Abstract
Blood serum fungerer som en chemoattractant mod hvilken kræftceller migrere og invadere, lette deres intravasation i mikrokar. Men de faktiske molekyler mod hvilken cellerne migrerer forblive undvigende. Denne modificerede invasion assay er blevet udviklet til at identificere mål, der driver cellemigration og invasion. Denne teknik sammenligner invasionen indeks på tre betingelser for at afgøre, om en bestemt hormon, vækstfaktor eller cytokin spiller en rolle i formidlingen af invasive potentiale en kræftcelle. Disse betingelser omfatter i) normalt bovint serum føtal (FBS), ii) kul-strippet FBS (CS-FBS), der fjerner hormoner, vækstfaktorer og cytokiner og iii) CS-FBS + molekyle (betegnet "X"). En væsentlig ændring i celle invasion med CS-FBS sammenlignet med FBS, indikerer inddragelse af hormoner, cytokiner eller vækstfaktorer i mediering ændringen. Enkelte molekyler kan derefter tilsættes tilbage til CS-FBS at analysere deres evne til at revers eller redde invasionen fænotype. Desuden kan to eller flere faktorer kombineres for at vurdere tilsætningsstoffet eller synergistiske virkninger af flere molekyler i at køre eller hæmme invasion. Samlet set denne metode gør det muligt for undersøgeren at afgøre, om hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer spiller en rolle i celle invasion ved at tjene som kemoattraktanter eller inhibitorer af invasion for en bestemt type kræft celle eller en specifik mutant. Ved at identificere specifikke kemoattraktanter og inhibitorer, kan det modificerede invasion assay være med til at belyse signalveje, der styrer kræftcelle invasion.
Introduction
En roman invasion assay er udviklet med det formål at identificere inddragelse af specifikke hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer som kemoattraktanter i kræftcelle invasion. Evnen af tumorceller til at invadere gennem den ekstracellulære matrix (ECM) er kendetegnende for den metastatiske fænotype 1-3. Invasion kamre er blevet flittigt brugt som in vitro værktøjer til at studere kræftcellen invasion og migration og kan give viden om de mekanismer in vivo tumor invasion og metastase. Kamrene består af cylindriske cellekultur skær indlejret i brøndene i cellekulturplader. Bunden af skær er semipermeable polycarbonat eller polystyren membraner af definerede porestørrelse.
I standard invasion assay podes celler på indsatsen membran med serumfrie medier og anbringes i cellekultur brønde, der er fyldt med serum eller serum-lignende kemoattraktanter til Set en chemoattractive kraft. Denne kraft drev celler at bevæge sig gennem den semipermeable membran (migration) eller alternativt via en coating af ekstracellulær matrix (invasion), som derefter kan farves under anvendelse af konventionelle farvestoffer til at detektere og kvantificere antallet af celler. Celleantallet derefter normaliseret i forhold til omfanget af migration og invasion i en noninvasiv cellelinie. Denne metode giver en investigator at evaluere den invasive potentiale af forskellige celletyper under en række betingelser, herunder genetiske manipulationer.
Hormoner, cytokiner og vækstfaktorer er kritiske komponenter i serum og i stigende grad vist sig at være forbundet med at drive den invasive fænotype 4. Men naturen, rolle og specificitet af disse chemoattractive serum molekyler i at mediere invasion stadig undvigende. Udfordringen er fortsat at afgøre, hvilke specifikke faktorer i serum eller serum-lignende kemoattraktanter er ansvarlige for kørselcancer cell invasion samt hvad molekyler kan inhibere invasionen processen. I denne rapport beskriver vi en metode til at vurdere den potentielle inddragelse af hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer til stede i serum, som molekyler driver chemoattraktion og invasion af kræftceller.
