Abstract
Le sérum sanguin sert de chimioattractant vers laquelle les cellules cancéreuses migrent et envahissent, ce qui facilite leur intravasation en microvaisseaux. Cependant, les molécules réelles vers lequel les cellules migrent demeurent insaisissables. Ce test d'invasion modifié a été mis au point pour identifier les cibles qui entraînent la migration et l'invasion cellulaire. Cette technique compare l'indice d'invasion dans trois conditions pour déterminer si une hormone spécifique, le facteur de croissance ou cytokine joue un rôle dans la médiation le potentiel invasif d'une cellule cancéreuse. Ces conditions comprennent i) de sérum fœtal bovin normal (FBS), ii) charbon-FBS (CS-FBS), qui supprime les hormones, les facteurs de croissance et des cytokines et iii) molécule CS-FBS + (notée "X"). Un changement important dans l'invasion des cellules CS-FBS avec par rapport à FBS, indique l'implication des hormones, des cytokines ou des facteurs de croissance dans la médiation de la modification. Les molécules individuelles peuvent ensuite être ajoutés revenir à CS-FBS pour doser leur capacité à reverset ou sauver le phénotype d'invasion. En outre, deux ou plusieurs éléments peuvent être combinés pour évaluer l'effets additifs ou synergiques de plusieurs molécules dans la conduite ou l'inhibition de l'invasion. Dans l'ensemble, ce procédé permet au chercheur de déterminer si les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance / ou jouent un rôle dans l'invasion cellulaire en agissant comme agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de l'invasion d'un type particulier de cellule cancéreuse ou un mutant spécifique. En identifiant chimiotactiques et des inhibiteurs spécifiques, ce dosage d'invasion modifié peut aider à élucider les voies qui dirigent l'invasion des cellules du cancer de signalisation.
Introduction
Un nouveau dosage d'invasion a été développé dans le but d'identifier l'implication de certaines hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance chimiotactiques comme dans l'invasion des cellules cancéreuses. La capacité des cellules tumorales à envahir à travers la matrice extracellulaire (ECM) est une caractéristique du phénotype métastatique 3.1. chambres d'invasion ont été largement utilisés comme outils pour étudier in vitro l'invasion des cellules cancéreuses et la migration et peuvent fournir des connaissances sur les mécanismes de l'invasion et la métastase tumorales in vivo. Les chambres sont constituées d'inserts de culture de cellules cylindriques emboîtés dans les puits de plaques de culture de cellules. Le fond des inserts en polycarbonate ou polystyrène sont des membranes semi-perméables des tailles de pores définies.
Dans l'essai d'invasion standard, les cellules sont ensemencées sur la membrane de l'insert avec du milieu sans sérum et on les place dans des puits de culture de cellules qui sont remplis de sérum ou de sérum comme agents chimio-attractifs pour set jusqu'à un chimioattractives vigueur. Cela conduit de force cellules de se déplacer à travers la membrane semi-perméable (migration) ou encore, par un revêtement de la matrice extracellulaire (invasion), qui peut ensuite être teinté avec des colorants classiques pour détecter et quantifier le nombre de cellules. Le nombre de cellules est ensuite normalisée en fonction de l'étendue de la migration et de l'invasion dans une lignée cellulaire non invasive. Cette méthode permet à un chercheur d'évaluer le potentiel invasif de différents types de cellules dans une variété de conditions, y compris les manipulations génétiques.
Les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance sont des éléments essentiels de sérum et sont représentés plus en plus à être associé à l'entraînement du phénotype invasif 4. Cependant, la nature, le rôle et la spécificité de ces molécules sériques chimioattractives dans la médiation invasion encore demeurent insaisissables. Le défi reste à déterminer quels facteurs spécifiques dans le sérum ou de sérum comme chimioattractifs sont responsables de la conduiteinvasion des cellules cancéreuses ainsi que des molécules qui peuvent inhiber le processus d'invasion. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour évaluer l'implication potentielle des hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance présents dans le sérum, en tant que molécules de conduire l'chimioattraction et l'invasion des cellules cancéreuses.
Dans ce protocole modifié proposé, le charbon de décapage est utilisé pour éliminer les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance de 2% de sérum bovin fœtal (FBS) pour générer 2% FBS charbon de bois (CS-FBS). Les deux 2% de FBS et 2% CS-FBS sont utilisés comme agents de mettre en place la force chimioattractives à conduire l'invasion des cellules cancéreuses. Utilisation de 2% de CS-FBS comme agent chimio-attractifs par rapport à la normale 2% de FBS offre plusieurs avantages, y compris d'une part, et le plus en évidence, la possibilité d'étudier le phénotype d'invasion du cancer en l'absence réduit / relative des hormones, des cytokines et des facteurs de croissance. Il permet également à l'enquêteur de déterminer si l'élimination collective des hormones, facteurs de croissance, et CYtokines entraîne une augmentation ou diminution de l'indice invasive. Le dosage est alors conçue pour déterminer si l'addition d'un composant individuel, désignée comme «X» peut inhiber, diminuer, augmenter ou rétablir l'indice invasive à sa valeur initiale (voir les figures 2 et 3). Bien que cette méthodologie est spécifique pour atteindre les niveaux physiologiques de l'élément qui est éliminée à partir du sérum au cours de charbon décapage, il convient également de noter que le charbon de décapage peut aussi affecter les voies de transduction du signal. Par exemple, il a été rapporté que le charbon de décapage peut diminuer l'activité de la phosphatase alcaline de cellules ostéoprogénitrices et induire l'adipogenèse par la réduction des activateurs de 5 MAPK. Charcoal médias dénudées sont commercialement disponibles et sont basés sur le protocole décrit qui combine charbon dextran et incubées avec du sérum fœtal bovin O / N 6.
Cet essai a été développé en Response à un résultat rapporté par Zucker et al. 7 Les auteurs ont démontré que le phénotype mutant affectant une communication écart de jonction fait preuve d'une augmentation de l'indice d'invasion lors de la migration vers la normale médias avec 2% de FBS. Cette augmentation a été éliminée avec le remplacement de sérum de charbon-dépouillé. De ce fait, les auteurs ont conclu que ce mutant affecté migration vers une molécule lipophile (plus spécifiquement, une hormone, un facteur de croissance ou cytokines) 7. Il est bien connu que les hormones, facteurs de croissance, cytokines et médiateurs voies impliquées dans la promotion de la tumeur et invasion quatre signalisation. Ainsi, il est important pour les chercheurs scientifiques pour déterminer quel facteur (s) sont le moteur de l'invasion tumorale des cellules cancéreuses ou des mutants particulier à l'étude. L'essai est conçu pour examiner le rôle des composants individuels lors de leur concentration physiologique telle que déterminée en fonction de la différence entre la concentration du composant et# 8220; X "dans FBS normale et le CS-FBS. Grâce au développement de ce test, les enquêteurs peuvent gagner plus de perspicacité dans la voie invasive spécifique régissant leur système.
Des hormones, des facteurs de croissance, cytokines et ont souvent été considérés comme des promoteurs de tumeurs 8. Certains de ces facteurs tels que EGF sont utilisés comme sources directes pour chimioattractifs dans des chambres d'invasion neuf. Ainsi, il semble probable que ceux-ci représentent les principales composantes du sérum qui invasion tumorale directe. Ce protocole propose un moyen simple, mais significative, de la modification de l'essai in vitro classique dans d'invasion qui permet à un chercheur pour évaluer l'implication des hormones, des facteurs de croissance, des cytokines dans la médiation et le potentiel invasif des cellules cancéreuses. Cependant, le test est conçu pour fournir à l'enquêteur une réponse quant à savoir si la procédure sera efficace pour leur étude à une étape précoce dans l'analyse, afin de ne pas utiliser un temps précieux et ressources si jugées inutiles. Cette méthode utilise CS-FBS et se appuie sur la discrétion des enquêteurs à laquelle les molécules de poursuivre en tant que candidats de plomb qui interviennent potentiellement invasion des cellules cancéreuses. Les résultats de ces analyses devraient se avérer utiles dans l'identification des composants du sérum qui servent d'agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de la lignée cellulaire particulière ou un mutant de l'étude. En outre, cette approche peut aider l'enquêteur d'identifier les voies de signalisation clés soit favoriser ou inhiber l'invasion des cellules cancéreuses; dirigeant ainsi l'avenir la conception de médicaments.
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Protocol
1. Préparer les différents médias et Composants supplémentaires
- Avant l'expérience, préparer des milieux consistant en DMEM ou un autre support spécifiés avec l'addition de FBS soit normale, FBS charbon de bois, charbon ou FBS plus le composant à tester. Notez que plusieurs composants peuvent être testés dans chaque expérience.
