Abstract
Blod serum fungerer som en kjemoattraktant mot som kreftceller migrere og invadere, tilrettelegging deres intravasation inn microvessels. Men selve molekylene mot hvilken cellene migrerer forblir unnvikende. Denne modifiserte invasjon analysen har blitt utviklet for å identifisere mål som driver cellemigrering og invasjon. Denne teknikk sammen invasjonen indeks under tre betingelser for å bestemme om et bestemt hormon, vekstfaktor, eller cytokin spiller en rolle i mediering av den invasive potensialet i en kreftcelle. Disse tilstandene omfatter i) normalt føtalt bovint serum (FBS), ii) trekull-strippet FBS (CS-FBS), som fjerner hormoner, vekstfaktorer og cytokiner og iii) CS-FBS + molekyl (betegnet "X"). En vesentlig endring i celle invasjon med CS-FBS i forhold til FBS, indikerer involveringen av hormoner, cytokiner eller vekstfaktorer for å mediere endring. Individuelle molekyler kan deretter tilsettes tilbake til CS-FBS for å bestemme deres evne til å gjenvers eller redde invasjonen fenotype. Videre kan to eller flere faktorer kombineres for å evaluere den additive eller synergistiske effekt av multiple molekyler i kjøring eller inhibering av invasjon. Totalt, muliggjør denne fremgangsmåte undersøkeren å bestemme hvorvidt hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer spiller en rolle i celle invasjon ved å tjene som kjemoattraktanter eller hemmere av invasjon for en bestemt type kreftcelle eller en spesifikk mutant. Ved å identifisere spesifikke chemoattractants og hemmere, kan dette endres invasjonen analysen bidra til å belyse signalveier som styrer kreftcelle invasjon.
Introduction
En roman invasjon analysen er utviklet med mål om å identifisere involvering av bestemte hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer som chemoattractants i kreftcelle invasjon. Muligheten av kreftceller til å invadere gjennom ekstracellulære matrise (ECM) er et kjennetegn på den metastatisk fenotype 1-3. Invasjons kamre har blitt mye brukt som in vitro verktøy for å studere kreftcelle invasjon og migrasjon og kan gi kunnskap om mekanismene for in vivo tumorinvasjon og metastasering. Kamrene består av sylindriske celledyrkningsinnsatser nestet i brønnene i cellekulturskåler. Bunnene av innsatsene er semi-permeable polykarbonat eller polystyren membraner av definerte porestørrelser.
I standard invasjon analysen, blir cellene sådd ut på innsatsen membran med serumfritt medium og plasseres i cellekulturbrønner som er fylt med serum eller serumlignende chemoattractants å set opp en chemoattractive kraft. Denne kraft stasjoner celler til å bevege seg gjennom den semi-permeabel membran (migrasjon) eller alternativt, gjennom et lag av ekstracellulær matriks (invasjon), som så kan farges ved hjelp av konvensjonelle fargestoffer for å påvise og kvantifisere antallet celler. Celletallet blir deretter normalisert i henhold til den grad av migrering og invasjon i en ikke-invasiv cellelinje. Denne metoden tillater en undersøker for å evaluere potensialet for invasiv forskjellige celletyper under en rekke forhold, inkludert genetiske manipulasjoner.
Hormoner, cytokiner og vekstfaktorer er kritiske komponenter i serum, og er i økende grad blitt vist å være forbundet med driv invasive fenotype 4. Imidlertid er naturen, rolle, og spesifisiteten av disse chemoattractive serum molekyler i å mediere invasjon fortsatt unnvikende. Utfordringen er fortsatt å finne ut hvilke konkrete faktorer i serum eller serum-lignende chemoattractants er ansvarlig for kjøringkreftcelle invasjon, så vel som hvilke molekyler kan hemme invasjon prosessen. I denne rapporten beskriver vi en metode for å evaluere den potensielle engasjement av hormoner, cytokiner og / eller vekstfaktorer som er tilstede i serum, som molekyler som driver chemoattraction og invasjon av kreftceller.
