Abstract
Siero del sangue funge da chemoattractant verso il quale le cellule tumorali migrano e invadono, facilitando il loro intravasation in microvasi. Tuttavia, le molecole reali verso cui le cellule migrano rimangono sfuggente. Questo test invasione modificato è stato sviluppato per identificare gli obiettivi che guidano la migrazione delle cellule e l'invasione. Questa tecnica confronta l'indice invasione in tre condizioni per determinare se un ormone specifico, fattore di crescita, citochine o gioca un ruolo nel mediare il potenziale invasivo di una cellula tumorale. Queste condizioni includono i) normale siero fetale bovino (FBS), ii), carbone-spogliato FBS (CS-FBS), che rimuove gli ormoni, fattori di crescita e citochine e iii) CS-FBS + molecola (denotato "X"). Un cambiamento significativo nella invasione delle cellule con CS-FBS rispetto al FBS, indica il coinvolgimento di ormoni, citochine e fattori di crescita nel mediare il cambiamento. Molecole individuali possono essere aggiunti nuovamente al CS-FBS per saggiare la capacità di riversetto o salvare il fenotipo invasione. Inoltre, due o più fattori possono essere combinati per valutare la effetti additivi o sinergici di più molecole in guida o inibire l'invasione. In generale, questo metodo consente al ricercatore di determinare se ormoni, citochine e / o fattori di crescita svolgono un ruolo nella invasione delle cellule servendo come fattori chemiotattici o inibitori di invasione per un particolare tipo di cellula tumorale o un mutante specifica. Identificando chemioattrattanti e inibitori specifici, questo test invasione modificato può aiutare a chiarire vie di segnalazione che dirigono l'invasione delle cellule tumorali.
Introduction
Un test invasione romanzo è stato sviluppato con l'obiettivo di individuare il coinvolgimento di specifici ormoni, citochine e / o fattori di crescita come fattori chemiotattici di invasione delle cellule del cancro. La capacità delle cellule tumorali di invadere attraverso la matrice extracellulare (ECM) è una caratteristica del fenotipo metastatico 1-3. Camere Invasion sono stati ampiamente utilizzati come strumenti in vitro per studiare l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione e possono fornire conoscenze ai meccanismi di in vivo invasione tumorale e metastasi. Le camere sono costituiti da inserti di coltura cellulare cilindrici annidati all'interno dei pozzetti di piastre di coltura cellulare. Le parti inferiori degli inserti sono policarbonato o polistirolo membrane semi-permeabili di dimensioni dei pori definiti.
Nel saggio di invasione di serie, le cellule vengono seminate su membrana inserto con siero media liberi e collocati in pozzetti di coltura cellulare che sono pieni di siero o siero-come fattori chemiotattici per set una forza chemoattractive. Questa unità forza cellule di muoversi attraverso la membrana (migrazione) semipermeabile o in alternativa, attraverso un rivestimento di matrice extracellulare (invasione), che possono poi essere colorato con coloranti convenzionali per rilevare e quantificare il numero di cellule. Il numero di cellule viene quindi normalizzato secondo l'entità della migrazione e l'invasione in una linea cellulare non invasivo. Questo metodo consente un investigatore di valutare il potenziale invasivo di tipi cellulari diversi sotto una varietà di condizioni, tra manipolazioni genetiche.
Ormoni, citochine e fattori di crescita sono componenti critici di siero e sono sempre più dimostrato di essere associato con la guida del fenotipo invasivo 4. Tuttavia, la natura, il ruolo e la specificità di queste molecole siero chemoattractive a mediare invasione rimangono ancora sfuggente. La sfida rimane per determinare quali fattori specifici nel siero o siero-like chemioattrattanti sono responsabili per la guidal'invasione delle cellule del cancro così come quello che le molecole possono inibire il processo di invasione. In questo rapporto, si descrive un metodo per valutare il potenziale coinvolgimento di ormoni, citochine e / o fattori di crescita presenti nel siero, come molecole guida la chemiotassi e l'invasione delle cellule tumorali.
