Abstract
Blutserum dient als chemoattraktive, auf das Krebszellen wandern und dringen, die Erleichterung ihrer Intravasation in Mikrogefäßen. Jedoch sind die tatsächlichen Moleküle zu dem die Zellen wandern bleiben ungeklärt. Diese modifizierte Invasion Assay wurde entwickelt, um Ziele, die Zellmigration und Invasion fahren zu identifizieren. Dieses Verfahren vergleicht die Invasion Index unter drei Bedingungen, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin spielt eine Rolle bei der Vermittlung des invasiven Potentials einer Krebszelle. Zu diesen Bedingungen gehören i) normale fetale Rinderserum (FBS), ii) Holzkohle-beraubt FBS (CS-FBS), die Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine und iii) CS-FBS + Molekül entfernt (bezeichnet "X"). Eine wesentliche Änderung der Zellinvasion mit CS-FBS im Vergleich zu FBS, zeigt die Beteiligung von Hormonen, Cytokinen oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Veränderung. Einzelne Moleküle können dann zurück zu CS-FBS zugegeben, um ihre Fähigkeit zur Wieder AssayVers oder retten die Invasion Phänotyp. Ferner können zwei oder mehr Faktoren kombiniert werden, um die additive oder synergistische Effekte mehrerer Moleküle in Fahrt oder Hemmen Invasion bewerten. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren den Prüfer, um festzustellen, ob Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren spielen eine Rolle bei der Zellinvasion durch als Chemoattraktantien oder Inhibitoren Invasion für einen bestimmten Typ von Krebszelle oder einer bestimmten Mutante dient. Durch die Identifizierung von spezifischen Lockstoffe und Inhibitoren, kann dies geändert Invasionstest helfen, aufzuklären Signalwege, die Invasion von Krebszellen zu lenken.
Introduction
Eine neuartige Invasionstest wurde mit dem Ziel der Identifizierung der Einbeziehung spezifischer Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren als Chemoattraktantien in Invasion von Krebszellen entwickelt. Die Fähigkeit der Tumorzellen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) einzudringen ist ein Markenzeichen der metastatischen Phänotyp 1-3. Invasionskammern wurden intensiv als in vitro-Werkzeuge zur Invasion von Krebszellen und die Migration zu untersuchen und möglicherweise Kenntnis über die Mechanismen der in vivo Tumorinvasion und Metastasenbildung bereitzustellen. Die Kammern bestehen aus zylindrischen Zellkultureinsätze in die Vertiefungen von Zellkulturplatten verschachtelt sind. Die Unterseiten der Einsätze semipermeablen Polycarbonat- oder Polystyrolmembranen definierte Porengrößen.
In der Standard-Invasion Assay werden die Zellen auf den Einsatz Membran mit serumfreiem Medium ausgesät und in Zellkulturschalen, die mit Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe gefüllt werden aufgestellt, um set up a chemoattractive Kraft. Diese Kraftantriebe Zellen durch die halbdurchlässige Membran (Migration) bewegen, oder alternativ, durch eine Beschichtung aus extrazellulären Matrix (Invasion), die dann unter Verwendung herkömmlicher Farbstoffe zum Nachweis und zur Quantifizierung der Anzahl von Zellen angefärbt werden können. Die Zellzahl wird dann entsprechend dem Ausmaß der Migration und Invasion in einer nichtinvasiven Zelllinie normalisiert. Dieses Verfahren ermöglicht ein Ermittler die invasive Potential von verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich genetische Manipulationen zu bewerten.
Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren sind kritische Komponenten von Serum und werden zunehmend gezeigt, dass mit einem Antrieb des invasiven Phänotyps 4 zugeordnet werden. Allerdings ist die Art, Aufgaben und Spezifität dieser chemoattractive Serum-Moleküle bei der Vermittlung Invasion nach wie vor schwer. Die Herausforderung bleibt, zu bestimmen, welche spezifischen Faktoren in Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe für den Antrieb zuständig sindInvasion von Krebszellen als auch, was Moleküle können die Invasion Prozess hemmen. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, um die mögliche Beteiligung von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren im Serum zu bewerten, wie Moleküle Antrieb der Chemoattraktion und Invasion von Krebszellen.