I denne foreslåtte modifisert protokoll, blir kull stripping anvendes for å fjerne hormoner, cytokiner og vekstfaktorer fra 2% føtalt bovint serum (FBS) for å generere 2% trekull strippet FBS (CS-FBS). Begge 2% FBS og 2% CS-FBS brukes som midler for å sette opp chemoattractive kraft for å drive kreftcelleinvasjon. Ved bruk av 2% CS-FBS som chemoattractive middel i forhold til det normale 2% FBS gir flere fordeler, inkludert første og mest fremtredende, evnen til å studere kreftinvasjon fenotype i den reduserte / relative fravær av hormoner, cytokiner og vekstfaktorer. Det gjør det også mulig etterforsker for å vurdere om den kollektive fjerning av hormoner, vekstfaktorer, og cytokines fører til en økning eller reduksjon i invasiv indeksen. Analysen ble deretter utviklet for å bestemme om tilsetningen av en enkelt komponent, betegnet som "X" kan hemme, økning, reduksjon eller gjenopprette invasiv indeksen til den opprinnelige verdien (se figurene 2 og 3). Selv om denne metoden er spesifikk for å oppnå de fysiologiske nivåer av den komponent som blir fjernet fra serum under kull stripping, bør det også bemerkes at kull stripping kan også påvirke signaltransduksjonsveier. For eksempel har det blitt rapportert at kull stripping kan redusere den alkaliske fosfatase aktiviteten av osteoprogenitor celler og indusere adipogenese gjennom reduksjon av MAPK-aktivatorer 5. Trekull strippet media er kommersielt tilgjengelige og er basert på protokollen beskrevet som kombinerer kull med dekstran og inkubert med føtalt bovint serum O / N 6.
Dette assay ble utviklet i respoNSE å følge rapportert av Zucker et al. 7 Forfatterne demonstrerte at en mutant fenotype påvirker gap junction-kommunikasjon, viste en økning i invasjonen indeksen ved migrering mot medier med normal 2% FBS. Denne økningen ble eliminert med substitusjon av trekull-strippet serum. Fra dette resultatet, forfatterne konkluderte med at dette mutant påvirket migrasjon mot et lipofilt molekyl (mer spesifikt, et hormon, vekstfaktor, eller cytokin) 7. Det er velkjent at hormoner, vekstfaktorer og cytokiner megle signalveier involvert i svulstutvikling, og invasjon 4. Således er det viktig for vitenskapelige søkere for å bestemme hvilke faktoren (e) som driver tumorinvasjon av deres spesielle kreftceller eller mutanter under studien. Analysen er utformet for å ta opp den rollen de enkelte komponenter ved deres fysiologiske konsentrasjon som bestemt i henhold til differansen mellom konsentrasjonen av komponenten &# 8220; X "i normal FBS og CS-FBS. Gjennom utviklingen av denne analysen, kan etterforskerne få mer innsikt i den spesifikke invasiv pathway regulerer deres system.
Hormoner, vekstfaktorer og cytokiner har ofte blitt klassifisert som tumorpromotere 8. Noen av disse faktorer som EGF blir brukt som direkte kilder for chemoattractants i invasjonskamre 9. Således er det sannsynlig at disse representerer de viktigste komponentene i serum som direkte tumorinvasjon. Denne protokollen foreslått en enkel, men signifikant, modifikasjoner til de konvensjonelle in vitro-analyse som tillater invasjon en undersøker for å vurdere involvering av hormoner, vekstfaktorer og cytokiner i mediering av den invasive potensialet av kreftceller. Imidlertid er analysen er utformet for å tilveiebringe undersøkeren med et svar på om fremgangsmåten vil være effektive for deres studie på et tidlig trinn i analysen, slik at det ikke å bruke dyrebar tid og resources hvis det anses unødvendig. Denne metoden bruker CS-FBS og er avhengig av etterforskere skjønn med hensyn til hvilke molekyler å forfølge som bly kandidater som potensielt megle kreft celle invasjon. Resultatene fra disse analyser bør vise seg å være nyttig for å identifisere hvilke serumkomponenter tjener som kjemotiltrekkende midler eller inhibitorer for den spesielle cellelinjen eller mutant som studeres. I tillegg kan denne tilnærmingen hjelpe etterforsker identifisere viktige signalveier enten fremmer eller hemmer kreftcelle invasjon; dermed regissere fremtiden drug design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Ulike medier og tilleggskomponenter
- Før eksperimentere, forberede medier bestående av DMEM, eller andre angitte medier med tilsetning av enten normal FBS, trekull strippet FBS, eller trekull strippet FBS, pluss den komponent som skal testes. Legg merke til at flere komponenter kan bli testet i hvert forsøk.
- Vei ut og fortynne hormoner, vekstfaktorer eller cytokiner hensiktsmessig å bli oppløst i trekull strippet serum i fysiologisk konsentrasjon.
2. Forbered Collagen Matrix on Ice
- Forbered 2 ml kollagen I matrisen ved 2,2 mg / ml ved tilsetning av følgende sterile filtrerte komponenter på is: 200 pl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pl 1 N NaOH, 600 ul dobbeltdestillert H2O og 1,2 ml kollagen I (ved 3,63 mg / ml).
- Hold kollagen Jeg løsning på is inntil klar til plate.
3. Forbered Migration / Invasion Plater for analysen </ P>
- For hver cellelinje som skulle testes ved å bruke en 24-brønners plate kammer hvori 12-brønner inneholder innsatsene. Bruk ytterligere 12 brønner som ikke inneholder innsatser for å legge til kjemoattraktant media og overføre innleggene for den eksperimentelle satt opp.
MERK: En kollagen matrise på plater med en polyetylen teraftalat (PET) membran og 8 mikrometer porestørrelse er optimal for cellelinjene bruker her. Imidlertid kan en matrigel matrise i forbelagte plater også være substituert med porestørrelsen reduseres i henhold til den cellelinjen som blir undersøkt. - Skal merkes godt plate, ved hjelp av tre brønner per tilstand blir analysert (FBS migrasjon, CS-FBS migrasjon, FBS invasjon, og CS-FBS invasjon samt FBS-migrering for en kontroll, ikke-invasiv cellelinje). Assay migrering ved bevegelse gjennom porene i et PET-membran, og analysen invasjon ved bevegelse gjennom en kollagen eller matrigel matrise og deretter gjennom porene i membranen. Bruke forskjellige farge markører for hver celle tilstand til enid i plating prosessen.
4. Tilsett Invasion Matrix
- Nøye pipettere 75 ul av kollagenmatriksen løsningen i innsatsene som skal brukes for invasjons assays. Vær forsiktig for å unngå bobler. Dispergere bobler ved å bruke en invertert pipettespissen til overflaten.
- Overfører platene med kollagen-belagte innsatser til en 37 ° C og 5% CO2-inkubator i 30 minutter for å muliggjøre gelen stivne.
5. Plate cellene på membranen eller Invasion Matrix
- I mellomtiden, trypsineres celler og legge til media med 10% FBS. Spin cellene ved 200 xg i 5 min på en bordsentrifuge og skyll 3x i serum frie medier.
- Resuspender i serum frie medier. Telle celler med en hemocytometer eller automatisert lysbilde teller. Legg serumfritt medium til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 4 celler / ml.
- Når kollagen matrise har stivnet (etter 30 min), tilsett 700 mL av media med enten2% FBS definert eller trekull-strippet FBS til hver brønn. Av de 12 innsatser per plate:
- 3 innsatser har kollagen og brønner med media + 2% FBS
- 3 innsatser har kollagen og brønner med media + 2% CS-FBS
- 3 innsatser har ingen kollagen og brønner med media + 2% FBS
- 3 innsatser har ingen kollagen og brønner med media + 2% CS-FBS
- Bruke flere plater, avhengig av flere faktorer som testes, og med en noe kollagen kontroll svarer til hver tilstand.
- Legg cellesuspensjon til innsatsene ved 5 x 10 4 celler / ml, plating 500 ul celler pr innskuddet i alle migrerings og invasjonsinnsatser.
- Cellene inkuberes i 22 timer ved 37 ° C.
6. Kvantifisere Antall Migrering og Invaderende Cells
- Sett opp farging av brønner ved hjelp av metanol fiksativ, eosin, og hemotoxylin, i egne brønner.
- Bruke bomullspinner for å fjerne celler og matrise fra hver brønn.Rrepeat med andre pinne søknad for hver brønn.
- Med pinsett, dypp hver pakning 5 ganger for 1 sek til hver av de tre løsningene i rekkefølge.
- Tillate inserts tørke O / N.
- Enten i) fjerne filtre med en skalpell, skjære forsiktig rundt kantene og montere på et lysbilde med dekkglass og nedsenking olje, eller ii) tillate innleggene tørke O / N invertert og bruke innleggene direkte for mikroskopi.
- Den neste dagen, vise lysbilder eller inserts under et mikroskop med en 20X objektiv og ta 5 bilder fra ulike regioner i filteret. For å bedre konsistens, ta fire ytre felt og ett senter.
- Telle celler for alle forhold ved hjelp av ImageJ programvare og gjelder formlene nedenfor.
- Bestemme prosent invasjon som følger:
Bety # av celler invaderende gjennom kollagen jeg setter = en
Bety # av celler migrerer gjennom kontroll innsats = b
% Invasion = (a / b) * 100 - Bestem Invasion Index i 2% FBS som følger:
% Invasjon av celler som analyseres (i 2% FBS) = c
% Invasjon av kontroll invasiv celler i (2% FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Bestem Invasion Index i 2% CS-FBS som følger:
% Invasjon av celler blir analysert (i 2% CS-FBS) = e
% Invasjon av kontroll invasiv celler i (2% CS-FBS) = f
Invasion Index (CS-FBS) = (e / f)
7. Gjenta Experimental Protocol Sammenligning Charcoal-strippet FBS til Charcoal-strippet FBS + X n med flere faktorer Kombinert
- Gjenta fremgangsmåten flere ganger etter behov for å bruke forskjellige komponenter for "x", eller en kombinasjon av komponenter.
- Gjelder beregningene for å bestemme bidraget fra hver faktor "X" til migrasjon og invasjon effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Invasjonen Indeksen blir beregnet for hver tilstand i henhold til normalisering til en ikke-invasiv cellelinje. For våre eksperimenter, bruker vi 1205Lu melanom-cellelinje, og etablerte variant stabile cellelinjer som våre invasive linjer samt premaligne noninvasive variant, WM793 hvorfra 1205Lu celler ble avledet 10 som tjener som en logisk kontroll. Vi kan også anvende kollagen I som invasjonen matrise, fordi det er den primære komponent i dermis. Dette er i samsvar med en tidligere undersøkelse, hvorved den optimale invasjon matrise varierer avhengig av cellelinjen og omfanget av samstemmighet med in vivo resultater 11. Denne invasjonen analysen er skissert skjematisk i henhold til de mulige resultater etterforskeren kan få. I utgangspunktet bør invasjonen indeksen for 2% FBS være betydelig høyere eller lavere enn invasjonen indeksen for CS-FBS for å forfølge denne analysen (figur 1 og 2). Dersom en vesentlig incrlette eller reduksjon i invasjonen indeksen er tydelig med trekull-strippet FBS, i denne analysen ikke anvendelig for undersøkeren (figurene 2 og 3). Hvis denne økningen er eliminert med trekull-strippet FBS har utprøver allerede vissheten om at den forbedrede invasjonen er rettet mot et hormon, vekstfaktor, eller cytokin (figur 2 og 3). Deretter må etterforskeren utnytte informasjon om den spesifikke tumortype og mutasjon for å avgjøre hvilken kandidat (er) til stede plausible mekanismer som chemoattractants. Undersøkeren kan begynne ved å prøve en eller flere komponenter hver for seg ved fysiologisk konsentrasjon ved tilsetning av komponenten ved konsentrasjonen forskjellen mellom 2% FBS og 2% CS-FBS (tabell 1). Hvis en komponent tilsatt til trekull-strippet serum signifikant øker fra senker invasjon potensial som i forhold til trekull-strippet serum alene, at kandidaten "X", kan tjene som en delvis ellerkomplett redningsmann avhengig av graden av økning (figurene 2 og 3). To eller flere komponenter kan kombineres for å oppnå en additiv eller synergistisk økning, (betegnet som X 1 + X2 + X3 ...) (figur 3). En faktor som reduserer omfanget av invasjonen ville bli klassifisert som en inhiberende faktor (figur 2 - 4). I våre forsøk har vi vist at anvendelsen av en mutant melanom-cellelinje (1205Lu T154A) migrerer mot et kjemotiltrekkende med sine hormoner, vekstfaktorer og cytokiner fjernet forårsaket en reduksjon i tumor invasivitet. Tre hormoner ble testet for å identifisere et mulig "X". Disse inkluderer østrogen (østradiol), progesteron og thyroid hormon (T4). To av disse hormonene hadde ingen effekt på invasjonen indeks (progesteron og thyroid hormon), mens østrogen ble identifisert som i inhiberende faktor (figur 4). Ifølge de potensielle utfall som er oppført iFigur 3, de eksperimentelle resultater i dette eksempel viser en nedgang med Tilstand 2, og en inhibering med Tilstand 3. Det er sannsynlig at østrogen blir anvendt videre i denne analysen, siden det kan være viktig for identifisering av veier som binder visse signal faktorer for fremtidige narkotika design strategier. Andre eksperimenter vil bli rettet mot vekstfaktorer og cytokiner å identifisere andre komponenter som kan tjene som "fenotype rednings" pro-invasjons chemoattractants. Identifisering av både pro-invasive og hemmende molekyler kan kollektivt belyse invasiv potensial for cellelinjer og mutante varianter under etterforskning.