I dette forslag modificeret protokol, er trækul stripping bruges til at fjerne hormoner, cytokiner og vækstfaktorer fra 2% føtalt bovint serum (FBS) for at generere 2% trækul strippet FBS (CS-FBS). Begge 2% FBS og 2% CS-FBS anvendes som agenter til at oprette chemoattractive kraft til at drive kræftcelle invasion. Anvendelse af 2% CS-FBS som chemoattractive middel i sammenligning med normal 2% FBS giver flere fordele, herunder første og mest fremtrædende, evnen til at studere invasion cancer fænotype i reduceret / relative mangel på hormoner, cytokiner og vækstfaktorer. Det giver også investigator at vurdere, om den kollektive fjernelse af hormoner, vækstfaktorer, og cytokines forårsager en stigning eller et fald i den invasive indeks. Assayet derefter udformet til at bestemme, om tilsætning af en enkelt komponent, der betegnes som "X" kan hæmme, falde, stige eller gendanne den invasive indeks til den oprindelige værdi (se figur 2 og 3). Selv om denne metode er specifik for at opnå de fysiologiske niveauer af den komponent, der er fjernet fra serum under trækul stripping, bør det også bemærkes, at trækul stripping også kan påvirke signaltransduktionsveje. For eksempel er det blevet rapporteret, at trækul stripning kan nedsætte alkalisk phosphatase aktivitet osteoprogenitorceller celler og inducere adipogenese ved reduktion af MAPK aktivatorer 5. Trækulstrippet medier er kommercielt tilgængelige og er baseret på protokollen beskrevet, der kombinerer kul med dextran og inkuberet med føtalt bovint serum O / N 6.
Dette assay blev udviklet i RespoNSE til et resultat rapporteret af Zucker et al. 7 Forfatterne viste, at en mutant fænotype påvirker gap junction kommunikation påvist en stigning i invasion indeks, når migrerer mod medier med normal 2% FBS. Denne stigning blev elimineret med substitution af kul-strippet serum. Fra dette resultat konkluderede forfatterne, at denne mutant påvirket migrering til et lipofilt molekyle (mere specifikt, et hormon, en vækstfaktor eller cytokin) 7. Det er velkendt, at hormoner, vækstfaktorer og cytokiner medierer signalveje, der er involveret i tumor fremme og invasion 4. Således er det vigtigt for videnskabelige forskere til at bestemme, hvilke (S) kører tumor invasion af deres særlige cancerceller eller mutanter under undersøgelsen. Assayet er designet til at løse den rolle af de enkelte komponenter på deres fysiologiske koncentration som bestemt i overensstemmelse med forskellen mellem koncentrationen af komponenten &# 8220; X "i normal FBS og CS-FBS. Gennem udvikling af denne analyse, kan efterforskerne få mere indsigt i det specifikke invasive vej vedrørende deres system.
Hormoner, vækstfaktorer og cytokiner er ofte blevet klassificeret som tumorpromotorer 8. Nogle af disse faktorer, såsom EGF anvendes som direkte kilder for kemoattraktanter i invasions kamre 9. Således er det sandsynligt, at disse repræsenterer de vigtigste komponenter i serum, der direkte tumor invasion. Denne protokol foreslår en enkel, men signifikant ændring af den konventionelle in vitro invasion assay, som tillader en investigator at vurdere inddragelse af hormoner, vækstfaktorer og cytokiner i mediering af invasive potentiale af kræftceller. Imidlertid er assayet designet til at give investigator med et svar på, om proceduren vil være effektiv for deres undersøgelse på et tidligt trin i analysen, således ikke at bruge kostbar tid og rESSOURCER hvis det skønnes unødvendigt. Denne metode bruger CS-FBS og er afhængig af efterforskere skøn med hensyn til hvilke molekyler forfølge som bly kandidater, der potentielt medierer kræftcelle invasion. Resultaterne fra disse analyser skulle vise sig at være nyttige til at identificere hvilken serumkomponenter tjene som kemoattraktanter eller inhibitorer for den særlige cellelinie eller mutant blive undersøgt. Desuden kan denne fremgangsmåde hjælpe investigator identificere centrale signalveje enten fremmer eller hæmmer kræft celle invasion; således lede fremtidige drug design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered forskellige medier og Yderligere komponenter
- Før eksperimentere forberede medier bestående af DMEM eller andre specificerede medier med tilsætning af enten normal FBS, trækul strippet FBS eller trækulstrippet FBS plus komponent, der skal testes. Bemærk, at flere komponenter kan afprøves i hvert forsøg.