Bei diesem vorgeschlagenen modifizierten Protokoll wird verwendet, um Holzkohle Strippen Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren von 2% fötalem Rinderserum (FBS) zu entfernen, um 2% Aktivkohle gereinigt FBS (CS-FBS) zu erzeugen. Sowohl 2% FBS und 2% CS-FBS als Mittel verwendet zum Einrichten der chemoattractive Kraft Invasion von Krebszellen zu fahren. Verwendung von 2% CS-FBS als chemoattractive Mittel im Vergleich zu normalen 2% FBS bietet mehrere Vorteile, einschließlich erster und am deutlichsten, die Möglichkeit, das Krebsinvasion Phänotyp in dem reduzierten / relative Abwesenheit von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Er ermöglicht auch die Prüfer, ob gemeinsamen Entfernung von Hormonen, Wachstumsfaktoren zu beurteilen und cytokines bewirkt eine Zunahme oder Abnahme der invasive Index. Der Assay wird dann entwickelt, um zu bestimmen, ob die Zugabe einer einzelnen Komponente, die als "X" bezeichnet hemmen, Senkung, Erhöhung oder Wiederherstellung der invasive Index auf den ursprünglichen Wert (siehe 2 und 3). Obwohl diese Methode ist spezifisch für das Erreichen der physiologischen Konzentrationen der Komponente, die aus dem Serum während Kohledestillation entfernt wird, sollte auch beachtet werden, dass Kohle Abstreifen kann auch Auswirkungen auf Signaltransduktionswege werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Kohle Strippen kann die alkalische Phosphatase-Aktivität der Knochenvorläuferzellen zu verringern und induzieren Adipogenese durch Reduktion von MAPK Aktiva 5. Aktivkohle gereinigt Medien sind im Handel erhältlich und auf dem Protokoll basiert umrissen, damit kombiniert Kohle mit Dextran und mit fötalem Rinderserum O / N 6 inkubiert.
Dieser Test wurde in respo entwickeltnse zu einem Ergebnis von Zucker et al. 7 berichteten die Autoren gezeigt, dass eine mutierte Phänotyp beeinflussen gap junction Kommunikations zeigten eine Zunahme bei der Invasion Index bei der Migration in Richtung Medien normales 2% FBS. Dieser Anstieg wurde mit dem Ersatz von Holzkohle-gestrippt Serum eliminiert. Aus diesem Ergebnis schlossen die Autoren, dass diese Mutante betroffen Migration in Richtung eines lipophilen Moleküls (genauer gesagt, ein Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin) 7. Es ist bekannt, daß Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine vermitteln Signalwege in Tumorpromotion und Invasion 4 beteiligt. Daher ist es wichtig, für wissenschaftliche Forscher, um festzustellen, was Faktor (en) treiben die Tumorinvasion ihrer besonderen Krebszellen oder Mutanten untersucht. Der Test wurde entwickelt, um die Rolle der einzelnen Komponenten auf den physiologischen Konzentration ansprechen als entsprechend der Differenz zwischen der Konzentration der Komponente bestimmt und# 8220; X "in normalen FBS und der CS-FBS. Durch die Entwicklung dieses Assays können Forscher mehr Einblick in die spezifische invasiven Weg zur Regelung ihrer System zu erlangen.
Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine sind oft als Tumorpromotoren 8 klassifiziert. Einige dieser Faktoren wie EGF als direkte Quellen für chemische Lockstoffe in Invasionskammern 9 verwendet. So scheint es wahrscheinlich, dass diese stellen die Hauptkomponenten des Serums, dass direkte Tumorinvasion. Dieses Protokoll schlägt eine einfache, aber bedeutenden, Modifikation der herkömmlichen in vitro-Invasionstest, der ein Ermittler die Beteiligung von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Vermittlung der invasive Potential von Tumorzellen zu bewerten gestattet. Jedoch wird der Assay entwickelt, um dem Prüfer eine Antwort auf die Frage, ob das Verfahren wird in einem frühen Schritt in der Analyse wirksam für ihre Studie liefern, um nicht wertvolle Zeit und r verwendenESSOURCEN wenn nicht notwendig erachtet. Bei dieser Methode wird CS-FBS und stützt sich auf die Ermittler Ermessen, die als Lead-Kandidaten, die möglicherweise vermitteln Invasion von Krebszellen zu verfolgen Moleküle. Die Ergebnisse aus diesen Analysen erweisen sollte, bei der Identifizierung, welche Serumkomponenten dienen als Chemoattraktantien oder Inhibitoren für die bestimmte Zelllinie oder Mutante untersucht werden. Darüber hinaus kann dieser Ansatz hilft der Forscher identifizieren Schlüsselsignalwege entweder fördern oder zu hemmen Invasion von Krebszellen; damit die Leitung zukünftige Entwicklung von Arzneimitteln.
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Protocol
1. Bereiten Sie die verschiedenen Medien und Zusatzkomponenten
- Vor experimentieren, bereiten Medien aus DMEM oder andere spezifizierte Medien mit der Zugabe von entweder normalen FBS, Aktivkohle gereinigt FBS oder Aktivkohle gereinigt FBS sowie die Komponente zu testen. Man beachte, dass mehrere Komponenten können in jedem Experiment getestet werden.
- Abzuwiegen und verdünnt die Hormone, Wachstumsfaktoren oder Cytokine in geeigneter Weise in der Aktivkohle gereinigt Serum bei der physiologischen Konzentration gelöst werden.
2. Bereiten Sie die Kollagenmatrix on Ice
- Planen 2 ml Kollagen I Matrix bei 2,2 mg / ml durch Zugabe der folgenden sterilfiltriert Komponenten auf Eis: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 ul 1 N NaOH, 600 ul bidestilliertes H 2 O und 1,2 ml Kollagen I (bei 3,63 mg / ml).
- Halten Kollagen I-Lösung auf Eis, bis bereit, zu plattieren.
3. Bereiten Sie die Migration / Invasion Platten für Assay </ P>
- Für jede zu testende Zelllinie, verwenden Sie eine 24-Well-Kammerplatte, in der 12-Mulden enthalten Einsätze. Mit den zusätzlichen 12 Brunnen, die Einsätze nicht enthalten, zum Addieren der chemoattractant Medien und die Übertragung der Einsätze für den Versuchsaufbau.
HINWEIS: Ein Kollagenmatrix auf Platten mit einem Polyethylenterephthalat (PET) Membran und 8 & mgr; m Porengröße ist optimal für die Zelllinien verwenden hier. Jedoch kann eine Matrigel-Matrix in vorbeschichteten Platten auch mit der Porengrße verringert entsprechend die Zelllinie untersucht, ausgewechselt werden. - Eindeutig zu kennzeichnen die Platte, mit 3 Vertiefungen pro Zustand analysiert (FBS Migration, CS-FBS Migration, FBS Invasion und CS-FBS Invasion sowie FBS-Migration für eine Kontrolle, nicht-invasive Zelllinie). Assay Migration durch Bewegung durch Poren in einem PET-Membran und Assay Invasion durch Bewegung durch eine Collagen oder Matrigel-Matrix und dann durch die Poren in der Membran. Verwenden Sie unterschiedliche Farbmarkierungen für jede Zelle Zustand einID im Beschichtungsprozess.
4. Pipettieren Sie die Invasion Matrix
- Beim Pipettieren der 75 ul der Kollagenmatrixlösung in die Einsätze für Invasionsassays verwendet werden. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Disperse Blasen durch Anlegen eines invertierten Pipettenspitze auf die Oberfläche.
- Übertragen die Platte mit den Kollagen-beschichteten Einsätze zu einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 30 min, um das Gel zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
5. Platte die Zellen auf der Membran oder Matrix-Invasion
- Inzwischen trypsinieren Zellen und fügen Sie Medien mit 10% FBS. Spin-Zellen bei 200 xg für 5 min auf einer Tischzentrifuge und spülen 3x in serumfreiem Medium.
- Resuspendieren in serumfreiem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierte Diaschau-Zähler. Hinzufügen serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml.
