או תופעות סינרגיסטי של מולקולות רבות בנהיגה או עיכוב פלישה. בסך הכל, בשיטה זו מאפשרת לחוקר כדי לקבוע אם הורמונים, ציטוקינים, ואו גורמי גדילה / לשחק תפקיד בפלישת תא על ידי המשרת כchemoattractants או מעכבים של פלישה לסוג מסוים של תאי סרטן או מוטציה ספציפית. על ידי זיהוי chemoattractants ומעכבים ספציפיים, assay הפלישה שונה זה עשוי לעזור להבהיר מסלולי איתות המכוונים את פלישת תאי הסרטן.
Introduction
Assay פלישת רומן פותח במטרה לזהות את מעורבותם של הורמונים מסוימים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה כchemoattractants בפלישת תאי סרטן. היכולת של תאים סרטניים לפלוש דרך המטריצה תאית (ECM) היא סימן היכר של פנוטיפ גרורתי 1-3. תאי פלישה נעשו שימוש נרחב כמו במבחנה כלים ללמוד פלישת תאי סרטן והגירה ועשויים לספק ידע באשר למנגנוני in vivo פלישת גידול וגרור. התאים מורכבים מהתרבות מוסיף תא גלילי קיננו בתוך הבארות של צלחות תרבית תאים. התחתיות מוסיף הן קרומי פוליקרבונט או קלקר חדיר למחצה של גודל נקבובית מוגדר.
בassay הפלישה הסטנדרטי, תאים הם זורעים על הממברנה להכניס את עם תקשורת חופשית בסרום והניחו לתוך בארות תרבית תאים שמלאות בchemoattractants סרום או כמו סרום-ליםet עד כוח chemoattractive. תאי כונני הכוח הזה כדי לנוע בקרום חדיר למחצה (ההגירה) או לחלופין, באמצעות ציפוי של מטריצה תאית (פלישה), אז מה שיכול להיות מוכתמת באמצעות צבעים קונבנציונליים כדי לזהות ולכמת את מספר התאים. מספר התא אז מנורמל לפי העומק של הגירה ופלישה בשורת תאים לא פולשנית. שיטה זו מאפשרת לחוקר להעריך את הפוטנציאל פולשני של סוגי תאים שונים תחת מגוון רחב של תנאים, כוללים מניפולציות גנטיות.
הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה הם רכיבים קריטיים של סרום ויותר ויותר במוצגים להיות קשורים לנהיגת פנוטיפ פולשני 4. עם זאת, הטבע, התפקיד, וספציפיות של מולקולות סרום chemoattractive אלה בתיווך פלישה עדיין להישאר חמקמקים. האתגר נשאר כדי לקבוע מה ספציפי גורמים בchemoattractants סרום או כמו סרום-הם אחראים לנהיגהפלישת סרטן תאים, כמו גם את מה שמולקולות עלולות לעכב את תהליך הפלישה. בדוח זה, אנו מתארים שיטה להעריך את המעורבות האפשרית של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי צמיחה הנוכחיים בסרום, כמו מולקולות הנהיגה chemoattraction והפלישה של תאים סרטניים.
בהציע פרוטוקול שונה זו, הפשטת פחם משמשת כדי להסיר הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה מסרום 2% שור עוברי (FBS) כדי ליצור FBS פחם 2% הפשיט (CS-FBS). שני 2% FBS ו -2% CS-FBS משמשים כסוכנים להקים כוח chemoattractive לנהוג פלישת תאי סרטן. באמצעות 2% CS-FBS כסוכן chemoattractive בהשוואה ל -2% FBS הרגיל מעניק מספר יתרונות הכוללים ראשון, ובולט ביותר, היכולת ללמוד את הפנוטיפ פלישת הסרטן בהעדר המופחת / היחסי של הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה. הוא גם מאפשר לחוקר להעריך אם ההסרה הקולקטיבית של הורמונים, גורמי גדילה, וCYtokines גורם לעלייה או ירידה במדד פולשנית. Assay לאחר מכן נועד לקבוע אם התוספת של רכיב בודד, המיועד כ" X "יכולה לעכב, ירידה, עלייה, או לשחזר את המדד פולשנית לערכו המקורי (ראה איורים 2 ו -3). למרות שמתודולוגיה זו היא ספציפית להשגת הרמות הפיזיולוגיות של הרכיב שהוסר מהסרום במהלך הפשטת פחם, זה צריך להיות גם ציין כי הפשטת פחם יכולה להשפיע גם על מסלולי העברת אותות. לדוגמא, זה כבר דווח כי הפשטת פחם יכולה להפחית את פעילות phosphatase אלקליין של תאי osteoprogenitor ולגרום adipogenesis באמצעות הפחתה של מפעילי MAPK 5. תקשורת הפשיטה פחם היא זמינה באופן מסחרי, ומבוססות על הפרוטוקול שתוארה המשלב פחם עם dextran וטופחו עם O בסרום שור עוברי / N 6.
