Abstract
Blodserum fungerar som en kemoattraktant mot vilken cancerceller migrerar och invadera, underlätta deras intravasering i mikrokärl. De faktiska molekylerna mot vilken cellerna migrera förblir gäckande. Denna modifierade invasion analys har utvecklats för att identifiera mål som driver cellmigration och invasion. Denna teknik jämför invasionen index under tre villkor för att fastställa om ett specifikt hormon, tillväxtfaktor, eller cytokin spelar en roll i att förmedla den invasiva potentialen hos en cancercell. Dessa villkor omfattar i) normalt fetalt bovint serum (FBS), ii) träkol-strippad FBS (CS-FBS), som avlägsnar hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner och iii) CS-FBS + molekyl (betecknad "X"). En betydande förändring i cellinvasion med CS-FBS jämfört med FBS, indikerar inblandning av hormoner, cytokiner eller tillväxtfaktorer vid medie förändringen. Enskilda molekyler kan sedan läggas tillbaka till CS-FBS att analysera deras förmåga att återvers eller rädda invasionen fenotypen. Vidare kan två eller flera faktorer kombineras för att utvärdera additiva eller synergistiska effekter av flera molekyler i körning eller hämma invasion. Sammantaget gör denna metod utredaren att avgöra om hormoner, cytokiner, och / eller tillväxtfaktorer spelar en roll i cellinvasion genom att fungera som kemoattrahenter eller hämmare av invasion för en viss typ av cancer cell eller en specifik mutant. Genom att identifiera specifika kemoattraktanter och hämmare, kan denna modifierade invasion analys bidra till att belysa signalvägar som styr cancercellinvasion.
Introduction
En ny invasion analys har utvecklats med målet att identifiera medverkan av specifika hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer som kemoattraktanter i cancercellinvasion. Förmågan hos tumörceller att invadera genom den extracellulära matrisen (ECM) är ett kännetecken för den metastatisk fenotyp 1-3. Invasion kammare har i stor utsträckning använts som in vitro verktyg för att studera cancercellinvasion och migration och kan ge kunskap om mekanismerna för in vivo tumörinvasion och metastas. Kamrarna består av cylindriska cellodlingsinlägg kapslade inom brunnarna i cellodlingsplattor. Bottnarna hos skären är semipermeabla polykarbonat eller polystyren membran av definierade porstorlekar.
I standardinvasionsanalys, celler sås på insatsmembran med serumfritt medium och placeras i cell odlingsbrunnar som är fyllda med serum eller serumliknande kemoattraktanter till set upp en chemoattractive kraft. Denna kraft enheter celler att röra sig genom semi-membran (migration) eller alternativt genom en beläggning av extracellulär matrix (invasion), som sedan kan färgas med konventionella färgämnen för att detektera och kvantifiera antalet celler. Cellnumret därefter normalis enligt omfattningen av migration och invasion i en icke-invasiv cellinje. Denna metod tillåter en undersökare att utvärdera den invasiva potentialen hos olika celltyper under en mängd olika förhållanden, inklusive genetiska manipulationer.
Hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer är kritiska komponenter i serum och i allt större utsträckning visat sig vara associerade med att köra den invasiva fenotypen 4. Men naturen, roll, och specificitet av dessa chemoattractive serum molekyler i medla invasion fortfarande svårfångade. Utmaningen kvarstår att avgöra vilka specifika faktorer i serum eller serumliknande kemoattraktanter ansvarar för körningcancercellinvasion samt vilka molekyler kan hämma invasionsprocessen. I denna rapport beskriver vi en metod för att utvärdera den potentiella medverkan av hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer som finns i serum, som molekyler som driver kemoattraktion och invasionen av cancerceller.
