Abstract
O soro sangüíneo serve como um chemoattractant para o qual as células cancerosas migrar e invadir, facilitando a sua intravasation em microvasos. No entanto, as moléculas de reais para o qual as células migram permanecem ainda desconhecidos. Este ensaio de invasão modificado tem sido desenvolvido para identificar alvos que conduzem a migração celular e invasão. Esta técnica compara o índice de invasão sob três condições para determinar se uma hormona específica, o factor de crescimento ou citoquina desempenha um papel na mediação do potencial invasivo de uma célula de cancro. Estas condições incluem i) soro de bovino fetal normal (FBS), ii) separado com carvão activado FBS (CS-FBS), que remove as hormonas, factores de crescimento e citoquinas e iii) CS-FBS + molécula (designada por "X"). Uma alteração significativa na invasão de células com CS-FBS em comparação com FBS, indica o envolvimento de hormonas, citoquinas ou factores de crescimento na mediação da mudança. Moléculas individuais podem então ser adicionado de volta ao CS-FBS para testar a sua capacidade de reverso ou resgatar o fenótipo invasão. Além disso, dois ou mais factores podem ser combinados para avaliar o efeito aditivo ou sinérgico de múltiplas moléculas de condução ou inibir a invasão. Em geral, este método permite ao investigador para determinar se hormonas, citoquinas, e / ou os factores de crescimento desempenham um papel na invasão de células por servir como quimioatractores ou inibidores de invasão para um tipo particular de célula de cancro ou um mutante específico. Através da identificação de agentes quimioatractivos e inibidores específicos, este ensaio de invasão modificado pode ajudar a elucidar as vias de sinalização que dirigem a invasão de células de cancro.
Introduction
Um ensaio de invasão novo foi desenvolvido com o objectivo de identificar o envolvimento de hormonas específicas, citoquinas e / ou factores de crescimento como quimioatractores na invasão de células de cancro. A capacidade de células tumorais para invadir através da matriz extracelular (ECM) é uma característica marcante do fenótipo metastático 1-3. Invasão câmaras têm sido amplamente utilizados como ferramentas in vitro para estudar a invasão de células do cancro e da migração e pode proporcionar conhecimento sobre os mecanismos de invasão de tumores in vivo e metástase. As câmaras consistem em pastilhas cilíndricas de cultura de células aninhados dentro dos poços de placas de cultura de células. As partes inferiores das inserções são semi-permeáveis de poliestireno ou de policarbonato de tamanho de poro das membranas definidos.
No ensaio de invasão padrão, as células são semeadas sobre a membrana de inserção com meio isento de soro e colocadas em poços de cultura de células que são preenchidos com quimioatractores soro ou soro semelhante a set-se uma força quimioatratante. Isto dirige as células de força para mover através da membrana semi-permeável (migração) ou, em alternativa, através de um revestimento de matriz extracelular (invasão), que pode, então, ser marcadas utilizando corantes convencionais para detectar e quantificar o número de células. O número de células é então normalizados de acordo com a extensão da migração e invasão em uma linha de células não-invasiva. Este método permite que um investigador para avaliar o potencial invasivo de diferentes tipos de células sob uma variedade de condições, incluindo as manipulações genéticas.
Hormonas, citocinas e factores de crescimento são componentes críticos de soro e estão cada vez mais a ser mostrado para ser associado com a condução do fenótipo invasivo 4. No entanto, a natureza, função e especificidade destas moléculas de soro quimioatratantes na mediação invasão ainda permanecem ainda desconhecidos. O desafio continua a determinar os fatores específicos em chemoattractants soro ou soro-like são responsáveis pela conduçãoinvasão de células de cancro, bem como as moléculas que podem inibir o processo de invasão. Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para avaliar o potencial envolvimento de hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento presentes no soro, como moléculas de condução quimioatração e invasão das células cancerosas.