- Afvej og fortyndes hormoner, vækstfaktorer eller cytokiner hensigtsmæssigt at blive opløst i trækul strippet serum ved fysiologisk koncentration.
2. Forbered kollagenmatrix on Ice
- Forbered 2 ml kollagen I matrix på 2,2 mg / ml ved tilsætning af følgende sterile filtrerede komponenter på is: 200 pi 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pi 1 N NaOH, 600 pi dobbelt destilleret H2O, og 1,2 ml kollagen I (på 3,63 mg / ml).
- Hold kollagen I løsning på is indtil klar til bord.
3. Forbered Migration / Invasion plader til Assay </ P>
- For hver cellelinie, der skal testes, skal du bruge en 24-brønds kammer plade, hvor 12-huller indeholder skær. Anvende den yderligere 12 brønde, som ikke indeholder skær til at tilføje de kemotiltrækkende medier og overføre skær til den eksperimentelle opsætning.
BEMÆRK: En collagenmatrix på plader med en polyethylenterephthalat (PET) membran og 8 um porestørrelse er optimal for cellelinier bruger her. Imidlertid kan en matrigel matrix i præcoatede plader også være substitueret med størrelsen pore faldt ifølge cellelinie, der undersøges. - Det er klart mærke pladen, med 3 brønde pr tilstand, der analyseres (FBS migration, CS-FBS migration, FBS invasion, og CS-FBS invasion samt FBS migrering, for en kontrol, noninvasiv cellelinie). Assay migration ved bevægelse gennem porer i en PET-membran og assay invasion ved bevægelse gennem et collagen eller Matrigel matrix og derefter gennem porerne i membranen. Brug forskellige farve markører for hver celle tilstand til enid i plating proces.
4. Dispenser invasionen Matrix
- Pipettere forsigtigt 75 pi af collagenmatrix opløsningen i indsatsene skal anvendes til invasion assays. Vær forsigtig for at undgå bobler. Disperse bobler ved at anvende et inverteret pipettespids til overfladen.
- Overfør pladen med collagen-coatede inserter til et 37 ° C og 5% CO2-inkubator i 30 min for at gøre det muligt for gelen at størkne.
5. Plate cellerne på membranen eller Invasion Matrix
- I mellemtiden Trypsinisér celler og tilføje medier med 10% FBS. Spin celler ved 200 xg i 5 minutter på en bordcentrifuge og skyl 3x i serumfrit medie.
- Resuspender i serumfrit medie. Tæl celler med et hæmocytometer eller automatisk slide tæller. Tilføj serumfrit medium til en endelig koncentration på 5 x 10 4 celler / ml.
- Når collagen matrix er størknet (efter 30 min), tilsættes 700 pi medier med enten2% definerede FBS eller kul-strippet FBS til hver brønd. Af de 12 indsatser per plade:
- 3 skær har kollagen og brønde med medier + 2% FBS
- 3 skær har kollagen og brønde med medier + 2% CS-FBS
- 3 skær har ingen kollagen og brønde med medier + 2% FBS
- 3 skær har ingen kollagen og brønde med medier + 2% CS-FBS
- Brug yderligere plader afhængigt af antallet af faktorer, der testes, og med en no kollagen kontrol svarende til hver tilstand.
- Tilføj cellesuspension til indsatserne på 5 x 10 4 celler / ml, plettering 500 celler gi pr insert i alle migration og invasion skær.
- Inkubér cellerne i 22 timer ved 37 ° C.
6. tal på det antal trækkende og indtrængende celler
- Opsætning farvning af brønde med methanol fiksativ, eosin og hemotoxylin, i separate brønde.
- Brug vatpinde til at fjerne celler og matrix fra hver brønd.Rrepeat med anden vatpind ansøgning for hver brønd.
- Med en pincet, dyppe hver indsats 5 gange i 1 sek i hver af de 3 opløsninger i rækkefølge.
- Lad skær tørre O / N.