assay זו פותח בrespoNSE לתוצאה שדווחה על ידי צוקר et al. 7 המחברים הוכיחו כי פנוטיפ מוטנטי משפיע תקשורת צומת הפער הפגין עליית מדד הפלישה בעת העברה לתקשורת עם FBS 2% נורמלים. עלייה זו בוטלה עם ההחלפה של סרום-הפשיט פחם. מתוצאה זו, החוקרים הסיקו כי הגירה מושפעת זה מוטציה למולקולת lipophilic (לייתר דיוק, הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים) 7. זה ידוע היטב כי הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לתווך מסלולי איתות מעורבים בקידום גידול ופלישה 4. לפיכך, חשוב לחוקרים מדעיים כדי לקבוע מה גורם (ים) נוהג פלישת הגידול של תאי הסרטן המסוים שלהם או מוטציות תחת מחקר. Assay נועד לעסוק בתפקיד של רכיבים בודדים בריכוז הפיזיולוגי שלהם, כפי שנקבע על פי ההפרש בין הריכוז של הרכיב ו# 8220; X "בFBS הנורמלי וCS-FBS. באמצעות הפיתוח של assay זה, חוקרים יכולים להשיג תובנה רבה יותר על המסלול פולשנית הספציפי המסדירים את המערכת שלהם.
הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לעתים קרובות סווגו כמקדמי גידול 8. חלק מגורמים אלה כמו EGF משמש כמקורות ישירים לchemoattractants בתאי פלישה 9. לפיכך, סביר להניח כי אלה מייצגים את המרכיבים העיקריים של הסרום שפלישת גידול ישיר. פרוטוקול זה מציע פשוט, אך משמעותי, שינוי במבחנת assay הפלישה הקונבנציונלי המאפשר חוקר להעריך את מעורבותם של הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. עם זאת, assay נועד לספק החוקר עם תשובה באשר לשאלה האם ההליך יהיה יעיל למחקר שלהם בכל צעד בתחילת הניתוח, כדי שלא לנצל את הזמן וr יקריםesources אם כמיותר. שיטה זו משתמשת CS-FBS והוא מסתמך על שיקול דעתו החוקרים שכמולקולות להמשיך כמועמדים מובילים שפוטנציאל לתווך פלישת תאי הסרטן. התוצאות מניתוחים אלו צריכים להוכיח להיות שימושיים בזיהוי רכיבי שסרום לשמש chemoattractants או מעכבים עבור קו תא המסוים או מוטציה הנלמד. בנוסף, גישה זו עשויה לעזור לחוקר לזהות מסלולי איתות מפתח או קידום או עיכוב פלישת תאים סרטניים; כך מכוון את עיצוב סמים עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכין את אמצעי התקשורת שונה ורכיבים נוספים
- לפני הניסוי, להכין תקשורת בהיקף של DMEM או מדיה אחרת שצוינה בתוספת או FBS הנורמלי, הפחם הפשיט FBS, או FBS פחם הופשט בתוספת הרכיב להיבדק. שימו לב שניתן לבדוק רכיבים מרובים בכל ניסוי.
- לשקול את ולדלל את ההורמונים, גורמי גדילה, או ציטוקינים כראוי להיות מומסים בסרום הפחם הופשט בריכוז הפיזיולוגי.
2. מכין את מטריקס קולגן על קרח
- להכין 2 מיליליטר קולגן אני מטריקס ב -2.2 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת הרכיבים המסוננים סטרילי הבאים על קרח: 200 10x μl PBS (pH 7.4), 5.4 μl 1 N NaOH, 600 μl של H 2 O מזוקק פעמיים, ואני 1.2 מיליליטר קולגן (ב3.63 מ"ג / מיליליטר).
- שמור לי פתרון קולגן על קרח עד מוכן לצלחת.