- Peser et diluer les hormones, les facteurs de croissance, cytokines ou de façon appropriée pour être dissous dans le sérum dépouillé de charbon de bois à la concentration physiologique.
2. Préparer la Matrice Collagène on Ice
- Préparation 2 ml collagène I matrice, à 2,2 mg / ml en ajoutant les composants suivants stérilisées par filtration sur de la glace: 10 x 200 pi de PBS (pH 7,4), 5,4 pi de NaOH 1 N, 600 pi d'eau distillée deux fois 2 O, et 1,2 ml de collagène de type I (à 3,63 mg / ml).
- Conserver la solution de collagène I sur la glace jusqu'au moment de l'assiette.
3. Préparer la migration / invasion Plaques pour le dosage </ P>
- Pour chaque lignée cellulaire à tester, en utilisant une plaque de chambre de 24 puits à puits qui 12 contiennent des inserts. Utilisez les 12 puits supplémentaires qui ne contiennent pas inserts pour ajouter les médias chimioattractives et le transfert des inserts pour la mise en place expérimentale.
REMARQUE: une matrice de collagène sur des plaques avec un polyéthylène téréphtalate (PET) et la membrane 8 um de taille de pore est optimale pour les lignées cellulaires utilisent ici. Cependant, une matrice de matrigel dans des plaques pré-revêtues peut également être substitué par la taille des pores en fonction de la diminution de la lignée cellulaire à l'étude. - Identifiez clairement la plaque, en utilisant trois puits par condition étant analysés (migration FBS, migration CS-FBS, invasion FBS, et d'invasion CS-FBS ainsi que FBS-migration pour un contrôle, la lignée cellulaire non invasive). Dosage par déplacement migration à travers les pores d'une membrane en PET, et l'invasion de dosage par circulation à travers une matrice de collagène ou de matrigel et ensuite à travers les pores dans la membrane. Utiliser différents marqueurs de couleur pour chaque état de la cellule à unid dans le processus de placage.
4. Verser l'invasion Matrice
- Pipetter prudemment 75 ul de la solution de matrice de collagène dans les inserts à être utilisés pour des essais d'invasion. Faites preuve de prudence pour éviter les bulles. Disperser les bulles par l'application d'une pointe de pipette à la surface inversée.
- Transférer la plaque avec les inserts revêtus de collagène à un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5% pendant 30 minutes pour permettre au gel de se solidifier.
5. Plaque les cellules sur la membrane ou d'invasion Matrice
- Pendant ce temps, Trypsiniser cellules et ajouter du contenu multimédia avec 10% de FBS. Spin cellules à 200 g pendant 5 min sur une centrifugeuse de table et rincer 3x dans un milieu sans sérum.
- Remettre en suspension dans un milieu sans sérum. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou un comptoir de diaporama automatique. Ajouter un milieu sans sérum à une concentration finale de 5 x 10 4 cellules / ml.
- Lorsque la matrice de collagène est solidifié (après 30 minutes), ajouter 700 ul de milieu avec soit2% de FBS ou définis charbon-FBS à chaque puits. Sur les 12 inserts par plaque:
- 3 inserts ont collagène et les puits avec les médias + 2% de FBS
- 3 inserts ont collagène et les puits avec les médias + 2% CS-FBS
- 3 inserts ne ont pas le collagène et les puits avec les médias + 2% de FBS
- 3 inserts ne ont pas le collagène et les puits avec les médias + 2% CS-FBS
- Utilisation des plaques supplémentaires en fonction du nombre de facteurs à tester et d'une commande pas de collagène correspondant à chaque condition.
- Ajouter suspension cellulaire aux inserts à 5 x 10 4 cellules / ml, le placage 500 cellules par ul insert dans tous les inserts de migration et d'invasion.
- Incuber les cellules pendant 22 heures à 37 ° C.
6. quantifier le nombre de Migration et invasion des cellules
- Mettre en place la coloration des puits en utilisant du méthanol fixateur, l'éosine, et hématoxyline, dans des puits séparés.
- Utilisez des cotons-tiges pour éliminer les cellules et la matrice de chaque puits.Rrepeat avec deuxième application de l'écouvillon pour chaque puits.
- Avec une pince, tremper chaque insert 5 fois pendant 1 seconde dans chacune des trois solutions de suite.
- Laisser sécher inserts O / N.