- Enten i) fjern filtre med en skalpel, skæring omhyggeligt rundt om kanterne og montere på et dias med dækglas og fordybelse olie, eller ii) tillade indsatserne tørre O / N inverteret og bruge skærene direkte til mikroskopi.
- Den næste dag, se lysbilleder eller skær under et mikroskop med en 20X objektiv og tage 5 billeder fra forskellige områder af filteret. For at forbedre sammenhængen, tage 4 ydre felter og en center.
- Tæl celler til alle forhold ved hjælp af ImageJ software og gælder for nedenstående formler.
- Bestem procent invasion som følger:
Mean # af celler invaderer gennem collagen jeg sætter = a
Mean # af celler migrerer gennem kontrol insert = B
% Invasion = (a / b) * 100 - Bestem Invasion Index i 2% FBS på følgende måde:
% Invasion af celler, der analyseres (i 2% FBS) = C
% Invasion af kontrol- invasive celler i (2% FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Bestem Invasion Index i 2% CS-FBS som følger:
% Invasion af celler, der analyseres (i 2% CS-FBS) = e
% Invasion af kontrol invasive celler i (2% CS-FBS) = f
Invasion Index (CS-FBS) = (E / F)
7. Gentag forsøgsplan Sammenligning kul-strippet FBS til kul-strippet FBS + X n med flere faktorer kombineret
- Gentag proceduren flere gange efter behov ved hjælp af forskellige komponenter til "X" eller en kombination af komponenter.
- Påfør beregningerne at bestemme bidraget fra hver faktor "X" til migration og invasion effekter af.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Invasionen indeks beregnes for hver af betingelserne under normalisering til en noninvasiv cellelinje. For vores eksperimenter, vi bruger 1205Lu melanoma cellelinien og etableret variant stabile cellelinjer som vores invasive linier samt præmaligne noninvasive variant WM793 hvorfra 1205Lu celler blev afledt 10, der tjener som en logisk styring. Vi anvender også collagen I som invasionen matrix, fordi det er den primære bestanddel af dermis. Dette er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, hvorved den optimale invasion matrix varierer baseret på cellelinjen og omfanget af konkordans med in vivo resultater 11. Denne invasion assay skitseres skematisk efter de mulige resultater investigator kunne opnå. I første omgang bør invasionen indeks for 2% FBS være væsentligt højere eller lavere end invasionen indeks for CS-FBS for at forfølge denne analyse (figur 1 & 2). Hvis en betydelig incrlette eller fald i invasionen indeks fremgår med kul-strippet FBS, dette assay er ikke egnet til investigator (figur 2 og 3). Hvis denne stigning elimineres med kul-strippet FBS, investigator allerede har den viden, at den forbedrede invasion er rettet mod et hormon, vækstfaktor eller cytokin (figur 2 og 3). Derefter skal investigator udnytte oplysninger om den specifikke tumortype og mutation at afgøre, hvilken kandidat (er) til stede plausible mekanismer som kemoattraktanter. Investigator kan begynde ved at prøve en eller flere komponenter individuelt på den fysiologiske koncentration ved tilsætning af komponenten ved koncentrationen forskellen mellem 2% FBS og 2% CS-FBS (tabel 1). Hvis en komponent tilsat til kul-strippet serum øger af nedsætter invasion potentiale i forhold til kul-strippet serum alene, at kandidat, "X", kan tjene som en delvis ellerkomplet redningsmand afhængigt af omfanget af stigningen (figur 2 og 3). To eller flere komponenter kan kombineres for at opnå en additiv eller synergistisk forøgelse (benævnt X1 + X2 + X3 ...) (figur 3). En faktor, der reducerer omfanget af invasionen ville blive klassificeret som en hæmmende faktor (figur 2 - 4). I vores eksperimenter viste vi, at anvendelsen af en mutant melanoma cellelinie (1205Lu T154A) migrerer mod et kemotiltrækkende med sine hormoner, vækstfaktorer og cytokiner fjernet forårsagede et fald i tumorindtrængen. Tre hormoner blev testet for at identificere en mulig "X". Disse omfatter østrogen (estradiol), progesteron og thyroidhormon (T4). To af disse hormoner havde ingen virkning på invasion index (progesteron og thyroideahormon), mens østrogen blev identificeret som i inhibitorisk faktor (figur 4). Ifølge de mulige resultater, der er anført iFigur 3, de eksperimentelle resultater i dette eksempel vise et fald med Betingelse 2 og en inhibering med Condition 3. Det er sandsynligt, at østrogen yderligere vil blive anvendt i dette assay, da det kan være vigtigt i identifikation af veje, der sekvestrerer visse signalfaktorer for fremtidige drug design strategier. Yderligere forsøg vil være rettet mod vækstfaktorer og cytokiner at identificere andre komponenter, der kan tjene som "fænotype redning" pro-invasion kemoattraktanter. Identifikation af både pro-invasive og hæmmende molekyler kan kollektivt belyse invasive potentiale for cellelinjer og mutant varianter, der undersøges.
