Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

والتعديل Published: April 24, 2015 doi: 10.3791/51480
* These authors contributed equally

Abstract

يخدم مصل الدم كما جاذب كيميائي نحو الخلايا السرطانية التي تهاجر وتغزو، وتسهيل دخول الوعاء بهم إلى microvessels. ومع ذلك، تبقى جزيئات الفعلية نحو الخلايا التي تهاجر بعيد المنال. وقد تم تطوير هذا الفحص الغزو تعديلها لتحديد الأهداف التي تدفع الهجرة الخلية والغزو. هذه التقنية يقارن مؤشر الغزو تحت ثلاثة شروط لتحديد ما إذا كان هرمون معين، عامل النمو، أو خلوى يلعب دورا في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. وتشمل هذه الشروط ط) العادي مصل بقري جنيني (FBS)، والثاني)، الفحم جردت FBS (CS-FBS)، الذي يزيل الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات والثالث) CS-FBS + جزيء (الرمز "X"). وهناك تغير كبير في غزو الخلايا مع CS-FBS بالمقارنة مع FBS، يشير إلى تورط الهرمونات، والسيتوكينات أو عوامل النمو في التوسط في التغيير. ويمكن بعد ذلك أن تضاف الجزيئات الفردية إلى CS-FBS لفحص قدرتها على إعادةالآية أو إنقاذ النمط الظاهري الغزو. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من العوامل يمكن الجمع بين لتقييم المضافة أو الآثار المستمرة للجزيئات متعددة في القيادة أو تثبيط الغزو. عموما، وهذه الطريقة تمكن الباحث من تحديد ما إذا الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل / أو النمو تلعب دورا في غزو الخلايا من خلال خدمة كما chemoattractants أو مثبطات الغزو لنوع معين من الخلايا السرطانية أو متحولة محدد. من خلال تحديد chemoattractants ومثبطات محددة، قد هذا الفحص الغزو تعديل تساعد على توضيح مسارات الإشارات التي توجه غزو الخلايا السرطانية.

Introduction

وقد تم وضع الغزو فحص رواية بهدف التعرف على إشراك هرمونات معينة، السيتوكينات و / أو عوامل النمو كما chemoattractants في غزو الخلايا السرطانية. قدرة الخلايا السرطانية لغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي السمة المميزة لالنمط الظاهري النقيلي 1-3. تم غرف الغزو تستخدم على نطاق واسع كما هو الحال في المختبر أدوات لدراسة غزو الخلايا السرطانية والهجرة ويمكن أن توفر المعرفة فيما يتعلق آليات في الجسم الحي غزو الورم والانبثاث. تتكون غرف أسطواني إدراج ثقافة خلية متداخلة ضمن الآبار لوحات ثقافة الخلية. قيعان من إدراج هي البولي أو البوليسترين أغشية شبه منفذة من أحجام المسام محددة.

في غزو الفحص القياسية، هي المصنفة الخلايا على غشاء إدراج مع وسائل الإعلام الحرة المصل ووضعها في الآبار ثقافة الخلية التي تمتلئ المصل أو مثل مصل chemoattractants إلى sوآخرون تصل قوة chemoattractive. هذه الأقراص قوة خلايا للتحرك من خلال غشاء شبه منفذ (الهجرة) أو بدلا من ذلك، من خلال طلاء من المصفوفة خارج الخلية (الغزو)، ومن ثم يمكن الملون باستخدام الأصباغ التقليدية لكشف وتحديد عدد الخلايا. ثم يتم تطبيع عدد الخلايا وفقا لمدى الهجرة والغزو في خط خلية موسع. هذا الأسلوب يسمح محقق لتقييم إمكانية الغازية من أنواع مختلفة من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك التلاعب الجيني.

الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو هي المكونات الهامة للمصل ويتزايد أظهرت أن تترافق مع القيادة النمط الظاهري الغازية 4. ومع ذلك، فإن طبيعة ودور وخصوصية هذه الجزيئات في الدم chemoattractive في التوسط الغزو لا يزال لا تزال بعيدة المنال. ويبقى التحدي لتحديد ما هي العوامل المحددة في المصل أو مثل مصل chemoattractants هي المسؤولة عن القيادةالسرطان غزو الخلايا وكذلك ما الجزيئات قد تحول دون عملية الغزو. في هذا التقرير، وصفنا منهجية لتقييم تورط محتمل من الهرمونات، والسيتوكينات و / أو عوامل النمو الموجودة في مصل الدم، والجزيئات قيادة chemoattraction وغزو الخلايا السرطانية.

في هذا البروتوكول المعدل المقترح، يتم استخدام الفحم تجريد لإزالة الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو من المصل 2٪ بقري جنيني (FBS) لتوليد FBS 2٪ الفحم تجريد (CS-FBS). وتستخدم على حد سواء 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS وكلاء لإعداد القوة chemoattractive لدفع السرطان غزو الخلايا. باستخدام 2٪ CS-FBS كعامل chemoattractive مقارنة إلى وضعها الطبيعي 2٪ FBS يتيح العديد من المزايا بما في ذلك لأول مرة، وأبرزها، والقدرة على دراسة النمط الظاهري غزو السرطان في / الغياب النسبي انخفاض الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو. كما أنها تمكن المحقق لتقييم ما إذا كانت إزالة الجماعية من الهرمونات، وعوامل النمو، وقبرصييسبب tokines زيادة أو نقصان في مؤشر الغازية. ثم تم تصميم فحص لتحديد ما إذا كانت إضافة عنصر الفردي، وصفت بأنها "X" يمكن أن يمنع، نقصان، زيادة، أو استعادة مؤشر الغازية إلى قيمتها الأصلية (انظر الشكلين 2 و 3). على الرغم من أن هذه المنهجية هي محددة لتحقيق المستويات الفسيولوجية للعنصر الذي يتم إزالتها من المصل خلال تجريد الفحم، كما تجدر الإشارة إلى أن الفحم تجريد يمكن أن يؤثر أيضا مسارات نقل الإشارة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الفحم تجريد يمكن أن تقلل من نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية الخلايا سليفة العظمية وتحفز تكون الشحم من خلال الحد من تفعيل MAPK 5. هي الفحم وسائل الإعلام جردت المتاحة تجاريا، وتستند على بروتوكول المبينة يجمع الفحم مع ديكستران وحضنت مع بقري جنيني المصل O / N 6.

وقد تم تطوير هذا الفحص في RESPONSE إلى نتيجة ذكرت من قبل زوكر وآخرون. 7 تظاهر المؤلفون أن النمط الظاهري متحولة تؤثر على الاتصالات الفجوة تقاطع أظهرت زيادة في مؤشر الغزو عندما يهاجرون نحو وسائل الإعلام مع العادي 2٪ FBS. تم القضاء على هذه الزيادة مع استبدال المصل جردت الفحم. من هذه النتيجة، خلص الباحثون إلى أن هذه الهجرة متحولة المتضررين نحو جزيء محبة للدهون (وبشكل أكثر تحديدا، وهو هرمون، عامل النمو، أو خلوى) 7. ومن المعروف أن الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات تتوسط مسارات إشارات تشارك في تعزيز الورم والغزو 4. وبالتالي، فمن المهم للمحققين العلمي لتحديد ما عامل (ق) هي التي تقود غزو الورم من زنزاناتهم السرطان معينة أو المسوخ قيد الدراسة. تم تصميم مقايسة لمعالجة دور المكونات الفردية في تركيزهم الفسيولوجية كما هو محدد وفقا لاختلاف بين تركيز عنصر &# 8220؛ X "في FBS العادي وCS-FBS. من خلال تطوير هذا الفحص، يمكن المحققين كسب المزيد من التبصر في مسار محدد الغازية التي تحكم النظام الخاص بهم.