- Wenn die Kollagenmatrix (nach 30 min) verfestigt wird, fügen 700 ul Medium mit entweder2% definiert FBS oder Holzkohle-beraubt FBS in jede Vertiefung. Von den 12 Einsätzen pro Platte:
- 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS
- 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS CS-
- 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS
- 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS CS-
- Verwendung zusätzlicher Platten in Abhängigkeit von der Zahl der Faktoren, die getestet und mit einem nicht Kollagen Steuerung entsprechend jedem Zustand.
- In Zellsuspension auf die Einsätze bei 5 × 10 4 Zellen / ml, Überzug 500 ul Zellen pro Einsatz in allen Migration und Invasion Einsätze.
- Die Zellen für 22 Stunden bei 37 ° C.
6. Quantifizierung der Anzahl der Migration und eindringenden Zellen
- Richten Färbung von Brunnen mit Methanol Fixiermittel, Eosin und Hämotoxylin, in getrennten Vertiefungen.
- Verwenden Sie Wattestäbchen, um Zellen und Matrix aus jeder Vertiefung entfernen.Rrepeat mit zweiten Tupfer Anwendung für jede Vertiefung.
- Mit einer Pinzette, tauchen jedes Einsatzes 5 Mal für 1 Sekunde in jeder der 3-Lösungen in Folge.
- Lassen Einsätze trocknen O / N.
- Entweder i) Filter entfernen mit einem Skalpell, Schneiden sorgfältig an den Rändern und montieren auf einem Objektträger mit Deckglas und Immersionsöl, oder ii) erlauben die Einsätze trocknen O / N invertiert und verwenden Sie die Einsätze direkt für die Mikroskopie.
- Am nächsten Tag sehen können Dias oder Einsätze unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv und nehmen Sie sich 5 Bildern aus verschiedenen Regionen des Filters. Um die Konsistenz zu verbessern, nehmen 4 äußeren Feldern und einem Zentrum.
- Zählen von Zellen für alle Bedingungen mit der ImageJ Software und beziehen sich auf die nachstehenden Formeln.
- Bestimmen Sie die Prozent-Invasion, wie folgt:
Die mittlere Anzahl der Zellen eindringende durch Kollagen I einfügen = a
Die mittlere Anzahl der Zellen, die Migration durch Steuerung Einsatz = b
% Invasion = (a / b) · 100 - Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% FBS, wie folgt:
% Invasion von Zellen (in 2% FBS) getestet = c
% Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% CS-FBS wie folgt:
% Invasion von Zellen (in 2% CS-FBS) = e getestet
% Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% CS-FBS) = f
Invasion Index (CS-FBS) = (e / f)
7. Wiederholen Sie die Versuchsprotokoll Vergleichen von Holzkohle-beraubt FBS auf Holzkohle-beraubt FBS + X n mit mehreren Faktoren zusammen
- Wiederholen Sie diese Prozedur mehrmals bei Bedarf mit verschiedenen Komponenten für "X" oder einer Kombination von Komponenten.
- Übernehmen Sie die Berechnungen, um den Beitrag der einzelnen Faktoren "X", um die Migration und Invasion Auswirkungen zu bestimmen.