In questo protocollo modificato proposto, carbone strippaggio viene utilizzato per rimuovere ormoni, citochine e fattori di crescita da siero bovino fetale 2% (FBS) per generare 2% carbone spogliato FBS (CS-FBS). Entrambi 2% FBS e 2% CS-FBS sono usati come agenti per impostare la forza chemoattractive di guidare l'invasione delle cellule di cancro. Utilizzando 2% CS-FBS come agente chemoattractive rispetto al normale 2% FBS offre diversi vantaggi tra cui in primo luogo e più prominente, la capacità di studiare il fenotipo cancro invasione nel ridotto / relativa assenza di ormoni, citochine e fattori di crescita. Consente inoltre il ricercatore di valutare se la rimozione collettiva di ormoni, fattori di crescita, e cytokines provoca un aumento o una diminuzione nell'indice invasiva. Il saggio viene quindi progettato per determinare se l'aggiunta di un singolo componente, designato come "X" può inibire, riduzione o aumento o ripristinare l'indice invasivo al suo valore originale (vedi figure 2 e 3). Anche se questo metodo è specifico per raggiungere i livelli fisiologici del componente che viene rimosso dal siero durante carbone strippaggio, va anche notato che il carbone strippaggio può anche compromettere le vie di trasduzione del segnale. Ad esempio, è stato riportato che il carbone strippaggio può diminuire l'attività della fosfatasi alcalina di cellule osteoprogenitrici e indurre adipogenesi attraverso la riduzione di attivatori MAPK 5. Carbone supporti spogliato sono disponibili in commercio e sono basate sul protocollo delineato che combina con carbone destrano e incubate con siero fetale bovino O / N 6.
Questo test è stato sviluppato in RESPONSE ad un risultato riportato da Zucker et al. 7 Gli autori hanno dimostrato che un fenotipo mutante colpisce comunicazione gap junction dimostrato un aumento dell'indice di invasione durante la migrazione verso media con normale 2% FBS. Tale aumento è stato eliminato con la sostituzione di siero carbone-spogliato. Da questo risultato, gli autori hanno concluso che la migrazione interessato mutante verso una molecola lipofila (più specificamente, un ormone, fattore di crescita o citochine) 7. È ben noto che gli ormoni, fattori di crescita e citochine mediano vie di segnalazione coinvolte nella promozione del tumore e l'invasione 4. Pertanto, è importante per gli investigatori scientifici per determinare quale fattore (s) stanno guidando l'invasione tumorale dei loro particolari cellule tumorali o mutanti sotto studio. Il saggio è progettato per affrontare il ruolo dei singoli componenti al loro concentrazioni fisiologiche come determinato in base alla differenza tra la concentrazione del componente &# 8220; X "in normale FBS e il CS-FBS. Attraverso lo sviluppo di questo test, i ricercatori possono ottenere un quadro più chiaro il percorso invasivo specifica che disciplina il loro sistema.
Ormoni, fattori di crescita e citochine sono stati spesso classificati come promotori tumorali 8. Alcuni di questi fattori come EGF sono utilizzati come fonti dirette per chemioattrattanti in camere invasione 9. Così, sembra probabile che questi rappresentano i principali componenti del siero che invasione tumorale diretta. Questo protocollo propone una semplice, ma significativa, modifica convenzionale vitro invasione test in cui consente un investigatore di valutare il coinvolgimento di ormoni, fattori di crescita e citochine nel mediare il potenziale invasivo delle cellule tumorali. Tuttavia, il saggio è progettato per fornire il ricercatore una risposta se il procedimento sarà efficace per il loro studio in un primo passo nell'analisi, per non usare tempo prezioso e risorse se ritenute inutili. Questo metodo utilizza CS-FBS e si basa sulla discrezionalità investigatori su quale molecole di perseguire come candidati di piombo che potenzialmente mediano invasione delle cellule di cancro. I risultati di queste analisi dovrebbero rivelarsi utili per individuare quali componenti del siero servono come fattori chemiotattici o inibitori per la particolare linea cellulare o mutante in fase di studio. Inoltre, questo approccio può aiutare il ricercatore a identificare vie di segnalazione chiave o che promuovono o inibiscono l'invasione delle cellule di cancro; indirizzando in tal modo il futuro sviluppo di farmaci.
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Protocol
1. Preparare i supporti differenti e componenti aggiuntivi
- Prima di sperimentare, preparare supporti costituito da DMEM o altri supporti specificati con l'aggiunta di una normale FBS, carbone spogliato FBS, o carbone spogliato FBS più il componente da testare. Si noti che più componenti possono essere testati in ogni esperimento.
- Pesare e diluire gli ormoni, fattori di crescita, citochine o opportunamente essere disciolti nel siero carbone spogliato alla concentrazione fisiologica.
2. Preparare il collagene Matrix on Ice
- Preparare 2 ml di collagene I matrice a 2,2 mg / ml aggiungendo i seguenti componenti filtrati sterili su ghiaccio: 200 ml 10x PBS (pH 7.4), 5,4 ml 1 N NaOH, 600 ml di doppia H 2 O distillata e 1,2 ml di collagene I (a 3,63 mg / ml).
- Tenere soluzione collagene I in ghiaccio fino alla piastra.
3. Preparare piatti Migration / Invasion per test </ P>
- Per ciascuna linea cellulare da testare, utilizzare una piastra camera 24 pozzetti in cui 12-pozzetti contengono inserti. Utilizzare aggiuntivi 12 pozzetti che non contengono inserti per aggiungere i media chemiotattico e trasferire gli inserti per il set up sperimentale.
NOTA: una matrice di collagene su piastre con un polietilene teraphthalate (PET) di membrana e 8 micron dimensione dei pori è ottimale per le linee di cellule usano qui. Tuttavia, una matrice matrigel in lastre pretrattata può anche essere sostituito con la dimensione dei pori diminuita secondo la linea cellulare indagato. - Chiaramente etichettare il piatto, con 3 pozzi per condizione di essere analizzati (migrazione FBS, migrazione CS-FBS, FBS invasione, e CS-FBS invasione e FBS-migrazione per un controllo, linea cellulare non invasiva). Migrazione Assay dal movimento attraverso i pori in una membrana PET, e dosaggio invasione di movimento attraverso una matrice di collagene o matrigel e poi attraverso i pori nella membrana. Utilizzare diversi marcatori di colore per ogni condizione cella a unaid nel processo di placcatura.
4. Distribuire l'invasione Matrix
- Pipettare attentamente 75 microlitri della soluzione di matrice di collagene negli inserti da utilizzare per saggi di invasione. Usare cautela per evitare le bolle. Disperse bolle applicando una punta della pipetta invertita alla superficie.
- Trasferire la piastra con inserti collagene rivestite a CO 2 incubatore 37 ° C e 5% per 30 minuti per consentire il gel a solidificare.
5. Piatto celle sulla membrana o Invasion Matrix
- Nel frattempo, trypsinize cellule e aggiungono media con il 10% FBS. Celle Spin a 200 xg per 5 minuti in una centrifuga da tavolo e risciacquo 3x in media liberi di siero.
- Risospendere in media liberi siero. Contare le cellule con un emocitometro o contatore presentazione automatica. Aggiungi mezzi di comunicazione liberi di siero a una concentrazione finale di 5 x 10 4 cellule / ml.
- Quando la matrice di collagene è solidificato (dopo 30 min), aggiungere 700 ml di media con entrambi2% FBS o definiti carbone-spogliati FBS a ciascun bene. Dei 12 inserti per piastra:
- 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS
- 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS
- 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS
- 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS
- Utilizzare piastre aggiuntive a seconda del numero di fattori da testare e con un controllo senza collagene corrispondente a ciascuna condizione.
- Aggiungi sospensione cellulare agli inserti a 5 x 10 4 cellule / ml, placcatura 500 cellule microlitri per inserto in tutti gli inserti di migrazione e invasione.
- Incubare le cellule per 22 ore a 37 ° C.
6. quantificare il numero di Migrazione e cellule invasori
- Impostare colorazione dei pozzetti con metanolo fissante, eosina, e hemotoxylin, in pozzetti separati.
- Usare tamponi di cotone per rimuovere le cellule e la matrice di ogni bene.Rrepeat con seconda domanda tampone per ogni bene.
- Con pinze, immergere ogni inserto 5 volte per 1 sec in ciascuna delle 3 soluzioni in successione.
- Lasciare asciugare inserti O / N.
- Entrambi i) rimuovere i filtri con un bisturi, tagliare con cura intorno ai bordi e montare su un vetrino con coprioggetto e immersione in olio, o ii) consentire gli inserti asciugare O / N invertita e utilizzare gli inserti direttamente per la microscopia.
- Il giorno successivo, visualizzare diapositive o inserti al microscopio con un obiettivo 20X e prendere 5 immagini provenienti da diverse regioni del filtro. Per migliorare la coerenza, prendere 4 campi esterni e uno centrale.
- Contare le cellule per tutte le condizioni utilizzando il software ImageJ e applicare le formule seguenti.
- Determinare la percentuale invasione come segue:
Media # di cellule che invadono attraverso collagene inserisco = a
Media # di cellule che migrano attraverso inserti di controllo = b
Invasion% = (a / b) * 100 - Determinare l'Indice Invasion in 2% FBS come segue:
% Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% FBS) = c
% Invasione delle cellule non invasivi di controllo in (2% FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Determinare l'indice Invasion in 2% CS-FBS come segue:
% Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% CS-FBS) = e
% Invasione delle cellule di controllo non invasivi in (2% CS-FBS) = f
Invasion Index (CS-FBS) = (E / F)
7. Ripetere protocollo sperimentale Paragonando Charcoal-spogliato FBS a FBS Charcoal-stripped + X n con più fattori combinati
- Ripetere la procedura più volte necessario utilizzando diversi componenti per "X" o una combinazione di componenti.
- Applicare i calcoli per determinare il contributo di ciascun fattore "X" per gli effetti di migrazione e invasione.
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Representative Results
L'indice di invasione viene calcolato per ogni condizione secondo la normalizzazione di una linea cellulare non invasivo. Per i nostri esperimenti, utilizziamo la linea cellulare di melanoma 1205Lu e linee cellulari stabili varianti affermata come nostre linee invasive nonché la variante non invasivo premaligne, WM793 da cui le cellule sono state derivate 1205Lu 10 che serve da controllo logica. Utilizziamo anche il collagene I come la matrice invasione perché è la componente primaria del derma. Ciò è in accordo con uno studio precedente in cui la matrice ottimale invasione varia in base alla linea cellulare e il grado di concordanza con in vivo risultati 11. Questo test invasione è delineato schematicamente in base ai possibili risultati l'investigatore potrebbe ottenere. Inizialmente, l'indice di invasione per 2% FBS dovrebbe essere significativamente superiore o inferiore all'indice invasione per CS-FBS al fine di perseguire questo dosaggio (figure 1 e 2). Se un incr significativofacilità o diminuzione nell'indice invasione è evidente con carbone-spogliato FBS, questo test non è utile per il ricercatore (figure 2 e 3). Se questo aumento viene eliminato con carbone-spogliato FBS, l'investigatore ha già la consapevolezza che l'invasione maggiore è diretto verso un ormone, il fattore di crescita, o citochine (figure 2 e 3). Quindi, il ricercatore deve utilizzare le informazioni sul tipo di tumore specifico e la mutazione per determinare quale candidato (s) presentano meccanismi plausibili come chemoattractants. Il ricercatore può iniziare provando uno o più componenti singolarmente alla concentrazione fisiologica aggiungendo la componente alla differenza di concentrazione tra il 2% FBS e 2% CS-FBS (Tabella 1). Se un componente aggiunto siero carbonella-spogliato aumenta significativamente della diminuisce il potenziale invasione rispetto al siero carbone-spogliato soli, che candidato, "X", può servire come un parziale osoccorritore completa, a seconda del grado di aumento (figure 2 e 3). Due o più componenti possono essere combinati per ottenere un aumento additivi o sinergici, (indicato come X 1 + X 2 + X 3 ...) (Figura 3). Un fattore che diminuisce il grado di invasione sarebbe classificato come un fattore inibitorio (figure 2 - 4). Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato che l'uso di una linea cellulare di melanoma mutante (1205Lu T154A) migrazione verso un chemiotattico con i suoi ormoni, fattori di crescita e citochine rimossi causato una diminuzione del tumore invasività. Tre ormoni sono stati testati per identificare un possibile "X". Questi includono gli estrogeni (estradiolo), progesterone, e ormone tiroideo (T4). Due di questi ormoni non ha avuto effetto sull'indice di invasione (progesterone e ormone tiroideo), mentre gli estrogeni è stato identificato come fattore inibitorio (Figura 4). Secondo i potenziali risultati di cui alFigura 3, i risultati sperimentali di questo esempio prova di una diminuzione della Condizione 2 e un'inibizione della Condizione 3. È probabile che gli estrogeni sarà utilizzato ulteriormente in questo test, in quanto può essere importante nella identificazione di vie che sequestra alcuni fattori segnalazione per le future strategie di progettazione di droga. Ulteriori esperimenti saranno dirette a fattori di crescita e citochine per identificare altri componenti che possono servire come "fenotipo di salvataggio" chemioattrattanti pro-invasione. Identificazione di entrambe le molecole pro-invasive e inibitori possono collettivamente chiarire il potenziale invasivo per le linee cellulari e varianti mutanti sotto inchiesta.
Figura 1. Apparato sperimentale e la progettazione. Modello di set up per il processo sperimentale che mostra cellule placcato o sulla membrana PET direttamente o cstrato ollagen in media liberi siero. Le cellule sono o migrando o invadere attraverso la matrice di collagene verso un chemoattractant che viene modificato secondo il protocollo e descritto come Condizione 1, 2, e 3. Le celle migrati o invaso vengono poi fissate e colorate. Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.
Figura 2. Potenziali risultati da una membrana risultato del test di invasione standard. Questo modello dimostra i potenziali risultati che il ricercatore può incontrare per il dosaggio invasione e come interpretare questi risultati. Ogni cerchio è risultato rappresentativo per un filtro colorato utilizzando le stesse condizioni che sono 3 illustrato in figura 1. Ogni punto rappresenta una cella che è passata attraverso l'invasionematrice e macchiato sul fondo della membrana. Le cellule saranno adeguatamente quantificati e analizzati conseguenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. interpretazione dati per l'invasione con CS-FBS ± X. Questo schema illustra come i calcoli dell'Indice Invasion determinano le conclusioni sperimentali. CS-FBS è il siero carbone-spogliato e X si riferisce alle singole componenti aggiunti ai media CS-FBS descritti nel testo. Gli autori impostare la deviazione standard (sd), come la variabilità accettato causa di un errore sperimentale nelle nostre condizioni. Tuttavia, a seconda delle condizioni in osservazione e il numero di repliche, questo fattore può essere regolata per essere nell'intervallo statalistaimportanza iCal per il ricercatore. L'esperimento può essere ripetuto con più molecole "X", (indicata come X 1 + X 2 + X 3 ...). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. i risultati del test di invasione. Il grafico mostra i risultati sperimentali ottenuti con un mutante linea cellulare variante 3 stabilito dal 1205Lu cellule di melanoma metastatico. Le concentrazioni degli ormoni aggiunti sono le seguenti: estrogeno (0,566 pg / ml), progesterone (0,001 ng / ml), l'ormone tiroideo (0,283 mg / dl). Il controllo, linea cellulare non invasivo utilizzato per questi esperimenti era WM793B. Questo esperimento è stato ripetuto 3 volte con risultati simili, e un grafico rappresentativo è mostrato.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS Cat # SH30068
Tabella 1. Esempi di intervalli di concentrazione di selezionare ormoni, fattori di crescita e citochine nei bovini e sieri umani. La differenza di concentrazione tra il 2% e il 2% FBS CS-FBS rappresenta la quantità aggiunta di raggiungere concentrazioni fisiologiche.
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Discussion
Metastasi tumorali è un processo a più fasi. Le cellule devono attraversare la membrana basale, intravasate in nessuna delle due il sistema linfatico o di sangue microvasi, in cui sono trasportati in siti distanti. Le cellule tumorali quindi stravaso e colonizzano in un macrometastasis 12. La progressione attraverso l'epitelio di transizione mesenchimale (EMT), invasione tumorale, e metastasi è stato migliorato dagli ormoni steroidei 13,14, fattori di crescita 15-18, e 19-21 citochine. Queste molecole sono così importanti per affrontare il percorso di segnalazione di progressione del tumore, che lo sviluppo di un test per affrontare il loro ruolo nel tumore potenziale invasivo è un passo importante verso decifrare le vie di segnalazione intricati.
Questo test di utilizzo di siero carbone-spogliato ha un vantaggio rispetto ai metodi esistenti perché mira a identificare la forza trainante per cui il tumore delle cellule migrano. Un test precedente hastato pubblicato utilizzando normali fibroblasti mammari primari in camere invasione. In questo studio, gli autori hanno usato mezzi carbone-spogliato e ha aggiunto di nuovo in camera di estrogeni Matrigel che non causano invasione come previsto dal momento che le cellule non erano cancerogeno. Tuttavia, la presenza di mezzi-macrofagi condizionata in presenza o assenza di estrogeni aumentato significativamente invasione e in misura simile 22. Mentre questo test era simile che ha usato saggi di invasione con siero carbone-spogliato in assenza o presenza di estrogeni, non era un saggio di tumore ed è stato diretto allo studio delle interazioni tra paracrini macrofagi e fibroblasti 22. Un altro test utilizzato supporti carbone-spogliato per mostrare che l'aggiunta di bassi livelli di estrogeni aumenta la proliferazione delle cellule del cancro al seno, ma ha causato resistenza agli inibitori delle chinasi 23. Il nostro studio è unico in quanto è un saggio di invasione applicabile a vari tipi di cellule tumorali progettati per studiare laeffetto dei singoli ormoni, fattori di crescita e citochine, da soli o in combinazione. Inoltre, fatta salva la letteratura disponibile, abbiamo determinato le concentrazioni di ormone necessario per aggiungere al siero carbone-spogliato di raggiungere livelli fisiologicamente rilevanti (Tabella 1). L'aggiunta del componente singolo, "X" a livelli normalmente presenti nel siero è un parametro critico del saggio. Mentre questo test può sembrare essere limitato dai livelli pubblicati di ormoni, fattori di crescita e citochine nel siero, il ricercatore può utilizzare saggi ELISA per determinare i livelli di fattori addizionali.
Mentre il protocollo è specifico per l'utilizzo di collagene I, matrigel potrebbe anche essere sostituito se il ricercatore è stato sempre utilizzato quella matrice. La ragione preferiamo utilizzare collagene I è perché è un singolo componente che è definita ed è il principale componente del derma. Inoltre, utilizziamo 75 ml di 100 μg / ml di collagene per rendere la matrice invasione. Questo può anche essere modificato per ottenere i risultati desiderati. È migliore per ottimizzare la concentrazione in modo che un numero ragionevole di cellule può essere contato sui filtri. Se le cellule sono altamente invasiva, può essere meglio usare 100 ml di collagene I per la matrice o per aumentare la concentrazione di collagene. Anche se questa tecnica può aiutare lo sperimentatore di ottenere informazioni importanti, che è utile solo se le cellule tumorali invadono verso un chemoattractant che viene rimosso dal carbone-strippaggio del siero. Se non vi è alcuna differenza tra i risultati di controllo e siero di carbone-spogliato, quindi il test non varrebbe la pena perseguire. Il saggio affronta anche i risultati per chemioattrattanti individuali e soppressori di chemiotassi. Inoltre, nel confronto dei possibili risultati (figura 3), abbiamo utilizzato la deviazione standard come il livello di errore sperimentale accettato per ogni esperimento. Tuttavia, l'attuale values possono essere determinate dallo sperimentatore in base alla deviazione standard o errore standard e un valore significativo p.
Inoltre, le informazioni raccolte da questo test potrebbe rivelarsi utile nella progettazione di inibitori farmacologici a determinate vie di segnalazione. Per esempio, se una o più ormoni, fattori di crescita, citochine e / o si trova ad essere implicati nel meccanismo di invasione per una particolare mutazione cellula tumorale, che un agente farmacologico esistente può essere usato o un nuovo farmaco progettato per inibire quel percorso. Il test è anche uno strumento efficace per lo studio della particolare mutazione tumore e se modifica il residuo amminoacidico o la sua posizione mantiene la stessa affinità per il fattore chemiotattico che è stato identificato da questo test. In questo modo, la nostra dosaggio offre un nuovo approccio per fornire indizi al meccanismo invasione delle cellule tumorali e possibilmente metodi per prevenire l'invasione tumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