وغالبا ما تصنف الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات كما المروجين الورم 8. وتستخدم بعض هذه العوامل مثل EGF كمصادر مباشرة للchemoattractants في غرف الغزو 9. وهكذا، يبدو من المرجح أن هذه تمثل المكونات الرئيسية للمصل أن غزو الورم المباشر. يقترح هذا البروتوكول بسيطة، ولكن كبير، تعديل التقليدية في المختبر فحص الغزو الذي يسمح محقق لتقييم مشاركة الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تم تصميم مقايسة لتوفير المحقق مع جوابا حول ما إذا كان الإجراء سوف تكون فعالة لدراستهم في خطوة مبكرة في التحليل، وذلك بعدم استخدام الوقت الثمين و resources إذا رأت لزوم لها. وتستخدم هذه الطريقة CS-FBS وتعتمد على تقدير المحققين على النحو الذي الجزيئات لمتابعة كمرشحين الرصاص التي يحتمل أن توسط غزو الخلايا السرطانية. ينبغي أن نتائج هذه التحليلات يثبت أنه مفيد في تحديد التي تخدم مكونات المصل كما chemoattractants أو مثبطات للخط خلية معينة أو متحولة التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، قد يساعد هذا النهج المحقق تحديد مسارات الإشارات الأساسية إما تشجيع أو تثبيط غزو الخلايا السرطانية. وبالتالي توجيه تصميم الأدوية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام المختلفة ومكونات إضافية

  1. قبل التجربة، وإعداد وسائل الاعلام التي تتألف من DMEM أو وسائط أخرى محددة مع إضافة إما العادي FBS، والفحم جردت FBS، أو الفحم جردت FBS بالإضافة إلى مكون لفحصها. لاحظ أن مكونات متعددة يمكن اختبارها في كل تجربة.
  2. تزن بها ويخفف من الهرمونات، وعوامل النمو، أو السيتوكينات بشكل مناسب ليتم حلها في الفحم جردت المصل في التركيز الفسيولوجي.

2. إعداد مصفوفة الكولاجين على الجليد

  1. إعداد 2 مل الكولاجين أنا المصفوفة على 2.2 ملغ / مل عن طريق إضافة مكونات تصفيتها العقيمة التالية على الجليد: 200 ميكرولتر 10X PBS (درجة الحموضة 7.4)، 5.4 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم، 600 ميكرولتر من ضعف H المقطر 2 O، و 1.2 مل الكولاجين I (على 3.63 ملغ / مل).
  2. حافظ على حل أنا الكولاجين على الجليد حتى جاهزة للوحة.

3. إعداد الهجرة / الغزو لوحات لفحص </ P>

  1. لكل خط الخلية لفحصها، استخدم واحد 24-جيدا لوحة غرفة فيها 12 بئرا تحتوي على تدرج. استخدام 12 بئرا إضافية التي لا تحتوي على إدراج لإضافة وسائل الإعلام جاذب كيميائي ونقل إدراج لمجموعة تجريبية تصل.
    ملاحظة: مصفوفة الكولاجين على لوحات مع البولي ايثيلين teraphthalate (PET) الغشاء و 8 ميكرون حجم المسام هو الأمثل لخطوط الخلايا تستخدم هنا. ومع ذلك، مصفوفة matrigel في لوحات المكسوة مسبقا والمحمولة ويمكن أيضا أن تكون بديلا مع حجم المسام انخفضت وفقا لخط الخلية التي يجري التحقيق فيها.
  2. علامة واضحة على لوحة، وذلك باستخدام 3 آبار في حالة يجري تحليلها (FBS الهجرة، والهجرة CS-FBS، والغزو FBS، والغزو CS-FBS وكذلك FBS الهجرة لعنصر تحكم، خط خلية موسع). الهجرة الفحص من قبل الحركة من خلال المسام في غشاء PET، والغزو فحص من قبل الحركة من خلال الكولاجين أو matrigel مصفوفة ثم من خلال المسام في الغشاء. استخدام علامات لون مختلفة لكل حالة خلية إلىمعرف في عملية الطلاء.