- Soit i) supprimer des filtres avec un scalpel, couper soigneusement autour des bords et monter sur une lame avec lamelle et l'immersion d'huile, ou ii) les inserts permettent de sécher O / N inversé et utilisent les inserts directement pour la microscopie.
- Le lendemain, voir des diapositives ou des inserts sous un microscope avec un objectif 20X et prendre cinq images de différentes régions du filtre. Pour améliorer la cohérence, de prendre quatre champs extérieurs et un centre.
- Compter les cellules pour toutes les conditions en utilisant le logiciel ImageJ et appliquer les formules ci-dessous.
- Déterminer l'invasion de pour cent comme suit:
# Moyenne des cellules envahissantes travers collagène je insère = a
Moyenne # des cellules migrant à travers insert de commande = b
Invasion% = (a / b) * 100 - Déterminer l'indice Invasion de 2% de FBS comme suit:
% Invasion des cellules en cours d'analyse (à 2% de FBS) = c
% Invasion de cellules de contrôle non invasifs en (2% de FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Déterminer l'indice Invasion 2% CS-FBS comme suit:
% Invasion des cellules en cours d'analyse (dans 2% CS-FBS) = e
% Invasion des cellules non invasives de contrôle dans (2% CS-FBS) = f
Indice Invasion (CS-FBS) = (e / f)
7. Répétez Protocole expérimentale visant à comparer charbon-FBS FBS charbon-dénudés + X n avec de multiples facteurs combinés
- Répéter la procédure plusieurs fois que nécessaire en utilisant différents composants de "X" ou une combinaison de composants.
- Appliquer les calculs pour déterminer la contribution de chaque facteur "X" pour les effets de la migration et d'invasion.
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Representative Results
L'indice d'invasion est calculé pour chaque condition de normalisation selon l'une lignée cellulaire non invasive. Pour les expériences, on utilise la ligne 1205Lu cellulaire de mélanome et les lignées cellulaires stables variantes établi comme nos lignes envahissantes ainsi que la variante non invasive prémalignes, WM793 partir duquel les cellules ont été dérivées 1205Lu 10 qui sert de contrôle logique. Nous utilisons également collagène I que la matrice d'invasion parce que ce est le composant principal du derme. Ceci est en accord avec une étude précédente de sorte que la matrice d'invasion optimale varie en fonction de la lignée cellulaire et le degré de concordance avec les résultats 11 in vivo. Ce test d'invasion est décrit schématiquement selon les résultats possibles l'enquêteur peut obtenir. Initialement, l'indice d'invasion pour 2% FBS devrait être sensiblement supérieur ou inférieur à l'indice d'invasion pour CS-FBS afin de poursuivre cet essai (figures 1 et 2). Si un incr importantla facilité ou la diminution de l'indice d'invasion est apparente avec du charbon-FBS, ce test ne est pas utile pour l'enquêteur (figures 2 et 3). Si cette augmentation est éliminé avec du charbon-FBS, l'investigateur a déjà la connaissance que l'invasion améliorée est dirigée vers une hormone, un facteur de croissance ou une cytokine (figures 2 et 3). Ensuite, l'enquêteur doit utiliser des informations sur le type spécifique de la tumeur et la mutation pour déterminer quel candidat (s) mécanismes plausibles présents que chimioattractifs. L'investigateur peut commencer en essayant une ou plusieurs composantes individuellement à la concentration physiologique en ajoutant la composante à la différence de concentration entre 2% de FBS et 2% de CS-FBS (tableau 1). Si un composant ajouté à du sérum de charbon-dépouillé augmente de manière significative de la diminution du potentiel d'invasion par rapport au sérum de charbon-dépouillé seul, ce candidat, "X", peut servir partielle ousauveteur totale selon le degré d'augmentation (figures 2 et 3). Deux composants ou plus peuvent être combinées pour atteindre une croissance additive ou synergique, (dénotés par X 1 + X 2 + X 3 ...) (Figure 3). Un facteur qui diminue l'étendue de l'invasion serait considéré comme un facteur d'inhibition (figures 2-4). Dans nos expériences, nous avons montré que l'utilisation d'une lignée cellulaire de mélanome mutant (1205Lu de T154A) de migrer vers un chimioattractant avec ses hormones, des facteurs de croissance, des cytokines et retirées entraîné une diminution de l'invasivité des tumeurs. Trois hormones ont été testées afin d'identifier un éventuel "X". Il se agit notamment des œstrogènes (estradiol), la progestérone, l'hormone thyroïdienne et (T4). Deux de ces hormones ne avaient pas d'effet sur l'indice d'invasion (de la progestérone et de l'hormone de la thyroïde), tandis que l'oestrogène a été identifié comme facteur dans inhibitrice (figure 4). Selon les résultats potentiels énumérés dansLa figure 3, les résultats expérimentaux de cet exemple démontrer une diminution par deux et un état d'inhibition à la condition 3. Il est probable que l'oestrogène est utilisé en outre en ce dosage, car il peut être important dans l'identification des voies qui séquestrer certains facteurs de signalisation pour les futures stratégies de conception de médicaments. Des expériences supplémentaires seront dirigés sur les facteurs de croissance et cytokines d'identifier d'autres composants qui peuvent servir de «sauvetage» chimioattractifs phénotype pro-invasion. Identification de deux molécules pro-invasives et inhibitrices peut collectivement élucider le potentiel invasif des lignées cellulaires et des variantes mutantes sous enquête.