3. להכין צלחות הגירה / פלישה לAssay </ P>
- עבור כל קו תא להיבדק, להשתמש צלחת תא 24 גם אחד שבו 12 בארות להכיל מוסיף. השתמש 12 בארות נוספות שאינו מכילות מוסיף להוספת תקשורת chemoattractant והעברת ההכנסות לקבוצת הניסיון.
הערה: מטריצת קולגן על צלחות עם קרום teraphthalate פוליאתילן (PET) וגודל נקבובית 8 מיקרומטר היא אופטימלית לשורות התאים להשתמש כאן. עם זאת, מטריצת matrigel בצלחות Precoated יכולה גם להחליף עם הגודל הנקבובית ירד בהתאם לשורת התאים נחקרת. - ברור לתייג את הצלחת, באמצעות 3 בארות לכל מצב להיות מנותחות (הגירת FBS, הגירת CS-FBS, פלישת FBS, ופלישת CS-FBS כמו גם FBS הגירה לשליטה, שורת תאים לא פולשנית). הגירת assay על ידי תנועה דרך נקבוביות בקרום PET, ופלישת assay על ידי תנועה באמצעות מטריצת קולגן או matrigel ולאחר מכן דרך נקבוביות בקרום. השתמש בסמני צבע שונים לכל מצב תא לid בתהליך הציפוי.
4. לוותר מטריקס הפלישה
- בזהירות פיפטה 75 μl של פתרון מטריצת קולגן למוסיף לשמש למבחני פלישה. השתמש בזהירות כדי למנוע בועות. לפזר בועות על ידי יישום קצה פיפטה הפוך אל פני השטח.
- העבר את הצלחת עם מוסיף מצופה קולגן ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות כדי לאפשר ג'ל כדי לחזק.
5. פלייט התאים על גבי ממברנה או הפלישה מטריקס
- בינתיים, trypsinize תאים ולהוסיף מדיה עם 10% FBS. תאי ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על צנטריפוגה בראש הטבלה ולשטוף 3x בתקשורת חופשית בסרום.
- גלול בתקשורת חופשית בסרום. ספירת תאים עם hemocytometer או נגד שקופיות אוטומטיות. הוסף מדיה סרום ללא לריכוז סופי של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר.
- כאשר מטריצת קולגן יש הקרושה (לאחר 30 דקות), להוסיף 700 μl של תקשורת עם או2% FBS מוגדר או פחם-הפשיט FBS היטב כל אחד. של 12 מוסיף לכל צלחת:
- יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS
- יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS
- יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS
- יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS
- להשתמש בצלחות נוספות בהתאם למספר גורמים הנבדקים ועם שליטה לא קולגן המתאים לכל מצב.
- הוסף השעיה תא למוסיף בשעה 5 x 10 4 תאים / מיליליטר, ציפוי 500 תאי μl לכל כנס בכל מוסיף ההגירה ופלישה.
- דגירה התאים במשך 22 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
6. לכמת את מספר הנודד ותאים פולשים
- צביעת הגדר של בארות באמצעות מקבע מתנול, eosin, וhemotoxylin, בבארות נפרדות.
- השתמש בצמר גפן כדי להסיר תאים ומטריצה מכל טוב.Rrepeat עם יישום ספוגית שני לכל אחד.
- עם מלקחיים, לטבול להכניס כל אחד 5 פעמים 1 שניות לכל אחד מהפתרונים 3 ברציפות.
- לאפשר מוסיף לייבוש O / N.
- כך או i) להסיר את המסננים עם אזמל, החיתוך בזהירות מסביב לקצוות ולעלות בשקופית עם שמן coverslip וטבילה, או ii) תאפשר מוסיף לייבוש O / N ההפוך ולהשתמש במוסיף ישירות למיקרוסקופיה.
- למחרת, להציג שקופיות או מוסיף תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X ולקחת 5 תמונות מאזורים שונים של המסנן. כדי לשפר את העקביות, לקחת 4 שדות חיצוניים ומרכז אחד.
- ספירת תאים לכל תנאי שימוש בתוכנת ImageJ ואחול על נוסחות להלן.