4. الاستغناء مصفوفة الغزو

  1. ماصة بعناية 75 ميكرولتر من محلول مادة الكولاجين في إدراج لاستخدامها في المقايسات الغزو. توخي الحذر لتجنب الفقاعات. تفريق فقاعات من خلال تطبيق طرف ماصة مقلوب إلى السطح.
  2. نقل لوحة مع إدراج المغلفة الكولاجين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتمكين هلام لترسيخ.

5. لوحة خلايا على الغشاء أو الغزو مصفوفة

  1. وفي الوقت نفسه، يعرض للتريبسين الخلايا وإضافة وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. خلايا تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق على قمة الجدول الطرد المركزي وشطف 3X في وسائل الإعلام الحرة المصل.
  2. resuspend في وسائل الإعلام الحرة المصل. عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو العداد الشريحة الآلي. إضافة وسائل الإعلام الحرة المصل إلى تركيز النهائي من 5 × 10 4 خلية / مل.
  3. عندما عزز مصفوفة الكولاجين (بعد 30 دقيقة)، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الاعلام مع أي2٪ FBS محددة أو الفحم-تجريد FBS إلى كل بئر. من 12 تدرج في لوحة:
    • 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS
    • 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS
    • 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS
    • 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS
    1. استخدام لوحات إضافية تبعا لعدد من العوامل التي يجري اختبارها ومع جهاز تحكم عن أي الكولاجين المقابلة لكل حالة.
  4. إضافة تعليق الخلية إلى إدراج في 5 × 10 4 خلية / مل، والطلاء 500 خلية ميكرولتر في إدراج في كل إدراج الهجرة والغزو.
  5. احتضان الخلايا لمدة 22 ساعة على 37 درجة مئوية.

6. تحديد عدد من ترحيل والخلايا الغازية

  1. إعداد تلطيخ الآبار باستخدام مثبت الميثانول، يوزين، وhemotoxylin، في آبار منفصلة.
  2. استخدام قطعة قطن لإزالة الخلايا ومصفوفة من كل بئر.Rrepeat مع تطبيق مسحة الثاني لكل بئر.
  3. مع ملقط، وتراجع كل إدراج 5 مرات ل1 ثانية إلى كل من حلول 3 على التوالي.
  4. سماح إدراج لتجف O / N.
  5. إما ط) إزالة المرشحات مع مشرط، وقطع بعناية حول حواف وجبل على شريحة مع ساترة والغمر النفط، أو ب) السماح للتدرج لتجف O / N مقلوب واستخدام إدراج مباشرة للفحص المجهري.
  6. في اليوم التالي، وعرض الشرائح أو إدراج تحت المجهر مع هدف 20X وتأخذ 5 صور من مناطق مختلفة من التصفية. لتحسين الاتساق، واتخاذ 4 حقول الخارجي ومركز واحد.
  7. عد الخلايا لجميع الظروف باستخدام برنامج يماغيج وتنطبق على الصيغ أدناه.
  8. تحديد الغزو في المئة على النحو التالي:
    يعني # من الخلايا الغازية من خلال الكولاجين I إدراج = ل
    يعني # الخلايا المهاجرة من خلال إدراج السيطرة = ب
    ٪ الغزو = (أ / ب) * 100
  9. تحديد مؤشر الغزو في 2٪ FBS على النحو التالي:
    الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ FBS) = ج
    ٪ غزو السيطرة خلايا موسع في (2٪ FBS) = د
    مؤشر الغزو (FBS) = (ج / د)
  10. تحديد مؤشر الغزو في 2٪ CS-FBS على النحو التالي:
    الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ CS-FBS) = ه
    الغزو٪ من سيطرة خلايا موسع في (2٪ CS-FBS) = و
    مؤشر الغزو (CS-FBS) = (ه / و)

7. كرر بروتوكول التجريبية مقارنة الفحم-تجريد FBS لFBS الفحم تجريد ل+ X ن مع عوامل متعددة جنبا إلى جنب