Figure 1. Dispositif expérimental et le design. Modèle de la mis en place pour le processus expérimental montrant cellules étalées soit sur la membrane PET directement ou la ccouche ollagen dans un milieu sans sérum. Les cellules sont soit migrent ou d'envahir à travers la matrice de collagène vers un chimioattractive qui est modifié selon le protocole et décrit comme Condition 1, 2, et 3. Les cellules migrés ou envahies sont ensuite fixées et colorées. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2. Les résultats potentiels de l'un résultat standard de la membrane de dosage d'invasion. Ce modèle démontre les résultats potentiels que l'enquêteur peut rencontrer pour le dosage de l'invasion et de la façon d'interpréter ces résultats. Chaque cercle est un résultat représentatif d'un filtre coloré en utilisant les mêmes trois conditions qui sont décrites sur la figure 1. Chaque point représente une cellule qui a traversé l'invasionla matrice et colorées sur le fond de la membrane. Les cellules seraient quantifiées comme il convient et analysées en conséquence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. L'interprétation des données pour l'invasion avec CS-FBS ± X. Ce schéma décrit comment les calculs de l'indice Invasion déterminent les conclusions expérimentales. CS-FBS est le sérum de charbon de bois dénudés et X se réfère aux composants individuels ajoutés aux médias CS-FBS décrites dans le texte. Les auteurs ont fixé l'écart-type (sd) que la variabilité accepté dû à une erreur expérimentale dans nos conditions. Toutefois, en fonction des conditions sous observation et le nombre de répétitions, ce facteur peut être ajusté pour être dans la plage de étatiqueical importance pour le chercheur. L'expérience peut être répétée avec de multiples molécules «X», (notée X 1 + X 2 + X 3 ...). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Résultats de l'essai d'invasion. Ce graphique représente les résultats expérimentaux obtenus en utilisant une ligne cellulaire mutante variante établi à partir de trois 1205Lu cellules de mélanome métastatique. Les concentrations des hormones ajoutées sont les suivants: l'oestrogène (0,566 pg / ml), de la progestérone (0,001 ng / ml), l'hormone de la thyroïde (0,283 ug / dl). Le contrôle, la lignée cellulaire non invasive utilisée pour ces expériences était WM793B. Cette expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires, et un graphe représentatif est montré.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS CAT # SH30068
Tableau 1. Exemples de gammes de concentration de sélectionner des hormones, des facteurs de croissance et des cytokines dans le sérum humain et bovin. La différence de concentration entre 2% de FBS et 2% de CS-FBS représente la quantité ajoutée pour atteindre des concentrations physiologiques.
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Discussion
Tumeur métastase est un processus en plusieurs étapes. Les cellules doivent franchir la membrane basale, intravasate soit dans le système lymphatique ou le sang microvaisseaux, dans lesquels ils sont transportés à des sites distants. Les cellules tumorales puis extravasent et colonisent dans un macrométastase 12. La progression à travers la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), l'invasion tumorale et la métastase a été renforcée par des hormones stéroïdes 13,14, les facteurs de croissance de 15 à 18, 19 à 21 et les cytokines. Ces molécules sont si importantes pour traiter la voie de signalisation de la progression tumorale, que le développement d'un dosage pour traiter leur rôle dans la tumeur potentiel invasif est une étape importante pour déchiffrer les voies de signalisation complexes.