Figur 1. Eksperimentel opsætning og design. Model af sat op til den eksperimentelle proces viser celler udpladet enten på PET-membran direkte eller Collagen lag i serum frie medier. Cellerne er enten flytter eller invadere gennem kollagenmatrixen mod en chemoattractant der er modificeret i overensstemmelse med protokollen og beskrevet som Betingelse 1, 2, og 3. de migrerede eller invaderede celler bliver derefter fikseret og farvet. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 2. Potentielle resultater fra en standard membran resultat invasion assay. Denne model viser de mulige resultater, investigator kan støde for invasionen assay og hvordan man fortolker disse resultater. Hver cirkel er et repræsentativt resultat for en farvet filter ved anvendelse af de samme 3 betingelser, der er skitseret i figur 1. Hver prik repræsenterer en celle, der har passeret gennem invasionmatrix og farves på bunden af membranen. Cellerne vil blive behørigt kvantificerede og analyseres i overensstemmelse hermed. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. datafortolkning for invasion med CS-FBS ± X. Denne oversigt beskriver, hvordan beregningerne af invasionen Index bestemme de eksperimentelle konklusioner. CS-FBS er kul-strippet serum og X refererer til de enkelte komponenter tilsættes til CS-FBS medier, der er beskrevet i teksten. Forfatterne indstille standardafvigelsen (SD) som den accepterede variabilitet skyldes eksperimentelle fejl i vores betingelser. Men afhængigt af betingelserne under observation, og antallet af gentagelser, denne faktor kan indstilles til at være inden for området af etatistiskeical betydning for investigator. Forsøget kan gentages med flere "X" molekyler, (betegnet som X1 + X2 + X3 ...). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Invasion assayresultater. Denne graf viser de eksperimentelle resultater, der opnås ved brug af en mutant variant cellelinie 3 etableret fra 1205Lu metastatisk melanom celler. Koncentrationerne af de tilsatte hormoner er som følger: østrogen (0,566 pg / ml), progesteron (0,001 ng / ml), thyroidhormon (0,283 ug / dl). Kontrollen, noninvasive cellelinje anvendes til disse eksperimenter var WM793B. Dette eksperiment blev gentaget 3 gange med tilsvarende resultater, og en repræsentativ kurve er vist.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS kat # SH30068
Tabel 1. Eksempler på koncentrationsintervaller af udvalgte hormoner, vækstfaktorer og cytokiner i bovin og human sera. Koncentrationen forskellen mellem 2% FBS og 2% CS-FBS repræsenterer den mængde tilsat for at opnå fysiologiske koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumormetastase er en flertrinsproces. Cellerne skal bryde igennem basalmembranen, intravasate i enten lymfesystemet eller blod mikrokar, hvor de transporteres til fjerne steder. De tumorceller derefter ekstravasere og kolonisere i en macrometastasis 12. Progression gennem epitelial til mesenkymale overgang (EMT), tumor invasion, og metastase er blevet styrket af steroidhormoner 13,14, vækstfaktorer 15-18, og cytokiner 19-21. Disse molekyler er så kritisk at behandle signalvejen for tumorprogression, at udviklingen af et assay til at behandle deres rolle i tumor invasive potentiale er et vigtigt skridt i retning af at dechifrere de indviklede signalveje.