  1. كرر الإجراء عدة مرات حسب الحاجة باستخدام المكونات المختلفة ل "X" أو مزيج من المكونات.
  2. تطبيق العمليات الحسابية لتحديد مساهمة كل عامل "X" إلى الهجرة والغزو الآثار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم حساب مؤشر غزو لكل حالة وفقا لتطبيع إلى خط الخلية موسع. لتجاربنا، ونحن نستخدم 1205Lu خط خلية سرطان الجلد وخطوط الخلايا مستقرة البديل أنشئت كخطوط الغازية لدينا فضلا عن البديل موسع للخبث، WM793 من التي كانت تستمد الخلايا 1205Lu 10 والتي هي بمثابة عنصر تحكم منطقية. ونحن أيضا استخدام الكولاجين أنا مثل المصفوفة الغزو لأن ذلك هو العنصر الأساسي في الأدمة. هذا هو وفقا لدراسة سابقة حيث مصفوفة الغزو المثلى يختلف على أساس خط الخلية ومدى التوافق مع المجراة النتائج 11. ويرد هذا الاختبار الغزو تخطيطي وفقا لنتائج محتملة المحقق قد يحصل. في البداية، يجب أن يكون مؤشر الغزو ل٪ FBS 2 أعلى بكثير أو أقل من مؤشر الغزو لCS-FBS من أجل متابعة هذا الاختبار (الشكلان 1 و 2). إذا كان incr كبيرتخفيف أو نقصان في مؤشر الغزو هو واضح مع تجريده الفحم FBS، هذا الاختبار ليست مفيدة للمحقق (أرقام 2 و 3). إذا تم القضاء على هذه الزيادة مع تجريده الفحم FBS، المحقق بالفعل مع العلم بأن يتم توجيه الغزو نحو تعزيز هرمون، عامل النمو، أو خلوى (أرقام 2 و 3). ثم، يجب على الباحث الاستفادة من المعلومات حول نوع الورم محددة وتحور لتحديد أي مرشح (ق) آليات معقولة الحالية كما chemoattractants. قد يبدأ المحقق من خلال محاولة واحدة أو عدة مكونات كل على حدة في التركيز الفسيولوجي من خلال إضافة عنصر في الفرق بين تركيز 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS (الجدول 1). إذا كان العنصر تضاف إلى المصل جردت الفحم يزيد بشكل كبير من يقلل من احتمال غزو بالمقارنة مع المصل جردت الفحم وحده، ذلك المرشح، "X"، قد تكون بمثابة جزئية أوالمنقذ كامل اعتمادا على مدى الزيادة (أرقام 2 و 3). اثنين أو أكثر من مكونات يمكن دمجها لتحقيق زيادة المضافة أو التآزر، (كما تدل X 1 + X 2 + X 3 ...) (الشكل 3). يمكن تصنيفها وثمة عامل مما يقلل من مدى الغزو كعامل مثبط (الأرقام 2-4). في تجاربنا، أظهرنا أن استخدام خط خلية سرطان الجلد متحولة (1205Lu T154A) المهاجرة نحو جاذب كيميائي مع الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات إزالتها تسبب انخفاضا في الورم الغازية. تم اختبار ثلاثة هرمونات لتحديد ممكن "X". وتشمل هذه الاستروجين (استراديول) والبروجسترون، وهرمون الغدة الدرقية (T4). وكان اثنان من هذه الهرمونات لها تأثير على مؤشر الغزو (البروجسترون وهرمون الغدة الدرقية)، في حين تم تحديد الاستروجين كما في عامل مثبط (الشكل 4). ووفقا للنتائج المحتملة الواردة فيالرقم 3، والنتائج التجريبية في هذا المثال يبرهن على وجود انخفاض مع شرط 2 وتثبيط مع الشرط 3. ومن المرجح أن هرمون الاستروجين وسوف تستخدم بشكل أكبر في هذا الاختبار، لأنه قد يكون من المهم في تحديد المسارات التي عزل العوامل إشارات معينة لاستراتيجيات تصميم الأدوية في المستقبل. وسيتم توجيه تجارب إضافية في عوامل النمو والسيتوكينات لتحديد العناصر الأخرى التي قد تكون بمثابة "إنقاذ النمط الظاهري" chemoattractants المؤيدة للغزو. تحديد كل من جزيئات الموالية للالغازية والمثبطة قد جماعي توضيح إمكانات الغازية للخطوط الخلايا والمتغيرات متحولة قيد التحقيق.