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Representative Results
Die Invasion Index wird für jede Bedingung nach Normalisierung auf eine nicht-invasive Zelllinie berechnet. Für unsere Experimente verwenden wir den 1205Lu Melanomzelllinie und etablierte Variante stabile Zelllinien wie unsere invasive Leitungen sowie die Vorstufen noninvasive Variante WM793, aus dem die Zellen stammen 1205Lu 10, die als eine logische Steuerung dient. Wir verwenden auch Kollagen I nach der Invasion Matrix, denn das ist die primäre Komponente der Dermis. Dies ist in Übereinstimmung mit einer vorangegangenen Studie, wodurch die optimale Invasion Matrix variiert in Abhängigkeit von der Zelllinie basiert, und das Ausmaß der Übereinstimmung mit in vivo-Ergebnisse 11. Diese Invasion Assay ist schematisch nach den möglichen Ergebnissen der Forscher könnte erhalten skizziert. Zunächst sollten die Invasion Index für 2% FBS deutlich höher oder niedriger als die Invasion Index für CS-FBS, um diesen Test (Abbildungen 1 und 2) zu verfolgen. Wenn eine signifikante increrleichtern oder Abnahme der Invasion Index zeigt sich mit Holzkohle-beraubt FBS, ist dieser Test nicht geeignet für die Ermittler (Abbildungen 2 und 3). Wenn dieser Anstieg wird mit Holzkohle-gestrippt FBS beseitigt werden, ist der Prüfer schon die Erkenntnis, dass die verbesserte Invasion ist auf ein Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin (Figuren 2 und 3) gerichtet ist. Danach muss der Ermittler Informationen über die spezifischen Tumortyp und Mutation, die Kandidaten (n) vorhanden plausible Mechanismen wie Lockstoffe bestimmen zu nutzen. Der Prüfer kann durch eine oder mehrere Komponenten einzeln versucht bei der physiologischen Konzentration beginnt, indem das Bauteil in der Konzentrationsunterschied zwischen 2% FBS und 2% CS-FBS (Tabelle 1). Wenn eine Komponente, um Holzkohle-gereinigten Serum hinzugefügt erhöht der verringert die Invasionspotential gegenüber dem Holzkohle-gereinigten Serum allein, dass Kandidaten, "X" kann als Teil- oder dienenkomplette Ersthelfer in Abhängigkeit vom Ausmaß der Erhöhung (Figuren 2 und 3). Zwei oder mehrere Komponenten können kombiniert werden, um eine additive oder synergistische Steigerung zu erreichen, (bezeichnet als X 1 + X 2 + X 3, ...) (Abbildung 3). Ein Faktor, der das Ausmaß der Invasion verringert würde als hemmender Faktor (- 4 Fig 2) klassifiziert werden. In unseren Experimenten haben wir gezeigt, dass die Verwendung eines mutierten Melanomzellinie (1205Lu T154A) Migration hin zu einem Chemoattraktor mit Hormonen, Wachstumsfaktoren und Cytokine entnommen verursachte eine Abnahme Tumorinvasivität. Drei Hormone wurden getestet, um eine mögliche "X" zu identifizieren. Dazu gehören Östrogen (Östradiol), Progesteron und Schilddrüsenhormon (T4). Zwei dieser Hormone hatte keine Wirkung auf die Invasion Index (Progesteron und Schilddrüsenhormon), während Östrogen wurde wie in Hemmfaktor (Abbildung 4) identifiziert. Nach Angaben der möglichen Ergebnisse aufgeführt3 sind die experimentellen Ergebnisse in diesem Beispiel zeigen, eine Abnahme Bedingung 2 und eine Hemmung Bedingung 3. Es ist wahrscheinlich, dass Östrogen wird weiter in diesem Assay verwendet werden, da sie in der Identifizierung von Bahnen, die bestimmte Signalfaktoren zu maskieren wichtig sein für die künftige Entwicklung von Arzneimitteln Strategien. Weitere Experimente werden auf Wachstumsfaktoren und Zytokine gerichtet werden, um andere Komponenten, die als "Phänotyp retten" pro-Invasion Lockstoffe dienen können, zu identifizieren. Bezeichnung der beiden pro-invasive und hemmenden Moleküle können gemeinsam erläutern die invasive Potenzial für die Zelllinien und mutierte Varianten untersucht.
Abbildung 1. Experimenteller Aufbau und Design. Modell für die experimentelle Verfahren zeigt; Zellen entweder auf die PET-Membran direkt oder c die Einrichtungollagen Schicht in serumfreiem Medium. Die Zellen werden entweder Migration oder Invasion durch die Kollagenmatrix zu einer chemoattraktive, die nach dem Protokoll geändert wird und als Bedingung 1, 2, und 3. Die migrierten oder überfallen Zellen werden dann fixiert und gefärbt. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.