- לקבוע את פלישת אחוזים כדלקמן:
אומר # תאים הפולשים באמצעות קולגן אני מכניס =
אומר # של תאים הנודדים דרך להכניס שליטה = b
פלישת% = (a / b) * 100 - לקבוע מדד הפלישה ב 2% FBS כדלקמן:
פלישת% מתאים שassayed (ב 2% FBS) = ג
% פלישה של תאים לא פולשנית שליטה ב( 2% FBS) = d
הפלישה Index (FBS) = (ג / ד) - לקבוע מדד הפלישה ב 2% CS-FBS כדלקמן:
פלישת% מתאים שassayed (ב 2% CS-FBS) = e
פלישת% מתאים לא פולשנית שליטה ב( 2% CS-FBS) = f
הפלישה Index (CS-FBS) = (ה / ו)
7. חזור על הפרוטוקול ניסויי השוואה-הפשיט פחם FBS לFBS הפשיט פחם + X n עם גורמים מרובים משולבים
- חזור על התהליך מספר פעמים לפי הצורך תוך שימוש ברכיבים שונים עבור "X" או שילוב של רכיבים.
- החל החישובים כדי לקבוע את תרומתו של כל "X" גורם לתופעות הגירה ופלישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדד הפלישה מחושב עבור כל תנאי לפי נורמליזציה לשורת תאים לא פולשנית. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו 1205Lu תא מלנומה ושורות תאי יציבות גרסה הוקמה כקווים פולשנית שלנו, כמו גם את הגרסה טרום לא פולשנית, WM793 ממנו התאים 1205Lu נגזרו 10 המשמשים כבקרה לוגית. גם אנו מנצלים אני קולגן כמטריצת הפלישה משום שהוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. זה בהתאם למחקר קודם לפי מטריצת הפלישה האופטימלית משתנית בהתאם לקו התא ועם in vivo מידת ההתאמה תוצאות 11. assay פלישה זו מתואר באופן סכמטי על פי התוצאות אפשרי החוקר יכול להשיג. בתחילה, מדד הפלישה לFBS 2% צריך להיות גבוה יותר באופן משמעותי או נמוך ממדד הפלישה לCS-FBS כדי להמשיך assay זה (איורים 1 ו -2). אם אינקר משמעותילהקל או ירידה במדד הפלישה היא לכאורה עם FBS-הפשיט פחם, assay זה לא שימושי לחוקר (איורים 2 ו -3). אם עלייה זו בוטלה עם FBS-הפשיט פחם, החוקר כבר יש את הידע שהפלישה המשופרת היא מכוונת כלפי הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים (איורים 2 ו -3). לאחר מכן, החוקר חייב לנצל מידע על סוג הגידול הספציפי ומוטציה כדי לקבוע איזה מועמד (ים) מתקבלים על הדעת מנגנונים נוכחי כchemoattractants. החוקר יכול להתחיל בכך שניסה רכיב אחד או כמה בנפרד בריכוז הפיזיולוגי על ידי הוספת הרכיב בהבדל הריכוז בין 2% FBS ו -2% CS-FBS (טבלת 1). אם רכיב יתווסף לסרום-הפשיט פחם מגביר באופן משמעותי ממקטין את פוטנציאל הפלישה לעומת הסרום-הפשיט פחם לבד, מועמד ש, "X", עשוי לשמש כחלקי אומציל מלא בהתאם ל( איורים 2 ו -3) במידה של עלייה. ניתן לשלב שני רכיבים או יותר על מנת להשיג גידול תוסף או סינרגיסטי, (מסומן כX 1 + X 2 + X 3 ...) (איור 3). גורם אשר מקטין את היקף הפלישה יסווג כגורם מעכב (איורים 2-4). בניסויים שלנו, שהראינו כי השימוש בקו מוטציה תא מלנומה (T154A 1205Lu) נודד לכיוון chemoattractant עם ההורמונים שלה, גורמי גדילה, וציטוקינים הוסרו גרם לירידה בהפולשנות גידול. שלושה הורמונים נבדקו לזהות "X" אפשרי. אלה כוללים אסטרוגן (אסטרדיול), פרוגסטרון, הורמון בלוטת התריס ו( T4). שני הורמונים אלה לא היו השפעה על מדד הפלישה (פרוגסטרון והורמון בלוטת התריס), ואילו אסטרוגן זוהה כגורם מעכב ב( איור 4). על פי התוצאות האפשריות מופיעות באיור 3, את תוצאות הניסוי בדוגמא זו מדגים ירידה במצב 2 ועיכוב במצב 3. סביר להניח כי אסטרוגן ישמש עוד בassay זה, שכן הוא עשוי להיות חשוב בזיהוי של מסלולים שלעקל גורמי איתות מסוימים לאסטרטגיות עיצוב סמים עתיד. ניסויים נוספים יופנו בגורמי גדילה וציטוקינים לזהות רכיבים אחרים שעשויים לשמש כchemoattractants פרו-פלישה "הצלת פנוטיפ". זיהוי של שני מולקולות פרו-פולשני והמעכבים עשוי קולקטיבי להבהיר את הפוטנציאל פולשני לשורות תאים וגרסאות מוטציה תחת חקירה.
איור 1. התקנה ניסיונית ועיצוב. דגם של להגדיר עבור ניסיוני התהליך מראה תאים מצופים או על הממברנה PET ישירות או גשכבת ollagen תקשורת חופשית בסרום. התאים נודדים או או פולש באמצעות מטריצת קולגן כלפי chemoattractant ששונה בהתאם לפרוטוקול וכפי שתואר תנאי 1, 2, ולאחר מכן 3. התאים שהועברו או פלשו קבועים ומוכתמים. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.
איור 2. תוצאות אפשריות מתוצאת קרום אחד סטנדרטית assay הפלישה. מודל זה מדגים את התוצאות הפוטנציאליות שהחוקר עלול להיתקל עבור assay הפלישה וכיצד לפרש את התוצאות הללו. כל מעגל הוא תוצאת נציג למסנן מוכתם באמצעות אותו 3 התנאים המפורטים באיור 1. כל נקודה מייצגת תא שעבר דרך הפלישהמטריקס ומוכתם בתחתית הקרום. התאים היו לכמת כראוי ונותחו בהתאם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרשנות נתונים איור 3. לפלישה עם CS-FBS ± X. מתווה זה מתארת כיצד החישובים של מדד הפלישה לקבוע מסקנות ניסוי. CS-FBS הוא הסרום-הפשיט הפחם וX מתייחס לרכיבים הבודדים נוספו תקשורת CS-FBS המתואר בטקסט. המחברים להגדיר את סטיית התקן (SD) כהשתנות התקבלו בשל שגיאה ניסיונית בתנאים שלנו. עם זאת, בהתאם לתנאי תצפית ומספר החזרות, גורם זה יכול להיות מותאם כדי להיות בטווח של ממלכתימשמעות iCal לחוקר. הניסוי ניתן לחזור עם מולקולות "X" מרובות, (מסומן כX 1 + X 2 + X 3 ...). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תוצאות assay פלישה. גרף מתאר את תוצאות הניסוי הושגו בעת השימוש בקו תא גרסת מוטציה 3 הוקמו מהתאים מלנומה גרורתית 1205Lu. הריכוזים של ההורמונים הוסיפו הם כדלקמן: אסטרוגן (.566 pg / ml), פרוגסטרון (מיליליטר / 0.001 ng), הורמון בלוטת התריס (0.283 מיקרוגרם / dl). השליטה, שורת התאים לא פולשנית המשמשת לניסויים אלה הייתה WM793B. ניסוי זה חזר על עצמו 3 פעמים עם תוצאות דומות, וגרף נציג מוצג.
# חתול FBS 16000
cs FBS # חתול 12,676
# חתול SH30068 cs FBS
טבלה 1. דוגמאות לטווחי ריכוז של הורמונים בחרו, גורמי גדילה וציטוקינים בשור וסרום אנושי. ההבדל בין הריכוז FBS 2% ו -2% CS-FBS מייצג את הסכום נוסף להשגת ריכוזים פיסיולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גרורות סרטנית היא תהליך רב שלבי. התאים חייבים לפרוץ את הקרום במרתף, intravasate לmicrovessels או מערכת הלימפה או הדם, שבו הם מועברים לאתרים מרוחקים. תאי הגידול אז extravasate וליישב לmacrometastasis 12. התקדמות דרך אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), פלישת גידול, וגרורות שופרה על ידי הורמוני סטרואידי 13,14, צמיחת גורמי 15-18, וציטוקינים 19-21. מולקולות אלה הן כל כך קריטיות לטיפול במסלול האיתות של התקדמות גידול, כי הפיתוח של assay כדי לטפל בתפקידם בפוטנציאל גידול הוא חודרני צעד חשוב לקראת פענוח מסלולי איתות המורכבים.
assay זה של שימוש בסרום-הפשיט פחם יש יתרון על פני שיטות קיימות, מאחר שמטרתו לזהות את הכוח המניע שלגידול תאים נודדים. יש assay קודםפורסם באמצעות fibroblasts שד ראשוני הנורמלי בתאי פלישה. במחקר זה, החוקרים השתמשו בתקשורת-הפשיט פחם והוסיפו בחזרה אסטרוגן בתאי matrigel שלא גרם לפלישה כצפוי מאז התאים לא היו סרטניים. עם זאת, הנוכחות של תקשורת ממוזגת מקרופאג בנוכחותו או היעדריו של אסטרוגן מוגבר פלישה באופן משמעותי ולמידה דומה 22. בעוד assay זה היה דומה שהיא משמשת מבחני פלישה עם סרום-הפשיט פחם בהעדר או הנוכחות של אסטרוגן, זה לא היה assay גידול והופנה לחקר אינטראקציות אוטוקריני בין מקרופאגים וfibroblasts 22. assay נוסף המשמש תקשורת-הפשיט פחם להראות כי התוספת של רמות נמוכות של אסטרוגן הגדילה את ההתפשטות של תאי סרטן השד, אך גרמה להתנגדות לkinase מעכבים 23. המחקר שלנו הוא ייחודי בכך שהוא assay פלישה החל על סוגים שונים של תאי סרטן שנועדו ללמודהשפעה של הורמוני פרט, גורמי גדילה, וציטוקינים לבד או בשילוב. יתר על כן, בכפוף לספרות זמינה, קבעו הריכוזים של הורמון צורך להוסיף לסרום-הפשיט פחם כדי להשיג רמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (טבלה 1). התוספת של הרכיב הבודד, "X" ברמות הנוכחיות בסרום היא פרמטר קריטי של assay. בעוד assay זה אולי נראה להיות מוגבל על ידי הרמות של הורמונים שפורסמו, גורמי גדילה, וציטוקינים בסרום, החוקר יכול להשתמש במבחני ELISA כדי לקבוע את הרמות של גורמים נוספים.
בעוד הפרוטוקול הוא ספציפי לשימוש אני קולגן, matrigel יכול גם להחליף אם החוקר השתמש מטריצת שאופן עקבי. הסיבה שאנחנו מעדיפים להשתמש אני קולגן היא כי זה הוא מרכיב יחיד שמוגדר והוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. בנוסף, אנו משתמשים 75 μl של 100 μg / ml קולגן כדי להפוך את מטריצת הפלישה. זה גם יכול להיות שונה כדי להשיג את התוצאות הרצויות. זה הכי טוב כדי לייעל את הריכוז כדי שמספר סביר של תאים ניתן לספור על המסננים. אם התאים פולשניים מאוד, זה יכול להיות טוב יותר לשימוש שלי קולגן 100 μl למטריצה או להגדיל את ריכוז קולגן. אמנם שיטה זו עשויה לסייע לחוקר לקבל מידע חשוב, זה שימושי רק אם תאי גידולים פולשים לchemoattractant שהוסר על ידי הפחם-ההפשטה של הסרום. אם אין הבדל בין התוצאות עבור שליטה וסרום-הפשיט פחם, אז assay לא יהיה שווה להשקיע. Assay מתייחס גם לתוצאות לchemoattractants בודד, כמו גם מדכאי של chemotaxis. יתר על כן, בהשוואה של תוצאות אפשריות (איור 3), השתמשנו בסטיית התקן ככל שרמת שגיאה ניסיונית מקובלת עבור כל ניסוי. עם זאת, בפועל values יכול להיקבע על ידי החוקר המבוסס על סטיית התקן או שגיאה סטנדרטית וערך p משמעותי.
יתר על כן, המידע שלקט מassay זה יכול להיות שימושי בעיצוב של מעכבים תרופתיים למסלולי איתות מסוימים. לדוגמא, אם אחד או יותר הורמונים, גורמי גדילה, ו / או ציטוקינים יימצא מעורב במנגנון הפלישה למוטצית תאים סרטניים מסוימת, שאינו סוכן הקיים תרופתי יכול לשמש או תרופה חדשה שנועדה לעכב אותו מסלול. Assay הוא גם כלי יעיל ללימוד המוטציה גידול המסוימת והאם לשנות את שאריות חומצת אמינו או את עמדתה שומרת על אותה הזיקה לchemoattractant שזוהה על ידי assay זה. בדרך זו, assay שלנו מציע גישה חדשנית כדי לספק רמזים לגבי מנגנון הפלישה של תאים סרטניים ואולי שיטות למניעת פלישת גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