I denna föreslagna modifierat protokoll, är träkol stripp används för att avlägsna hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer från 2% fetalt bovint serum (FBS) för att generera 2% kol strippad FBS (CS-FBS). Både 2% FBS och 2% CS-FBS används som medel för att ställa in chemoattractive kraft för att driva cancercellinvasion. Använda 2% CS-FBS som chemoattractive agent i jämförelse med normala 2% FBS ger flera fördelar, inklusive första och mest framträdande, förmågan att studera cancer invasionen fenotyp i den reducerade / relativa frånvaro av hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer. Det möjliggör också utredaren att bedöma om den kollektiva borttagning av hormoner, tillväxtfaktorer, och cytokines orsakar en ökning eller minskning i den invasiva indexet. Analysen är sedan utformade för att bestämma huruvida tillsatsen av en individuell komponent, som betecknas som "X" kan hämma, minska, öka, eller återställa den invasiva indexet till sitt ursprungliga värde (se figurerna 2 och 3). Även om denna metod är specifik för att uppnå de fysiologiska nivåerna av den komponent som avlägsnas från serum under träkol stripp bör det också noteras att träkol stripp också kan påverka signaltransduktionsvägar. Till exempel har det rapporterats att träkol stripp kan minska alkaliskt fosfatas aktivitet osteoprogenitorceller celler och inducerar adipogenes genom reduktion av MAPK aktivatorer 5. Charcoal avskalade medier är kommersiellt tillgängliga och är baserade på det protokoll som beskrivs som kombinerar träkol med dextran och inkuberades med fetalt bovinserum O / N 6.
Denna analys utvecklades i RespoNSE till ett resultat som rapporterats av et al. Zucker 7 Författarna visade att en mutant fenotyp som påverkar kanalförbindelsekommunikation visade en ökning i invasionen indexet vid migrering mot media med normal 2% FBS. Denna ökning eliminerades med substitution av träkol-strippad serum. Från detta resultat drog författarna att denna mutant påverkade migrationen mot en lipofil molekyl (mer specifikt, ett hormon, tillväxtfaktor eller cytokin) 7. Det är väl känt att hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner medierar signalvägar som är involverade i tumörpromotion och invasion 4. Sålunda är det viktigt för vetenskapliga utredare att avgöra vilken faktor (er) driver tumörinvasion av deras särskilda cancerceller eller mutanter under studie. Analysen är utformad för att ta itu med den roll som individuella komponenter på deras fysiologiska koncentration som bestämts i enlighet med skillnaden mellan koncentrationen av komponenten &# 8220; X "i normalt FBS och CS-FBS. Genom utvecklingen av denna analys, kan utredarna få mer insikt i den specifika invasiva väg styr deras system.
Hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner har ofta klassificerats som tumörpromotorer 8. Några av dessa faktorer såsom EGF används som direkta källor för kemoattraktanter i invasionskamrarna 9. Således verkar det troligt att dessa utgör de viktigaste komponenterna i serum som direkt tumörinvasion. Detta protokoll föreslår en enkel, men ändå signifikant, modifiering av den konventionella in vitro-invasionsanalys som tillåter en undersökare att bedöma medverkan av hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner vid mediering av invasiv potential av cancerceller. Dock är analysen utformad för att ge utredaren med ett svar på om förfarandet kommer att vara effektiva för sin studie på ett tidigt steg i analysen, för att inte använda dyrbar tid och resources om det bedöms onödigt. Denna metod använder CS-FBS och förlitar sig på utredare diskretion om vilka molekyler att driva som bly kandidater som potentiellt medierar cancercellinvasion. Resultaten från dessa analyser skulle visa sig vara användbara för att identifiera vilka serumkomponenter fungerar som kemoattraktanter eller hämmare för särskilda cellinje eller mutant som studeras. Dessutom kan denna metod hjälpa utredaren identifiera viktiga signalvägar antingen främjar eller hämmar cancercellinvasion; därmed styra framtida läkemedelsdesign.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered de olika medierna och tilläggskomponenter
- Före experimentera, förbereda media bestående av DMEM eller andra specificerade media med tillägg av antingen normal FBS, kol strippad FBS, eller kol strippad FBS plus den komponent som ska testas. Notera att flera komponenter kan testas i varje experiment.
- Väg ut och späd hormoner, tillväxtfaktorer eller cytokiner lämpligt att vara lösta i kol strippad serum vid den fysiologiska koncentrationen.