الشكل (1)
الشكل 1. الإعداد التجريبي والتصميم. نموذج للاقامة لعملية تجريبية تظهر خلايا مطلي إما على الغشاء PET مباشرة أو جطبقة ollagen في وسائل الإعلام الحرة المصل. الخلايا إما تهاجر أو تغزو من خلال مصفوفة الكولاجين نحو جاذب كيميائي الذي يتم تعديل وفقا لبروتوكول وصفها بأنها الحالة 1 و 2 و 3. الخلايا التي تم ترحيلها أو غزت ثم يتم ثابتة وملطخة. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. النتائج المحتملة من واحد القياسية الغزو فحص نتيجة الغشاء. يوضح هذا النموذج النتائج المحتملة التي قد تواجه المحقق للمقايسة الغزو وكيفية تفسير هذه النتائج. كل دائرة هو نتيجة تمثيلية للمرشح الملون باستخدام نفس 3 شروط الموضحة في الشكل (1). وتمثل كل نقطة على الخلية التي مرت من خلال الغزوالمصفوفة والملون على الجزء السفلي من الغشاء. الخلايا سيتم كميا بشكل مناسب وتحليلها وفقا لذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تفسير البيانات عن الغزو مع CS-FBS ± X. يصف هذا المخطط كيف حسابات مؤشر الغزو تحدد النتائج التجريبية. CS-FBS هو المصل جردت الفحم وX يشير إلى المكونات الفردية تضاف إلى وسائل الإعلام CS-FBS موضح في النص. مجموعة المؤلفين الانحراف المعياري (SD)، والتباين مقبولة نظرا لخطأ تجريبي في شروطنا. ومع ذلك، تبعا للظروف تحت الملاحظة وعدد مكررات، هذا العامل يمكن تعديلها لتكون ضمن مجموعة من الدولتيةأهمية كال للمحقق. يمكن تكرار التجربة مع العديد من الجزيئات "X"، (كما تدل X 1 + X 2 + X 3 ...). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. نتائج الفحص الغزو. ويصور هذا الرسم البياني النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها عند استخدام خط الخلية البديل متحولة 3 أنشئت من 1205Lu خلايا سرطان الجلد المنتشر. تركيزات هرمونات وأضاف هي كما يلي: هرمون الاستروجين (0.566 جزء من الغرام / مل) والبروجسترون (0.001 نانوغرام / مل)، وهرمون الغدة الدرقية (0.283 ميكروغرام / ديسيلتر). كان السيطرة، خط خلية موسع المستخدمة لهذه التجارب WM793B. وتكررت هذه التجربة 3 مرات مع نتائج مماثلة، ويظهر الرسم البياني التمثيلي.

الوحدات تعريف FBS CS FBS فرق [2٪ FBS] - [2٪ CS-FBS] مصدر عدد كتالوج الهرمونات هرمون الاستروجين (استراديول) جزء من الغرام / مل 28.30 8.76 19،540 0،566 تكنولوجيا الحياة
FBS القط # 16000
CS FBS القط # 12676 سيغما E2257 الأنسولين ع ف ع / مل 8.61 لم يتم كشفها 8.610 0.172 سيغما I3536 هرمون البروجسترون نانوغرام / مل 0.05 لم يتم كشفها 0.050 0.001 سيغما P8783 هرمون التستوستيرون نانوغرام / مل 0.10 لم يتم كشفها 0.100 0.002 سيغما T1500 هرمون الغدة الدرقية (T4) ميكروغرام / ديسيلتر 14.14 لم يتم كشفها 14.140 0.283 سيغما T1775 عوامل النمو IGF نانوغرام / مل 111.00 49.30 61.70 1.23 الحرارية العلمية Hyclone
CS FBS القط # SH30068 سيغما I3769 TGF-β نانوغرام / مل 12.60 7.30 5.30 0.11 سيغما SRP3170 FGF-2 جزء من الغرام / مل 37.30 32.70 4.60 0.09 سيغما SRP4037 الوحدات سيرا الإنسان مصدر عدد كتالوج السيتوكينات G-CSF جزء من الغرام / مل 14.7 ± 13.2 N / A PMID: 21774806 سيغما SRP3331 GM-CSF جزء من الغرام / مل 40.9 ± 108.6 سيغما SRP3201 MCP 1 جزء من الغرام / مل 213.5 ± 100.7 سيغما SRP3109 TGF-α جزء من الغرام / مل 3.2 ± 4.0 سيغما T7924