Figur 1. Eksperimentell oppsett og design. Modell av satt opp for den eksperimentelle prosessen viser celler belagt enten på PET membran direkte eller collagen lag i serum frie medier. Cellene er enten trekkende eller invadere gjennom kollagen matrise mot en kjemoattraktant som er endret i henhold til protokollen og beskrevet som Betingelse 1, 2 og 3. De migrerte eller invaderte celler blir så fiksert og farget. Klikk her for å se et større versjon av denne figur.
Figur 2. Potensielle resultater fra en standard invasjon analysen membran resultat. Denne modellen viser de potensielle resultater som etterforskeren kan støte for invasjonen analysen og hvordan man skal tolke disse resultatene. Hver sirkel er et representativt resultat for et farget filter ved hjelp av de samme tre betingelser som er skissert i figur 1. Hvert punkt representerer en celle som har passert gjennom invasjonmatrisen og farget på undersiden av membranen. Cellene vil være hensiktsmessig kvantifiseres og analyseres deretter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. data tolkning for invasjon med CS-FBS ± X. Dette omrisset beskriver hvordan beregningene av Invasion Index bestemme de eksperimentelle konklusjoner. CS-FBS er trekull-strippet serum og X viser til de individuelle komponenter lagt til CS-FBS medier som beskrevet i teksten. Forfatterne setter standardavvik (sd) som den aksepterte variasjon pga eksperimentelle feil i våre forhold. Imidlertid, avhengig av betingelsene under observasjon og antall replikater, denne faktoren kan justeres til å være innenfor området av statistical betydning for etterforskeren. Eksperimentet kan gjentas med flere "X" molekyler, (betegnet som X 1 + X 2 + X 3 ...). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Invasion analyseresultatene. Dette diagrammet viser de eksperimentelle resultater som ble oppnådd ved anvendelse av en mutant cellelinje variant 3 etablert fra 1205Lu metastatisk melanomceller. Konsentrasjonen av de tilsatte hormoner er som følger: østrogen (0,566 pg / ml), progesteron (0,001 ng / ml), thyroid hormon (0,283 ug / dl). Kontrollen, ikke-invasiv cellelinje som brukes for disse eksperimentene var WM793B. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og et representativt diagram som er vist.
FBS katt # 16000
cs FBS katt # 12676
cs FBS katt # SH30068
Tabell 1. Eksempler på konsentrasjonsområder av enkelte hormoner, vekstfaktorer og cytokiner i bovine og humane sera. Konsentrasjonen forskjellen mellom 2% FBS og 2% CS-FBS representerer mengden tilsatt for å oppnå fysiologiske konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumormetastase er en flertrinns prosess. Cellene må bryte gjennom basalmembran, intravasate inn enten lymfatiske eller blod microvessels, der de blir transportert til fjerne steder. Tumorceller deretter ekstravasere og kolon inn en macrometastasis 12. Progresjon gjennom epitelial til mesenchymale overgang (EMT), tumor invasjon og metastasering har blitt forsterket av steroidhormoner 13,14, faktorer vekst 15-18, og cytokiner 19-21. Disse molekylene er så avgjørende for å ta opp signalveien for tumorprogresjon, at utviklingen av en analyse for å ta sin rolle i tumor invasiv potensialet er et viktig skritt mot å tyde de intrikate signalveier.