Abbildung 2. Mögliche Ergebnisse von einem Standard-Invasion Assaymembran Ergebnis. Dieses Modell zeigt die möglichen Ergebnisse, dass der Prüfer kann für die Invasion Assay und wie diese Ergebnisse zu interpretieren begegnen. Jeder Kreis ist ein repräsentatives Ergebnis für einen gefärbten Filter unter Verwendung der gleichen Bedingungen, die 3 in Figur 1 skizziert sind. Jeder Punkt steht für eine Zelle, die durch die Invasion passiert hatMatrix und auf der Unterseite der Membran angefärbt. Die Zellen würden angemessen quantifiziert und entsprechend ausgewertet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Zur Interpretation der Daten für die Invasion mit CS-FBS ± X. Diese Übersicht beschreibt, wie die Berechnungen der Invasion Index bestimmen die experimentellen Ergebnissen. CS-FBS ist die Holzkohle-gestrippt Serum und X bezieht sich auf die Einzelkomponenten zu den im Text beschriebenen CS-FBS-Medium zugegeben. Die Autoren stellen Sie die Standardabweichung (sd) als akzeptiert Variabilität durch experimentelle Fehler in unseren Bedingungen. In Abhängigkeit von den Bedingungen, unter Beobachtung und der Anzahl der Wiederholungen, kann dieser Faktor auf einen Wert im Bereich von Statist seinsche Bedeutung für die Ermittler. Das Experiment kann mit mehreren "X" Moleküle wiederholt werden (bezeichnet als X 1 + X 2 + X 3, ...). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Invasion Assay-Ergebnisse. Dieses Diagramm zeigt die bei Verwendung einer Mutante von 1205Lu metastasierten Melanomzellen etablierten Variante Zelllinie 3 erhaltenen Versuchsergebnisse. Die Konzentration der zugesetzten Hormone sind: Östrogen (0.566 pg / ml), Progesteron (0,001 ng / ml), Schilddrüsenhormon (0,283 & mgr; g / dl). Die Steuerung, nicht-invasive Zelllinie für diese Experimente verwendet wurde, war WM793B. Dieses Experiment wurde 3 mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt, und ein repräsentativer Graph gezeigt.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS cat # SH30068
Tabelle 1. Beispiele für Konzentrationsbereiche der Auswahl Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokinen in Rinder- und Humanserum. Die Konzentrationsdifferenz zwischen 2% FBS und 2% CS-FBS stellt die Menge hinzugefügt, um physiologische Konzentrationen zu erreichen.
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Discussion
Tumormetastasen ist ein mehrstufiger Prozess. Die Zellen müssen über die Basalmembran zu brechen, intravasate entweder in das Lymphsystem oder Blutmikrogefäße, in denen sie an entfernten Stellen transportiert werden. Die Tumorzellen dann extravasieren und zu kolonisieren in eine macrometastasis 12. Progression durch die Epithelzellen zu mesenchymale Transition (EMT), Tumorinvasion und Metastasierung wurde von Steroidhormonen 13,14 erweitert, Wachstumsfaktoren von 15 bis 18, 19 bis 21 und Zytokine. Diese Moleküle sind so kritisch zur Bewältigung des Signalwegs von Tumorprogression, dass die Entwicklung eines Assays, ihre Rolle bei der Tumorinvasionspotential zu adressieren ist ein wichtiger Schritt zur Entschlüsselung der komplizierten Signalwege.