2. Förbered Collagen Matrix on Ice
- Bered 2 ml kollagen I matrisen vid 2,2 mg / ml genom tillsats av följande sterila filtrerade komponenter på is: 200 pl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pl 1 N NaOH, 600 | il dubbeldestillerat H2O, och 1,2 ml kollagen I (vid 3.63 mg / ml).
- Håll kollagen I lösningen på is tills den ska tallrik.
3. Förbered Migration / Invasion Plattor för analys </ P>
- För varje cellinje som skall testas, använd en 24-brunnars kammarplattan, i vilken 12-brunnar innehåller skär. Använd ytterligare 12 brunnar som inte innehåller skär för tillsats kemoattraktanten medier och överföra skären för den experimentella uppsättningen upp.
ANMÄRKNING: En kollagenmatris på plattor med en polyetylen tereftalat (PET) membran och 8 ^ m porstorlek är optimalt för cellinjerna använda här. Däremot kan en matrigel matris i förbelagda plattor också ersättas med porstorlek minskade enligt cellinje utreds. - Tydligt märka plattan, med hjälp av 3 brunnar per tillstånd som analyseras (FBS migration, CS-FBS migration, FBS invasion, och CS-FBS invasion samt FBS-migrering för en kontroll, icke-invasiv cellinje). Assay migration genom rörelse genom porer i en PET-membran, och analys invasion av rörelse genom en kollagen eller Matrigel matrix och sedan genom porer i membranet. Använd olika färg markörer för varje cell tillstånd till ettid i pläteringsprocessen.
4. Fördela Invasion Matrix
- Försiktigt pipettera 75 ul av kollagenmatrisen lösning i skären som skall användas för invasionsanalyser. Var försiktig för att undvika bubblor. Dispergera bubblor genom att tillämpa en inverterad pipettspets till ytan.
- Överför plattan med de kollagenbelagda skär till en 37 ° C och 5% CO2 inkubator under 30 min för att göra det möjligt för gelén att stelna.
5. Plate cellerna på membranet eller Invasion Matrix
- Samtidigt Trypsinisera celler och lägga till media med 10% FBS. Spin cellerna vid 200 xg under 5 min på en bordscentrifug och skölj 3x i serumfria media.
- Resuspendera i serumfria media. Räkna celler med en hemocytometer eller automatiserad slide räknare. Lägg serumfritt medium till en slutlig koncentration av 5 x 10 4 celler / ml.
- När kollagenmatrisen har stelnat (efter 30 min), till 700 l av media med antingen2% definierade FBS eller kol-strippad FBS till varje brunn. Av de 12 insatserna per platta:
- 3 skär har kollagen och brunnar med media + 2% FBS
- 3 skär har kollagen och brunnar med media + 2% CS-FBS
- 3 inlägg har ingen kollagen och brunnar med media + 2% FBS
- 3 inlägg har ingen kollagen och brunnar med media + 2% CS-FBS
- Använd ytterligare plattor beroende på antal faktorer som testas och med ett nej kollagen kontroll motsvarar varje tillstånd.
- Lägg cellsuspension till skären vid 5 x 10 4 celler / ml, plätering 500 il celler per skär i alla migration och invasion skär.
- Inkubera cellerna i 22 h vid 37 ° C.
6. Kvantifiera Antal Migrera och invaderande celler
- Ställ in färgning av brunnarna med metanol fixativ, eosin, och hemotoxylin, i separata brunnar.
- Använd tops att avlägsna celler och matris från varje brunn.Rrepeat med andra svabb ansökan för varje brunn.
- Med pincett, doppa varje insats 5 gånger för 1 sek till vardera av de tre lösningarna i följd.
- Låt skär torka O / N.
- Antingen i) ta bort filter med en skalpell, skär försiktigt runt kanterna och montera på en bild med täckglas och immersionsolja, eller ii) låta insatserna torka O / N inverterad och använda skären direkt för mikroskopi.