Cette analyse de l'utilisation de sérum de charbon-dépouillé a un avantage par rapport aux méthodes existantes, car il vise à identifier la force motrice à laquelle la tumeur cellules migrent. Un essai précédent aété publié en utilisant des fibroblastes mammaires normales primaires dans des chambres d'invasion. Dans cette étude, les auteurs ont utilisé les médias au charbon de bois dénudé et rajoutés oestrogène dans des chambres de matrigel qui n'a pas engendré invasion comme prévu puisque les cellules ne étaient pas tumorigènes. Cependant, la présence de milieux conditionnés de type macrophage en présence ou en absence de l'oestrogène a augmenté de manière significative et de manière similaire 22 invasion. Bien que ce test était similaire qu'il a utilisé des essais d'invasion de charbon de bois avec du sérum débarrassé de l'absence ou en présence d'œstrogènes, ce ne était pas un dosage de la tumeur et a été dirigé vers l'étude des interactions paracrines entre les macrophages et les fibroblastes 22. Un autre test utilisé médias de charbon-dépouillé pour montrer que l'addition de faibles niveaux d'œstrogènes augmente la prolifération des cellules du cancer du sein, mais a provoqué une résistance aux inhibiteurs de kinase 23. Notre étude est unique en ce qu'elle est un dosage d'invasion applicable à divers types de cellules cancéreuses destinées à étudier laeffet des hormones individuelles, facteurs de croissance et des cytokines, seules ou en combinaison. En outre, sous réserve de la littérature disponible, on a déterminé les concentrations de l'hormone nécessaire d'ajouter de la sérum-dépouillé de charbon de bois pour atteindre des niveaux physiologiquement pertinentes (tableau 1). L'addition du composant individuel, "X" à des niveaux normalement présentes dans le sérum est un paramètre critique de l'essai. Bien que ce test peut sembler être limitée par les niveaux publiés d'hormones, facteurs de croissance, cytokines et dans le sérum, l'enquêteur peut utiliser les dosages ELISA pour déterminer les niveaux de facteurs supplémentaires.
Bien que le protocole est spécifique pour l'utilisation de collagène I, matrigel pourrait également être substitué si l'enquêteur a été constamment utilise cette matrice. La raison pour laquelle on préfère utiliser du collagène I est parce qu'il est un composant unique qui est définie et est le constituant principal du derme. En outre, nous utilisons 75 pi de 100 μg / ml de collagène pour rendre la matrice d'invasion. Cela peut également être modifié pour atteindre les résultats souhaités. Il est préférable d'optimiser la concentration de telle sorte qu'un nombre suffisant de cellules peut compter sur les filtres. Si les cellules sont hautement invasif, il peut être préférable d'utiliser 100 pi de collagène de type I pour la matrice ou d'augmenter la concentration du collagène. Bien que cette technique peut aider l'enquêteur d'obtenir des informations importantes, il est utile que si les cellules tumorales envahissent vers une chimioattractive qui est éliminé par le charbon de bois-décapage du sérum. Se il n'y a pas de différence entre les résultats de contrôle et de sérum de charbon-dépouillé, alors le test ne serait pas la peine de poursuivre. L'essai porte également sur les résultats de chimiotactiques individuels ainsi que des suppresseurs de chimiotaxie. En outre, dans la comparaison des résultats possibles (figure 3), nous avons utilisé l'écart-type que le niveau de l'erreur expérimentale accepté pour chaque expérience. Cependant, la réelle values peuvent être déterminées par l'enquêteur sur la base de l'écart-type ou erreur-type et une valeur de p significative.
En outre, les informations glanées à partir de cette analyse pourrait se avérer utile dans la conception d'inhibiteurs pharmacologiques de certaines voies de signalisation. Par exemple, si une ou plusieurs hormones, facteurs de croissance, et / ou des cytokines se trouve être impliquée dans le mécanisme d'invasion d'une mutation des cellules tumorales particulier, qu'un agent pharmacologique existant peut être utilisé ou un nouveau médicament conçu pour inhiber cette voie. L'essai est également un outil efficace pour l'étude de la mutation d'une tumeur particulier et si la modification du résidu d'acide aminé ou sa position maintient la même affinité pour la chimio-attractive qui a été identifié par cet essai. De cette façon, notre analyse offre une nouvelle approche à fournir des indices sur le mécanisme d'invasion des cellules cancéreuses et peut-être des méthodes pour prévenir l'invasion tumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
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