Neste protocolo modificado proposto, carvão remoção é utilizado para remover hormonas, citocinas e factores de crescimento a partir de 2% de soro fetal bovino (FBS) para gerar 2% de carvão despojado de FBS (CS-FBS). Ambos 2% de FBS e 2% de CS-FBS são utilizados como agentes para ajustar-se a força quimioatratante para conduzir a invasão de células do cancro. Utilizando a 2% de CS-FBS como um agente quimioatratante em comparação com o normal 2% de FBS proporciona vários benefícios, incluindo em primeiro lugar, e mais importante ainda, a possibilidade de estudar o fenótipo de invasão do cancro no reduzido / relativa ausência de hormonas, citoquinas e factores de crescimento. Ele também permite que o investigador para avaliar se a remoção coletiva de hormônios, fatores de crescimento, e cytokines provoca um aumento ou uma diminuição no índice invasivo. O ensaio é concebido para, em seguida, determinar se a adição de um componente individual, designada como "X" pode inibir, aumento, diminuição, ou restaurar o índice invasivo para o seu valor original (ver Figuras 2 e 3). Embora esta metodologia é específico para alcançar os níveis fisiológicos de o componente que é removido a partir do soro durante a remoção do carvão vegetal, deve também notar-se que o carvão de decapagem pode também afectar vias de transdução de sinal. Por exemplo, foi relatado que o carvão de decapagem pode diminuir a actividade da fosfatase alcalina de células osteoprogenitoras e induzem adipogénese por meio de redução de activadores MAPK 5. Meios de carvão despojado estão disponíveis comercialmente e são baseados no protocolo delineado que combina com carvão dextrano e incubadas com soro fetal bovino O / N 6.
Este ensaio foi desenvolvido em respoNSE a um resultado relatado por Zucker et al. 7 Os autores demonstraram que um fenótipo mutante afetando a comunicação junção gap demonstrou um aumento no índice de invasão ao migrar em direção a mídia com o normal FBS 2%. Este aumento foi eliminado, com a substituição do soro separado com carvão activado. A partir deste resultado, os autores concluíram que essa migração afetados mutante em direção a uma molécula lipofílica (mais especificamente, um hormônio, fator de crescimento, ou citocina) 7. É bem conhecido que as hormonas, factores de crescimento e citoquinas medeiam a sinalização de vias envolvidas na promoção de tumores e invasão 4. Assim, é importante para os investigadores científicos para determinar o factor de (s) a conduzir à invasão tumoral das suas células cancerosas particulares ou mutantes sob estudo. O ensaio é concebido para tratar o papel de componentes individuais na sua concentração fisiológica conforme determinado de acordo com a diferença entre a concentração do componente &# 8220; X "em SBF normal e o CS-FBS. Através do desenvolvimento deste ensaio, os investigadores podem ter mais conhecimento da via invasiva específica que regule seu sistema.
As hormonas, factores de crescimento e citocinas têm sido muitas vezes classificadas como promotores de tumor 8. Alguns destes factores tais como EGF são usados como fontes directas para quimioatractores em câmaras de invasão 9. Assim, parece provável que estes representam os principais componentes do soro que a invasão tumoral direta. Este protocolo propõe um método simples, mas significativa, a modificação do ensaio de invasão in vitro convencional, que permite que um investigador para avaliar o envolvimento das hormonas, factores de crescimento, citocinas e na mediação do potencial invasivo das células cancerosas. No entanto, o ensaio é concebido para proporcionar o investigador com uma resposta quanto ao facto de o processo será eficaz para o seu estudo em um passo inicial na análise, de modo a não usar o tempo precioso e recursos se for considerado desnecessário. Este método usa CS-FBS e baseia-se na discrição investigadores como para que as moléculas de prosseguir como chumbo candidatos que potencialmente medeiam invasão da célula cancerosa. Os resultados destas análises devem provar ser úteis na identificação de componentes do soro que servem como quimioatractores ou inibidores para a linha de células particular ou mutante a ser estudada. Além disso, esta abordagem pode ajudar a identificar o investigador principais vias de sinalização ou promover ou inibir a invasão de células de cancro; assim direcionando projeto futuro de drogas.
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Protocol
1. Prepare os diferentes meios de comunicação e componentes adicionais
- Antes de testar, preparar meio consistindo de DMEM ou outros meios especificados com a adição de ambos os normais de FBS, carvão despojado de FBS, ou carvão despojado de FBS mais o componente a ser testado. Note-se que vários componentes podem ser testados em cada experiência.