Denne analyse ved bruk av trekull-strippet serum har en fordel i forhold til eksisterende metoder, fordi det mål å identifisere den drivende kraft til å tumor celler migrerer. En tidligere analyse harblitt publisert ved hjelp av normale primære bryst fibroblaster i invasjons kamre. I denne studien forfatterne brukt trekull-strippet media og lagt tilbake østrogen i matrigel kamre som ikke forårsaker invasjon som forventet siden cellene var ikke tumorigent. Men nærvær av makrofag-kondisjonert medium i nærvær eller fravær av østrogen økt invasjon betydelig, til en tilsvarende grad 22. Selv om denne assay var lik den som brukes invasjons assays med trekull-strippet serum i fravær eller nærvær av østrogen, var det ikke et tumor-analyse og var rettet mot studier av parakrine interaksjoner mellom makrofager og fibroblaster 22. En annen test som benyttes trekull-strippet media for å vise at tilsetning av lave nivåer av østrogen økt spredning av brystkreftceller, men forårsaket motstand mot kinaseinhibitorer 23. Vår undersøkelse er unikt ved at det er en invasjon assay anvendelig for forskjellige typer av kreftceller er utformet for å studereEffekten av enkelte hormoner, vekstfaktorer og cytokiner, enten alene eller i kombinasjon. Videre underlagt tilgjengelig litteratur, har vi konkludert med at konsentrasjoner av hormonet nødvendig å legge til trekull-strippet serum for å oppnå fysiologisk relevante nivåer (tabell 1). Tilsetningen av den enkelte komponent, "X" på et nivå som normalt er tilstede i serum er en kritisk parameter for analysen. Selv om denne assay kan synes å være begrenset av de angitte nivåer av hormoner, vekstfaktorer og cytokiner i serum, kan undersøkeren bruke ELISA-analyser for å bestemme nivået av flere faktorer.
Mens protokollen er spesifikk for å bruke kollagen jeg kunne matrigel også erstattes hvis etterforskeren var konsekvent bruker denne matrisen. Grunnen til at vi foretrekker å bruke kollagen I er fordi det er en enkelt komponent som blir definert og er den primære bestanddel i dermis. I tillegg bruker vi 75 pl av 100 μg / ml kollagen for å gjøre invasjonen matrisen. Dette kan også bli modifisert for å oppnå de ønskede resultater. Det er best å optimalisere konsentrasjonen, slik at en rimelig antall celler kan telles på filtrene. Hvis cellene er meget invasiv, kan det være bedre å bruke 100 pl kollagen I for matrisen og for å øke kollagenkonsentrasjon. Mens denne teknikken kan bidra til undersøkeren innhente informasjon som er viktig, er det bare nyttig hvis tumorer invaderer celler mot et kjemotiltrekkende som er fjernet av trekull-stripping av serum. Hvis det ikke er noen forskjell mellom resultatene for kontroll og trekull-strippet serum og deretter assayet ikke ville være verdt å arbeide. Analysen tar også resultatene for enkelt chemoattractants samt undertrykkere av kjemotaksis. Videre, i sammenligning med mulige resultater (figur 3), har vi brukt standardavviket som nivået av akseptert eksperimentelle feil for hvert eksperiment. Men selve valUES kan bestemmes av utprøver basert på standardavviket eller standard feil og en betydelig p-verdi.
Videre kan informasjonen leses ut fra denne analysen vise seg nyttig i design av farmakologiske inhibitorer av visse signalveier. For eksempel, hvis en eller flere hormoner, vekstfaktorer, cytokiner og / eller er funnet å være implisert i invasjonen mekanisme for en bestemt tumorcellemutasjon, enn en eksisterende farmakologisk middel kan brukes, eller et nytt medikament utviklet for å hemme den veien. Analysen er også et effektivt redskap for å studere den spesielle tumor-mutasjonen og om å endre aminosyre-rest eller dens posisjon opprettholder den samme affinitet til kjemotiltrekkende som ble identifisert ved denne analysen. På denne måte, våre analysen gir en ny tilnærming for å gi ledetråder til invasjonen mekanisme av kreftceller og eventuelt metoder for å hindre tumorinvasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