Dieser Assay der Verwendung von Holzkohle-gestrippt Serum hat einen Vorteil gegenüber bestehenden Verfahren, weil sie darauf abzielt, die Antriebskraft auf die an das Tumor-Zellen migrieren zu identifizieren. Ein vorheriger Test hatwurde unter Verwendung von normalen primären Brust Fibroblasten in Invasion Kammern veröffentlicht. In dieser Studie verwendeten die Autoren anthrazit beraubt Medien und in Matrigel Kammern, die nicht verursacht haben Invasion als erwartet, da die Zellen nicht tumorigenen hinzugefügt zurück Östrogen. Jedoch ist das Vorhandensein von Makrophagen-konditioniertem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von Östrogen erhöhte Invasion wesentlich und in einem ähnlichen Umfang 22. Während dieser Assay war ähnlich, dass es verwendet Invasionsassays mit Holzkohle-gestrippt Serum in Anwesenheit oder Abwesenheit von Östrogen, es war kein Tumorprobe und wurde bei der Untersuchung der parakrinen Interaktion zwischen Makrophagen und Fibroblasten 22 gerichtet. Ein weiterer Assay verwendet Kohle-gestrippt Medien zu zeigen, dass die Zugabe von geringen Mengen von Östrogen die Proliferation von Brustkrebszellen, aber verursacht Resistenz gegenüber Inhibitoren 23 Kinase. Unsere Studie ist einzigartig, da es sich um eine Invasion Assay für verschiedene Arten von Krebszellen entwickelt, um das StudiumWirkung einzelner Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine, entweder allein oder in Kombination. Darüber hinaus unterliegt der verfügbaren Literatur haben wir die Konzentration des Hormons notwendig ermittelt, um die Holzkohle-gereinigten Serum in den physiologisch relevanten Ebenen (Tabelle 1) zu erzielen. Die Zugabe der einzelnen Komponenten, "X" in Mengen normalerweise im Serum ist ein kritischer Parameter des Assays. Während dieser Assay kann scheinen von den veröffentlichten Konzentrationen von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Zytokine im Serum beschränkt ist, kann der Prüfer ELISA Assays verwenden, um die Pegel der zusätzlichen Faktoren zu bestimmen.
Während das Protokoll ist spezifisch für Verwendung von Kollagen I, konnte Matrigel auch, wenn der Ermittler wurde konsequent mit dieser Matrix ersetzt werden. Der Grund bevorzugen wir, Kollagen I zu verwenden ist, weil es sich um eine einzelne Komponente, die definiert ist, und ist der Hauptbestandteil der Dermis. Darüber hinaus verwenden wir 75 ul 100 μg / ml Kollagen, um die Invasion Matrix zu machen. Dies kann auch modifiziert werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Es ist am besten, um die Konzentration zu optimieren, so dass eine vernünftige Anzahl von Zellen auf den Filtern gezählt. Wenn die Zellen sehr invasiv, kann es besser sein, um 100 ul von Kollagen I für die Matrix zu verwenden oder die Kollagen-Konzentration erhöhen. Während diese Technik kann dazu beitragen, die Forscher erhalten wichtige Informationen, ist es nur sinnvoll, wenn die Tumorzellen in Richtung einer chemoattraktive, die von der Holzkohle-Strippen des Serum entfernt dringt. Wenn es keinen Unterschied zwischen den Ergebnissen für die Steuerung und Holzkohle-gereinigten Serum, dann ist der Test wäre nicht wert, verfolgt. Der Test richtet sich auch die Ergebnisse für die einzelnen Lockstoffe sowie Unterdrücker der Chemotaxis. Ferner wird in den Vergleich der möglichen Ergebnisse (Figur 3), verwendeten wir die Standardabweichung der Höhe der angenommen experimentellen Fehlers für jedes Experiment. Allerdings betrug die tatsächliche valUES kann vom Prüfer auf der Grundlage der Standardabweichung oder Standardfehler und eine signifikante p-Wert bestimmt werden.
Außerdem könnte die Information aus diesem Assay entnommen, die bei der Gestaltung von pharmakologischen Inhibitoren bestimmter Signaltransduktionswege nachzuweisen. Zum Beispiel, wenn ein oder mehrere Hormone, Wachstumsfaktoren und / oder Zytokinen festgestellt wird, bei der Invasion Mechanismus für einen bestimmten Tumorzelle Mutation beteiligt sein, als eine vorhandene pharmakologische Mittel kann verwendet werden, oder ein neues Arzneimittel entwickelt, um diesen Weg zu verhindern. Der Assay ist auch ein wirksames Werkzeug für die Untersuchung der bestimmten Tumor Mutation und ob die Änderung der Aminosäurerest oder seine Position behält die gleiche Affinität zu dem Chemoattraktor, die durch diesen Assay identifiziert wurde. Auf diese Weise bietet unser Test einen neuen Ansatz, um Hinweise über den Mechanismus der Invasion von Krebszellen und möglicherweise Methoden zur Tumorinvasion zu verhindern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