- Pesar e diluir as hormonas, factores de crescimento ou citocinas de forma adequada para ser dissolvidos no soro carvão despojado na concentração fisiológica.
2. Prepare a matriz de colágeno on Ice
- Prepare a 2 ml de colagénio I matriz de 2,2 mg / ml, adicionando as seguintes componentes filtradas estéreis em gelo: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 mL de NaOH 1 N, 600 uL de dupla H2O destilada e 1,2 ml de colagénio I (a 3,63 mg / ml).
- Mantenha solução de colágeno I em gelo até que esteja pronto para a chapa.
3. Prepare Plates Migração / Invasão para Ensaio </ P>
- Para cada linha celular a ser testada, utilizar uma placa da câmara de 24 poços na qual 12-poços contêm inserções. Use os mais 12 poços que não contêm inserções para adicionar a mídia quimioatractivas e transferindo as inserções para o arranjo experimental.
NOTA: A matriz de colagénio em placas com uma membrana de polietileno teraftalato (PET) e de 8 um de tamanho de poro é óptima para as linhas de células de usar aqui. No entanto, uma matriz de matrigel, em placas pré-revestidas também podem ser substituídos com a diminuição do tamanho dos poros de acordo com a linha celular a ser investigado. - Identificam a placa, usando três poços por condição a ser analisados (FBS migração, migração CS-FBS, invasão FBS, e invasão CS-FBS, bem como FBS-migração para um controle, linha de células não-invasiva). Ensaio de migração por circulação através de uma membrana de poros em PET, e invasão por ensaio de movimento através de uma matriz de colagénio ou de matrigel e, em seguida, através de poros na membrana. Use diferentes marcadores de cor para cada condição para uma célulaid no processo de revestimento.
4. Dispense a Matrix Invasion
- Cuidadosamente pipeta 75 ul da solução de matriz de colagénio nas inserções para ser utilizado para ensaios de invasão. Tenha cuidado para evitar bolhas. Dispersar as bolhas, aplicando uma ponta de pipeta invertido para a superfície.
- Transferir a placa com as inserções revestidas com colagénio a uma temperatura de 37 ° C e 5% de CO2 durante 30 min para permitir que o gel solidifique.
5. Placa as células sobre a membrana ou Invasion Matrix
- Enquanto isso, Tripsinizar as células e adicionar meios com 10% de FBS. Células giram a 200 xg por 5 min em uma centrífuga de bancada e lavar 3x em meio livre de soro.
- Ressuspender em meio livre de soro. Contagem de células com um hemocitômetro ou contador de fotos automática. Adicionar meio isento de soro para uma concentração final de 5 x 10 4 células / ml.
- Quando a matriz de colágeno tem solidificado (após 30 min), adicione 700 mL de mídia com qualquer2% de FBS ou definidos carvão despojado-FBS a cada poço. Dos 12 pastilhas por placa:
- 3 inserções têm colágeno e poços com media + 2% FBS
- 3 inserções têm colágeno e poços com media + 2% CS-FBS
- 3 inserções não têm colágeno e poços com media + 2% FBS
- 3 inserções não têm colágeno e poços com media + 2% CS-FBS
- Utilizar placas adicionais, dependendo do número de factores a ser testado e com um controlo de colagénio sem correspondente a cada condição.
- Adicionar suspensão de células para as inserções em 5 x 10 4 células / ml, chapeamento de 500 células mL por inserir em todas as inserções de migração e invasão.
- Incubar as células durante 22 h a 37 ° C.
6. quantificar o número de Migração e invadir as células
- Configure coloração de poços utilizando fixador metanol, eosina, e hemotoxilina, em poços separados.
- Use cotonetes de algodão para remover as células e matriz de cada cavidade.Rrepeat com segunda aplicação swab para cada poço.
- Com uma pinça, mergulhar cada inserção 5 vezes durante 1 segundo para cada uma das três soluções em sucessão.
- Permitir inserções para secar S / N.
- Ou i) remover filtros com um bisturi, cortando com cuidado em torno das bordas e montar em um slide com lamela e imersão em óleo, ou ii) permitir que as inserções para secar O / N invertido e usar as inserções diretamente para microscopia.
- No dia seguinte, ver slides ou inserções sob um microscópio com objetiva de 20x e levar 5 imagens de diferentes regiões do filtro. Para melhorar a consistência, tome 4 campos externos e um centro.
- Contar as células de todas as condições utilizando o software ImageJ e aplicam-se às fórmulas abaixo.
- Determinar a invasão por cento da seguinte forma:
A média de # de células invasoras através de colágeno I inserir = a
A média de # de células que migram através de inserção de controle = b
Invasão% = (a / b) * 100 - Determinar o Índice de Invasão em 2% de FBS como se segue:
% Invasão de células a ser ensaiado (em 2% de FBS) c =
% Invasão de controle de células não-invasivos em (2% FBS) = d
Índice de invasão (FBS) = (c / d) - Determinar o Índice de Invasão em 2% de CS-FBS como se segue:
% Invasão de células a ser ensaiado (em 2% de CS-FBS) = e
% Invasão de controle de células não-invasivos em (2% CS-FBS) = f
Índice de invasão (CS-FBS) = (E / F)
7. Repita protocolo experimental comparando Charcoal-despojado FBS para FBS Charcoal-despojado + X n com múltiplos fatores combinados
- Repetir o procedimento várias vezes como necessário, utilizando componentes diferentes para "X" ou uma combinação de componentes.
- Aplicar os cálculos para determinar a contribuição de cada fator "X" para os efeitos da migração e invasão.
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Representative Results
O índice de invasão é calculada para cada condição de acordo com a normalização de uma linha de células não-invasiva. Para as nossas experiências, que use a linha celular de melanoma 1205Lu e variantes estabelecido linhas celulares estáveis como nossas linhas invasivos, bem como a variante não invasiva pré-malignas, WM793 a partir do qual as células foram derivadas 1205Lu 10, que serve como um controlo lógico. Nós também utilizar colagénio I, tal como a matriz de invasão porque é que o componente primário da derme. Isto está de acordo com um estudo anterior em que a matriz de invasão óptima varia de acordo com a linha de células e o grau de concordância com os resultados in vivo 11. Este ensaio de invasão é descrito esquematicamente de acordo com os possíveis resultados do investigador pode obter. Inicialmente, o índice de invasão por 2% de FBS deve ser significativamente maior ou menor do que o índice de invasão para CS-FBS a fim de prosseguir neste ensaio (Figuras 1 e 2). Se um incr significativaaliviar ou diminuição no índice de invasão é aparente com FBS separado com carvão activado, este ensaio não é útil para o investigador (Figuras 2 e 3). Se este aumento é eliminado com FBS separado com carvão activado, o investigador tem já o conhecimento de que a invasão reforçada é dirigida para uma hormona, factor de crescimento ou citoquina (Figuras 2 e 3). Em seguida, o pesquisador deve utilizar as informações sobre o tipo de tumor específico e mutação para determinar qual candidato (s) presentes mecanismos plausíveis como chemoattractants. O investigador pode começar por tentar um ou vários componentes individualmente na concentração fisiológica por adição do componente com a diferença de concentração entre 2% de FBS e 2% de CS-FBS (Tabela 1). Se um componente adicionado ao soro separado com carvão activado aumenta significativamente diminui o potencial de invasão em comparação com apenas o soro separado com carvão activado, que candidato, "X", pode servir como uma parcial ousocorrista completa, dependendo da extensão de aumento (Figuras 2 e 3). Dois ou mais componentes podem ser combinadas para atingir um aumento aditivo ou sinérgico, (denotado como + X 1 X 2 X 3 + ...) (figura 3). Um factor que diminui a extensão da invasão seria classificado como um factor inibidor (Figuras 2 - 4). Nas nossas experiências, mostrou-se que a utilização de uma linha celular de melanoma mutante (T154A 1205Lu) migração para um quimioatractor com as suas hormonas, factores de crescimento, citocinas e removidos causou uma diminuição na capacidade de invasão tumoral. Três hormonas foram testados para identificar um possível "X". Estes incluem estrogênio (estradiol), progesterona e hormônio tireoidiano (T4). Duas dessas hormonas não teve efeito sobre o índice de invasão (a progesterona e da hormona da tiróide), ao passo que foi identificado como estrogénio em factor inibidor (Figura 4). De acordo com os resultados potenciais indicados noA Figura 3, os resultados experimentais deste exemplo demonstram uma diminuição com a Condição 2 e com uma inibição condição 3. É provável que o estrogénio será abordado neste ensaio, uma vez que pode ser importante na identificação de vias que sequestram certos factores de sinalização para futuras estratégias de design de drogas. Experimentos adicionais serão dirigidas a fatores de crescimento e citocinas para identificar outros componentes que podem servir de "resgate" fenótipo chemoattractants pró-invasão. Identificação de ambas as moléculas pro-invasivos e inibidores podem elucidar coletivamente o potencial invasivo para as linhas de células e variantes mutantes sob investigação.
Figura 1. Instalação experimental e design. Modelo do estabelecido para o processo experimental mostrando células banhado tanto na membrana PET diretamente ou ccamada ollagen em meio livre de soro. As células são ou migrando ou invadir através da matriz de colágeno em direção a um chemoattractant que é modificada de acordo com o protocolo e descrito como Condição 1, 2 e 3. As células que migraram ou invadidas são então fixadas e coradas. Por favor, clique aqui para ver um maior versão desta figura.
Figura 2. resultados potenciais de um resultado membrana ensaio de invasão padrão. Este modelo demonstra os resultados potenciais que o investigador pode encontrar para o ensaio de invasão e como interpretar esses resultados. Cada círculo é um resultado representativo de um filtro coradas usando as mesmas três condições que são descritas na Figura 1. Cada ponto representa uma célula que tenha passado através da invasãomatriz e coradas na parte inferior da membrana. As células serão devidamente quantificados e analisados de acordo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A interpretação dos dados para a invasão com CS-FBS ± X. Este esquema descreve como os cálculos do Índice Invasion determinar as conclusões experimentais. CS-FBS é o soro separado com carvão activado e X refere-se aos componentes individuais adicionados aos meios CS-FBS descritos no texto. Os autores definir o desvio padrão (sd) como a variabilidade aceite devido a erro experimental nas nossas condições. No entanto, dependendo das condições sob observação e o número de repetições, este factor pode ser ajustada para estar dentro do intervalo de estatalsignificado iCal para o investigador. O experimento pode ser repetido com vários "X" moléculas, (indicado como X 1 + X 2 + X 3 ...). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os resultados do ensaio de invasão. Este gráfico mostra os resultados experimentais obtidos quando se utiliza uma linha celular variante mutante 3 estabelecida a partir de células de melanoma 1205Lu metastático. As concentrações das hormonas adicionados são como se segue: estrogéneos (0,566 pg / ml), progesterona (0,001 ng / ml), hormona da tiróide (0,283 ug / dl). O controle, linha celular não invasivo utilizado para estes experimentos foi WM793B. Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes, e um gráfico representativo é mostrado.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS cat # SH30068
Tabela 1. Exemplos de gamas de concentração de escolha hormonas, factores de crescimento e citoquinas em bovinos e soros humanos. A diferença de concentração entre 2% de FBS e 2% de CS-FBS representa a quantidade adicionada para atingir concentrações fisiológicas.
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Discussion
Metástase tumoral é um processo de múltiplos passos. As células devem romper a membrana basal, em intravasate ou do sistema linfático ou microvasos sanguíneos, na qual são transportadas para locais distantes. As células tumorais e, em seguida, de extravasamento em colonizar um macrometástase 12. Progressão através do epitélio para o mesenquimal (EMT), invasão tumoral e metástase tenha sido reforçada por hormônios esteróides 13,14, fatores de crescimento de 15-18, 19-21 e citocinas. Estas moléculas são tão fundamentais para enfrentar a via de sinalização da progressão do tumor, que o desenvolvimento de um ensaio para definir o seu papel no tumor potencial invasivo é um passo importante para decifrar as vias de sinalização intrincados.