يمثل الجدول 1. أمثلة من نطاقات تركيز الهرمونات مختارة، عوامل النمو والسيتوكينات في الأبقار والأمصال البشرية. والفرق بين تركيز 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS المبلغ المضاف لتحقيق تركيزات الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ورم خبيث هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا يجب أن اختراق الغشاء القاعدي، intravasate إما إلى الجهاز الليمفاوي أو الدم microvessels، والتي يتم نقلها إلى مواقع بعيدة. الخلايا السرطانية ثم يتسرب واستعمار إلى macrometastasis 12. وقد تم تعزيز التقدم من خلال الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، غزو الورم، والانبثاث بواسطة هرمونات الستيرويد 13،14، عوامل النمو 15-18، والسيتوكينات 19-21. هذه الجزيئات هي حرجة للغاية في التصدي للمسار الإشارات من تطور الورم، أن تطوير مقايسة لمعالجة دورها في الورم إمكانية الغازية هو خطوة مهمة نحو فك رموز مسارات الإشارات المعقدة.

هذا الاختبار باستخدام المصل جردت الفحم لديه ميزة على الطرق القائمة لأنها تهدف إلى تحديد القوة الدافعة التي للورم الخلايا المهاجرة. مقايسة السابق لهتم نشر باستخدام الخلايا الليفية الطبيعية الثدي الأولي في غرف الغزو. في هذه الدراسة، والكتاب واستخدمت وسائل الإعلام التي جردت الفحم وأضافت العودة هرمون الاستروجين في غرف matrigel الذي لم يتسبب الغزو كما هو متوقع حيث أن الخلايا لا مكون للأورام. ومع ذلك، فإن وجود وسائل الإعلام مكيفة البلاعم في وجود أو عدم وجود هرمون الاستروجين زاد الغزو بشكل كبير وإلى حد مماثل (22). في حين كان هذا الاختبار مماثل أنها استخدمت المقايسات الغزو مع المصل جردت الفحم في غياب أو وجود هرمون الاستروجين، وأنه لم يكن مقايسة الورم وكان موجها في دراسة التفاعلات نظير الصماوي بين الضامة والخلايا الليفية 22. فحص آخر يستخدم وسائل الإعلام التي جردت الفحم لإظهار أن إضافة مستويات منخفضة من هرمون الاستروجين زادت من انتشار خلايا سرطان الثدي ولكن تسببت مقاومة كيناز مثبطات 23. دراستنا هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو مقايسة الغزو تنطبق على أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية تهدف إلى دراسةتأثير الهرمونات الفردية، عوامل النمو، والسيتوكينات إما وحدها أو مجتمعة. وعلاوة على ذلك، رهنا الأدب المتاحة، والتي نحدد فيها تركيزات هرمون الضروري إضافة إلى المصل جردت الفحم لتحقيق المستويات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (الجدول 1). إضافة عنصر الفردي، "X" في المستويات الحالية عادة في المصل هي معلمة حرجة للمقايسة. في حين قد يبدو هذا الاختبار أن تكون محدودة من قبل مستويات نشرت الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات في المصل، يمكن للمحقق استخدام فحوصات ELISA لتحديد مستويات عوامل إضافية.