- Nästa dag, visa bilder eller inlägg under ett mikroskop med en 20X objektiv och ta 5 bilder från olika regioner i filtret. För att förbättra konsekvens, ta 4 yttre fält och ett centrum.
- Räkna celler för alla förhållanden med användning ImageJ mjukvara och tillämpas på nedanstående formler.
- Bestäm procent invasion som följer:
Genomsnittlig # av celler invaderar genom kollagen jag sätter = a
Genomsnittlig # av celler migrerar genom kontrollinsats = b
% Invasion = (a / b) * 100 - Bestäm Invasion Index i 2% FBS enligt följande:
% Invasion av celler som analyseras (i 2% FBS) = c
% Invasion av kontroll noninvasiva celler i (2% FBS) = d
Invasion Index (FBS) = (c / d) - Bestäm Invasion Index i 2% CS-FBS enligt följande:
% Invasion av celler som analyseras (i 2% CS-FBS) = e
% Invasion av kontroll noninvasiva celler i (2% CS-FBS) = f
Invasion Index (CS-FBS) = (e / f)
7. Upprepa Experimentellt protokoll Jämföra Charcoal-strippad FBS till Charcoal-avskalade FBS + X n med flera faktorer i kombination
- Upprepa proceduren flera gånger efter behov med användning av olika komponenter för "X" eller en kombination av komponenter.
- Applicera beräkningarna för att bestämma bidraget från varje faktor "X" på migrations- och invasionseffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Invasionen index beräknas för varje tillstånd enligt normalisering till en icke-invasiv cellinje. För våra experiment använder vi 1205Lu melanomcellinjen och etablerade variant stabila cellinjer som våra invasiva linjer samt premaligna icke-invasiv varianten, WM793 från vilken 1205Lu cellerna härleddes 10 som tjänar som en logisk kontroll. Vi använder även kollagen I som invasionen matrisen eftersom det är den främsta komponenten i dermis. Detta är i enlighet med en tidigare studie som innebär optimal invasionen matrisen varierar beroende på cellinje och omfattningen av överensstämmelse med in vivo resultat 11. Denna invasion analys beskrivs schematiskt enligt de möjliga resultat utredaren kan få. Initialt bör invasionen index för 2% FBS vara betydligt högre eller lägre än invasionen indexet för CS-FBS i syfte att fullfölja denna analys (fig 1 och 2). Om en betydande incrlindra eller minskning av invasionen indexet framgår med kol-avskalade FBS, är denna analys inte användbart för utredaren (figur 2 och 3). Om denna ökning elimineras med träkol-strippad FBS, har utredaren redan kunskapen att den förstärkta invasionen är riktad mot ett hormon, tillväxtfaktor, eller cytokin (figurerna 2 & 3). Därefter måste utredaren utnyttjar information om den specifika tumörtypen och mutation för att avgöra vilken kandidat (er) nuvarande plausibla mekanismer som kemoattraktanter. Undersökaren kan börja med att försöka en eller flera komponenter individuellt vid den fysiologiska koncentrationen genom tillsats av komponenten vid koncentrationsskillnaden mellan 2% FBS och 2% CS-FBS (Tabell 1). Om en komponent läggs till träkol-strippad serum signifikant ökar i minskar invasionen potential jämfört med kol-avskalade serum ensamt, som kandidat, "X", kan tjäna som en partiell ellerkomplett räddare beroende på omfattningen av ökningen (figurerna 2 och 3). Två eller flera komponenter kan kombineras för att uppnå en additiv eller synergistisk ökning, (betecknad som X 1 + X 2 + X 3 ...) (Figur 3). En faktor som minskar omfattningen av invasionen skulle klassificeras som en hämmande faktor (figurerna 2-4). I våra experiment visade vi att användningen av en mutant melanomcellinje (1205Lu T154A) att migrera till ett kemoattraherande med sina hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner avlägsnade orsakade en minskning i tumörinvasion. Tre hormoner testades för att identifiera en möjlig "X". Dessa inkluderar östrogen (estradiol), progesteron, och sköldkörtelhormon (T4). Två av dessa hormoner hade ingen effekt på invasionen index (progesteron och sköldkörtelhormon), medan östrogen identifierades som i hämmande faktor (Figur 4). Enligt de potentiella resultat som räknas upp iFigur 3, de experimentella resultaten i detta exempel visar en minskning med Condition 2 och en hämning med Skick 3. Det är troligt att östrogen kommer att användas vidare i denna analys, eftersom det kan vara viktigt i identifieringen av vägar som binder vissa signalfaktorer för framtida drogdesignstrategier. Ytterligare experiment kommer att riktas mot tillväxtfaktorer och cytokiner för att identifiera andra komponenter som kan tjäna som "fenotyp räddnings" pro-invasions kemoattraktanter. Identifiering av både pro-invasiva och hämmande molekyler kan kollektivt belysa invasiv potential för cellinjer och muterade varianter under utredning.
Figur 1. Försöksuppställning och design. Modell av inrättats för den experimentella processen visar celler pläterade antingen på PET-membran direkt eller collagen skiktet i serumfria media. Cellerna antingen migrerar eller invadera genom kollagenmatrisen mot en kemoattraktant som är modifierad enligt protokollet och beskrivs som Condition 1, 2, och 3. De migrerade eller invaderade cellerna därefter fixeras och färgas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Potentiella utfall från en standard invasion analysmembran resultat. Denna modell demonstrerar de potentiella resultaten att utredaren kan stöta för invasionen analysen och hur man ska tolka dessa resultat. Varje cirkel är ett representativt resultat för en färgade filter med användning av samma tre villkor som beskrivs i figur 1. Varje punkt representerar en cell som har passerat genom invasionenMatrix och färgades på undersidan av membranet. Cellerna skulle vara lämpligt kvantifieras och analyseras i enlighet därmed. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Data tolkning för invasion med CS-FBS ± X. Denna översikt beskriver hur beräkningarna av Invasion Index bestämma experimentella slutsatser. CS-FBS är träkols avskalade serum och X hänvisar till de enskilda komponenterna läggs till CS-FBS media beskrivs i texten. Författarna anger standardavvikelse (sd) som den accepterade variationen beror på experimentella fel i våra förhållanden. Emellertid, beroende på betingelserna under observation och antalet replikat, denna faktor kan justeras för att vara inom området av statistical betydelse för undersökaren. Experimentet kan upprepas med flera "X" molekyler, (betecknad som X 1 + X2 + X3 ...). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Invasion analysresultat. Denna graf visar de experimentella resultaten som erhålls när en mutant variant cellinje 3 etablerats från 1205Lu metastasermelanomceller. Koncentrationerna av de tillsatta hormoner är som följer: östrogen (0,566 pg / ml), progesteron (0,001 ng / ml), sköldkörtelhormon (0,283 mikrogram / dl). Kontrollen, noninvasive cellinje som användes för dessa experiment var WM793B. Detta experiment upprepades tre gånger med liknande resultat, och ett representativt diagram visas.
FBS cat # 16000
cs FBS cat # 12676
cs FBS cat # SH30068
Tabell 1. Exempel på koncentrationsområdena utvalda hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner hos nötkreatur och humansera. Skillnaden Koncentrationen mellan 2% FBS och 2% CS-FBS representerar den mängd sätts för att uppnå fysiologiska koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumörmetastas är en flerstegsprocess. Cellerna måste bryta igenom basalmembranet, intravasate i antingen lymfsystemet eller blodmikrokärl, i vilka de transporteras till avlägsna platser. Tumörcellerna extravasera sedan och kolonisera i en macrometastasis 12. Progression genom epiteliala till mesenkymala övergång (EMT), tumörinvasion och metastaser har förbättrats genom steroidhormoner 13,14, faktorer tillväxt 15-18, och cytokiner 19-21. Dessa molekyler är så avgörande för att ta itu med signalväg för tumörprogression, att utvecklingen av en analys för att ta itu med deras roll i tumör invasiv potential är ett viktigt steg mot att dechiffrera intrikata signalvägar.