Este ensaio de usar soro separado com carvão activado tem uma vantagem sobre os métodos existentes, pois tem como objetivo identificar a força motriz para o qual o tumor células estão migrando. Um ensaio anterior temfoi publicada usando fibroblastos normais da mama primário em câmaras de invasão. Neste estudo, os autores utilizaram media despojado-carvão e acrescentou volta estrogênio em câmaras de matrigel que não causam invasão como esperado, já que as células não foram tumorigenic. No entanto, a presença de meio condicionado de macrófagos, na presença ou na ausência de estrogénio aumentou significativamente e de uma extensão semelhante 22 invasão. Embora este ensaio foi semelhante que seja usado ensaios de invasão com soro separado com carvão activado, na ausência ou na presença de estrogénio, que não foi um ensaio de tumor e foi dirigida para o estudo das interacções entre parácrinos macrófagos e fibroblastos 22. Outro ensaio utilizado meios separado com carvão activado para mostrar que a adição de baixos níveis de estrogénio aumentou a proliferação de células de cancro da mama, mas causou resistência a inibidores de cinase 23. O nosso estudo é único na medida em que é um ensaio de invasão aplicável aos vários tipos de células cancerosas concebidos para estudar oefeito das hormonas individuais, factores de crescimento e citocinas, quer isoladamente ou em combinação. Além disso, sujeitos a literatura disponível, nós determinamos as concentrações de hormona necessário adicionar ao soro separado com carvão activado para atingir níveis f isiologicamente relevantes (Tabela 1). A adição do componente individual, "X" em níveis normalmente presentes no soro é um parâmetro crítico do ensaio. Embora este ensaio pode parecer ser limitado pelos níveis publicados de hormonas, factores de crescimento e citocinas no soro, o investigador pode usar ensaios de ELISA para determinar os níveis de factores adicionais.
Enquanto que o protocolo é específico para a utilização de colagénio I, matrigel também poderia ser substituído se o investigador estava consistentemente usando essa matriz. A razão que se prefere utilizar colagénio I é porque é um único componente, que está definido e é o principal constituinte da derme. Além disso, usamos 75 ul de 100 μg / ml de colagénio para fazer a matriz de invasão. Isto também pode ser modificada para alcançar os resultados desejados. É melhor para otimizar a concentração de modo que um número razoável de células podem ser contados nos filtros. Se as células são altamente invasiva, pode ser melhor usar 100 ul de colagénio I para a matriz ou para aumentar a concentração de colagénio. Embora esta técnica possa ajudar o investigador obter informação importante, é útil apenas se as células de tumores estão a invadir no sentido de um quimioatractor que é removido pelo carvão-extracção do soro. Se não existe qualquer diferença entre os resultados para o controlo e o soro separado com carvão activado, em seguida, o ensaio não seria pena prosseguir. O ensaio também aborda os resultados para quimioatractores individuais, bem como supressores de quimiotaxia. Além disso, na comparação de possíveis resultados (Figura 3), foi utilizado o desvio padrão como o nível de erro experimental aceite para cada experimento. No entanto, o real values pode ser determinada pelo investigador com base no desvio padrão ou erro padrão e um valor p significativo.
Além disso, a informação recolhida a partir deste ensaio pode ser útil na concepção de inibidores farmacológicos de certas vias de sinalização. Por exemplo, se uma ou mais hormonas, factores de crescimento, citocinas e / ou se encontra a ser implicada no mecanismo de invasão para uma mutação de células de tumor em particular, do que um agente farmacológico existente pode ser usado ou um novo medicamento concebido para inibir essa via. O ensaio também é uma ferramenta eficaz para estudar a mutação particular de tumor e se a alteração do resíduo de aminoácido ou a sua posição mantém a mesma afinidade para o quimioatraente que foi identificado por este ensaio. Desta forma, o nosso ensaio oferece uma nova abordagem para fornecer pistas sobre o mecanismo de invasão das células cancerosas e possivelmente métodos para evitar a invasão do tumor.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
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