Dette assay for at anvende kul-strippet serum har en fordel i forhold til eksisterende metoder, fordi det formål at identificere den drivende kraft til at tumorcellerne migrerer. En tidligere analyse harblevet offentliggjort ved hjælp af normale primære bryst fibroblaster i invasion kamre. I denne undersøgelse, forfatterne brugte kul-strippet medier og tilføjede tilbage østrogen i Matrigel kamre, som ikke forårsager invasion som forventet, da cellerne ikke var tumorigene. Tilstedeværelsen af makrofag-konditioneret medium i nærvær eller fravær af østrogen forøget invasion betydeligt og i et lignende omfang 22. Mens dette assay var ens, at den anvendte invasion assays med kul-strippet serum i fravær eller nærvær af østrogen, var det ikke en tumor assay og var rettet mod undersøgelse af parakrine interaktioner mellem makrofager og fibroblaster 22. Et andet assay anvendes kul-strippet medier viser, at tilsætningen af lave niveauer af østrogen øgede proliferationen af brystcancerceller men forårsagede modstand mod kinaseinhibitorer 23. Vores undersøgelse er enestående, fordi det er en invasion assay anvendes på forskellige typer af cancerceller formål at studerevirkning af individuelle hormoner, vækstfaktorer og cytokiner enten alene eller i kombination. Desuden omfattet af tilgængelige litteratur har vi konstateret, at koncentrationerne af hormon er nødvendigt for at føje til kul-strippet serum for at opnå fysiologisk relevante niveauer (tabel 1). Tilsætningen af den enkelte komponent, "X" på niveauer normalt er til stede i serum er en kritisk parameter for assayet. Mens dette assay kan synes at være begrænset af de offentliggjorte niveauer af hormoner, vækstfaktorer og cytokiner i serum kan investigator bruge ELISA-analyser for at bestemme niveauerne af yderligere faktorer.
Mens protokollen er specifik for brug af kollagen I, kunne matrigel også substitueres, hvis investigator konsekvent brugte denne matrix. Grunden til at vi foretrækker at anvende collagen I er, fordi det er en enkelt komponent, som er defineret og er den primære bestanddel af dermis. Derudover bruger vi 75 pi 100 μg / ml collagen at gøre invasion matrix. Dette kan også modificeres til at opnå de ønskede resultater. Det er bedst at optimere koncentrationen, således at et rimeligt antal celler kan tælles på filtrene. Hvis cellerne er meget invasiv, kan det være bedre at bruge 100 pi kollagen I til matrixen eller til at øge kollagen koncentration. Selv om denne teknik kan hjælpe investigator indhente vigtige oplysninger, er det kun nyttig, hvis tumorerne celler invaderer mod en chemoattractant som fjernes ved kul-stripning af serummet. Hvis der ikke er nogen forskel mellem resultaterne for kontrol og kul-strippet serum, derefter assayet ville være værd at forfølge. Analysen omhandler også resultaterne for de enkelte kemoattraktanter samt undertrykkere af kemotaksi. Desuden er det i sammenligning af mulige resultater (figur 3), brugte vi standardafvigelsen som niveauet af accepterede eksperimentelle fejl for hvert forsøg. Men det faktiske valdier kan bestemmes af investigator baseret på standardafvigelsen eller standard fejl og en betydelig p-værdi.
Desuden kunne oplysninger og erfaringer fra dette assay være nyttig i udformningen af farmakologiske inhibitorer til visse signalveje. For eksempel, hvis en eller flere hormoner, vækstfaktorer og / eller cytokiner er fundet at være impliceret i invasionen mekanisme for en særlig tumorcelle mutation, end en eksisterende farmakologisk middel kan anvendes eller et nyt lægemiddel beregnet til at inhibere denne vej. Assayet er også et effektivt redskab til at studere den særlige tumor mutation og om ændring af aminosyrerest eller dens position opretholder den samme affinitet til kemoattraktant, som blev identificeret ved dette assay. På denne måde vores assay tilbyder en ny tilgang til at give et fingerpeg med hensyn til invasion mekanisme af cancerceller og eventuelt metoder til at forhindre tumor invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