Denna analys av att använda träkol-strippad serum har en fördel jämfört med befintliga metoder, eftersom det syftar till att identifiera drivkraften till vilken till tumören celler migrerar. En tidigare analys harpublicerats med normala primära bröst fibroblaster i invasionskammare. I denna studie, författarna använt kol-strippad media och lagt tillbaka östrogen i Matrigel kammare som inte orsakar invasion som förväntat eftersom cellerna inte var tumörframkallande. Men närvaron av makrofager konditionerade medier i närvaro eller frånvaro av östrogen ökade invasionen betydligt och i liknande omfattning 22. Medan denna analys var liknande som det brukade invasionsanalyser med kol-strippad serum i frånvaro eller närvaro av östrogen, det var inte en tumör analys och var riktad mot studiet av parakrina interaktioner mellan makrofager och fibroblaster 22. En annan analys som användes träkols strippad media för att visa att tillsatsen av låga nivåer av östrogen ökade spridningen av bröstcancerceller, men orsakade resistens mot kinasinhibitorer 23. Vår studie är unikt genom att det är en invasionsanalys som tillämpas på olika typer av cancerceller som är avsedda att studeraeffekten av enskilda hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner antingen ensamma eller i kombination. Dessutom, med förbehåll för den tillgängliga litteraturen, har vi fastställt koncentrationerna av hormon nödvändigt att lägga till träkol-avskalade serum för att uppnå fysiologiskt relevanta nivåer (Tabell 1). Tillsatsen av den individuella komponenten, "X" vid nivåer som normalt förekommer i serum är en kritisk parameter för analysen. Även denna analys kan tyckas att begränsas av de publicerade nivåer av hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner i serum, kan utredaren använda ELISA-analyser för att bestämma nivåerna av ytterligare faktorer.
Medan protokollet är specifik för att använda kollagen I, kunde matrigel också ersättas om utredaren var konsekvent använda denna matris. Anledningen till att vi föredrar att använda kollagen I är att det är en enda komponent som är definierad och är den främsta beståndsdelen i dermis. Dessutom använder vi 75 pl 100 μg / ml kollagen för att göra invasionen matrisen. Detta kan också ändras för att uppnå de önskade resultaten. Det är bäst att optimera koncentration så att ett rimligt antal celler kan räknas på filtren. Om cellerna är mycket invasiva, kan det vara bättre att använda 100 | il av kollagen I för matrisen eller för att öka kollagenkoncentrationen. Även denna teknik kan hjälpa utredaren inhämta viktig information, det är bara bra om de tumörceller invaderar mot en kemoattraktant som avlägsnas genom kol-strippning av serumet. Om det inte finns någon skillnad mellan resultaten för kontroll och kol-strippad serum, då analysen inte skulle vara värt att sträva. Analysen tar också resultaten för enskilda kemoattraktanter samt tryckare av kemotaxi. Vidare i jämförelsen av möjliga resultat (Figur 3), använde vi den standardavvikelse som nivån på accepterade experimentella fel för varje experiment. Men den verkliga valderingar kan bestämmas av prövaren baserad på standardavvikelsen eller standardfel och en betydande p-värde.
Dessutom skulle den information som samlats in från denna analys vara till nytta vid utformningen av farmakologiska inhibitorer till vissa signalvägar. Till exempel, om en eller flera hormoner, tillväxtfaktorer och / eller cytokiner befinns vara inblandade i invasionen mekanismen för en viss tumörcellmutation, än en existerande farmakologiskt medel kan användas eller ett nytt läkemedel avsedd att hämma den vägen. Analysen är också ett effektivt verktyg för att studera den specifika tumör mutationen och huruvida att förändra aminosyrarest eller dess läge bibehåller samma affinitet till kemoattraktanten som identifierades genom denna analys. På så sätt ger vi analysen en ny metod för att ge ledtrådar till invasionen mekanismen av cancerceller och eventuellt metoder för att förhindra tumörinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Control Inserts with 8.0 µm PET membrane | Corning | 354578 | 12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