في حين أن البروتوكول هو محدد لاستخدام الكولاجين الأول، ويمكن أيضا أن تكون بديلا matrigel إذا المحقق كان باستمرار يستخدم هذا المصفوفة. والسبب ونحن نفضل استخدام الكولاجين I لأنه هو مكون واحد الذي يعرف ويكون المكون الرئيسي للالأدمة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم 75 ميكرولتر من 100 μز / مل الكولاجين لجعل مصفوفة الغزو. هذا ويمكن أيضا أن يتم تعديل لتحقيق النتائج المرجوة. فمن الأفضل لتحسين التركيز بحيث يمكن عدها عدد معقول من الخلايا على والمرشحات. إذا كانت الخلايا الغازية للغاية، قد يكون من الأفضل استخدام 100 ميكرولتر من الكولاجين الأول لمصفوفة أو لزيادة تركيز الكولاجين. في حين أن هذا الأسلوب قد يساعد المحقق الحصول على معلومات مهمة، فمن المفيد فقط إذا كانت الخلايا الأورام تغزو نحو جاذب كيميائي التي يتم إزالتها من قبل الفحم-تجريد من المصل. إذا لم يكن هناك فرق بين نتائج للرقابة والمصل جردت الفحم، ثم الفحص لن يكون يستحق المتابعة. ويتناول الفحص أيضا نتائج chemoattractants الفردية وكذلك المكثفات الكيميائي. وعلاوة على ذلك، في المقارنة بين النتائج الممكنة (الشكل 3)، استخدمنا الانحراف المعياري عن مستوى الخطأ التجريبي المقبولة لكل تجربة. ومع ذلك، فال الفعلييمكن تحديد UES من قبل المحقق على أساس الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري وقيمة ص كبيرة.

وعلاوة على ذلك، يمكن أن المعلومات المستقاة من هذا الاختبار يكون مفيدا في تصميم مثبطات الدوائية لبعض مسارات الإشارات. على سبيل المثال، إذا كان أحد أو أكثر من الهرمونات، وعوامل النمو، و / أو السيتوكينات وجدت لتكون متورطة في آلية غزو لطفرة الخلايا السرطانية معينة، من وكيل الدوائية الحالية يمكن استخدامها أو دواء جديدة مصممة لمنع هذا الطريق. الفحص هو أيضا أداة فعالة لدراسة الطفرات السرطانية معينة وما إذا كان تغيير بقايا الأحماض الأمينية أو يحافظ على مكانتها نفس النسب إلى جاذب كيميائي التي تم تحديدها من قبل هذا الاختبار. وبهذه الطريقة، فحص لدينا يقدم نهجا جديدا لتقديم أدلة إلى آلية غزو الخلايا السرطانية وربما طرق لمنع غزو الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane Corning 354578 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate
Collagen I, rat tail Corning 354236 Source = rat tail tendon, purity = 90%
Fixative; Diff-Quick Thermo Fisher Scientific NC9844047 Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin
Fetal bovine serum Life Technologies 16000 Designated as FBS
Charcoal stripped fetal bovine serum Life Technologies 12676 Designated as CS-FBS
Fetal bovine serum Thermo Scientific Hyclone SH30070 Designated as FBS
Charcoal stripped fetal bovine serum Thermo Scientific Hyclone SH30068 Designated as CS-FBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  4. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  5. Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
  6. Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
  7. Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
  8. Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
  9. Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
  10. Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
  11. Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
  12. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
  13. Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
  14. Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
  15. Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
  16. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  17. Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
  18. Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
  19. Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
  20. Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
  21. Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
  22. Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
  23. Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).

Tags

الطب، العدد 98، هرمون، خلوى، عامل النمو، والهجرة، والغزو، والكولاجين، والسرطان
والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bagati, A., Koch, Z., Bofinger, D.,More

Bagati, A., Koch, Z., Bofinger, D., Goli, H., Weiss, L. S., Dau, R., Thomas, M., Zucker, S. N. A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion. J. Vis. Exp. (98), e51480, doi:10.3791/51480 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter