Summary
In vivo-transfektion av naket DNA av hydrodynamiskt genleverans införs gener in i vävnaden av ett djur med minimal inflammatorisk reaktion. Tillräckliga mängder av genprodukt genereras så att genfunktion och reglering samt protein struktur och funktion kan analyseras.
Abstract
Effektiv expression av transgener in vivo är av kritisk betydelse för att studera genfunktion och utveckla behandlingar för sjukdomar. Under de senaste åren har hydrodynamisk genleverans (HGD) dykt upp som en enkel, snabb, säker och effektiv metod för att leverera transgener i gnagare. Denna teknik är beroende av den kraft som genereras av en snabb injektion av en stor volym av fysiologisk lösning för att öka permeabiliteten av cellmembranen i perfunderade organ och därmed leverera DNA in i celler. En av de viktigaste fördelarna med höggradig dysplasi är möjligheten att införa transgener i däggdjursceller med hjälp av naket plasmid-DNA (pDNA). Introduktion av en exogen gen med användning av en plasmid som är minimalt mödosamt, mycket effektiv och, i motsats till virusbärare, anmärkningsvärt säker. HGD användes ursprungligen för att leverera gener i möss, är det nu används för att leverera ett brett spektrum av ämnen, inklusive oligonukleotider, artificiella kromosomer, RNA, proteiner och små molekyler i möss, råttoroch, i begränsad utsträckning, andra djur. Detta protokoll beskriver höggradig dysplasi hos möss och fokuserar på tre viktiga aspekter av den metod som är avgörande för att utföra proceduren framgångsrikt: korrekt insättning av nålen i venen, volymen av injektionen och den snabba leveransen. Exempel ges för att visa tillämpningen av denna metod för att övergående uttryck av två gener som kodar för utsöndrade, primat-specifika proteiner, apolipoprotein LI (APOL-I) och haptoglobin relaterat protein (HPR).
Introduction
Sedan den första beskrivningen av Liu et al. Och Zhang et al., Har hydrodynamisk genleverans (HGD) blivit ett ovärderligt verktyg för att studera geners funktion i gnagare modellsystem 1, 2. Tekniken innebär att en snabb injektion (5-7 sek) av en stor volym (8-12% kroppsvikt) av lösning i svansvenen hos möss för att underlätta upptag av plasmid-DNA från cellerna av målorganen 1, 2. Dessa förhållanden leder till stabil genexpression i levern och mindre genuttryck i njure, mjälte, lungor och hjärta.
Injektion av 10 ug pCMV-LacZ plasmiden kan transfektion av så mycket som 40% av leverceller, vilket gör HGD det mest effektiva, icke-virala, in vivo-gen leveransmetod hittills 1. Till skillnad från virusbärare, är lätt att förbereda pDNA, inte framkalla ett immunsvar i gnagare värd 3 och inte utgör en hälsorisk genom rekombination med slutetogenous virus. Dessutom, eftersom de DNA-molekyler som levereras av HGD inte behöver förpackningar, är denna metod lämplig för leverans av bakteriella artificiella kromosomer (BAC) är så stora som 150 kb 4. Andra typer av molekyler som har levererats av en hydrodynamisk metod inkluderar RNA 5-10, morpholinos 11, proteiner 12, 13 och andra små molekyler 12, 14. Fördelarna och nackdelarna med höggradig dysplasi under andra leveransmetoder har diskuterats i utmärkta recensioner i litteraturen 15-20 och ett antal författare har gett en detaljerad beskrivning av förfarandet 21-23.
Att införa transgener i möss med höggradig dysplasi är säker och effektiv 1-3, 24 och metoden har använts i råttor med jämförbar framgång 25. Med vissa modifieringar, har proof-of-concept experiment genomförts i kycklingar 26, rabbits 27 och grisar 28, även om den vivo ansökan om denna teknik i större djur är fortfarande en utmaning. Vid användning av denna metod, är en annan vanlig begränsning att många av de tillgängliga däggdjursexpressionsvektorer saknar de komponenter för att uppnå en ihållande, hög nivå av genuttryck. Med hjälp av en pCMV-Luc plasmid, genuttryck i målorganen är tydlig redan efter tio minuter efter höggradig dysplasi, men tappar den ursprungliga, höga uttrycksnivån kraftigt under den första veckan efter injektion 1. Långsiktig transgen uttryck är möjliga beroende på promotorn och intron som används i plasmid konstruktion 3, 24 dock upprätthålla hög nivå genuttryck ofta kräver upprepade injektioner. Därför kan HGD vara mindre lämpligt att studera kroniska sjukdomar som är en följd av långvarig exponering för skadliga proteiner eller proteinprodukter. Med dessa begränsningar, är HGD ett ovanligt kraftfullt verktyg för att studera potial rollen av en gen och effekten av det mutanter in vivo, såväl som de terapeutiska effekterna och regleringen av proteiner och för att etablera djurmodeller av sjukdomen (för översikt, se 15). Exempelvis kan HGD användas för att tilldela funktionen till domäner och aminosyrorna i proteiner genom att individuellt införa olika genkonstruktioner in i möss som har respektive gener slås ut. Vidare kan denna teknik användas i varje musstam.
Detta protokoll beskriver höggradig dysplasi i möss med fokus på de tekniska aspekter som är nödvändiga för att uppnå framgångsrik transfektion: nålens insättning i venen, injektionsvolym och snabb leverans. Tillämpningen av denna metod demonstreras i en musmodell av afrikansk trypanosomiasis, en dödlig sjukdom hos människor och boskap 29, 30. Även om flera arter av trypanosomer orsakar sjukdom hos djur, de flesta kan inte orsaka sjukdom hos människor på grund av medfödda immunkomplex i b.Lood kallade trypanosominfekterade lytiska faktorer (TLFs) 29, 31, 32. Dessa por-bildande, lipoproteiner med hög densitet (HDL) innehåller två unika, primat-specifika proteiner:. HPR, den ligand, vilket underlättar upptaget av TLFs in trypanosomer, och APOL-I, den lytiska komponent 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense kan smitta människor på grund av uttryck av ett serum motstånd-associerat protein (SRA) som binder till och neutraliserar human APOL-I 34, 39. Babian TLF neutraliseras inte av SRA på grund av dess divergerande APOL-I-protein 40. Som tidigare rapporterats, med hjälp av en däggdjursexpressionsvektor (pRG977), transgent uttryck av babian TLF komponenter i möss ger skydd mot de mänskliga infektioner trypanosomer 40. De representativa data som presenteras här visar hur hydrodynamiska gen leverans kan tillämpas för att studera de terapeutiska effekterna av ett protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Hunter College, City University i New York.
1. Framställning av endotoxinfritt plasmid-DNA
- Plocka en enda koloni av bakterier innehållande genen av intresse i en däggdjursexpressionsvektor från en nyligen streaked selektiv platta.
- Följ rekommendationerna i handboken för en kommersiellt tillgänglig endotoxin-fria plasmidrening kit för att odla och skörda bakterier.
- Rena den endotoxinfritt plasmid-DNA från bakterieceller genom att följa protokollet av en kommersiellt tillgänglig endotoxinfritt plasmid reningskit.
- Använd endotoxin-fri plast ware och hantera DNA med omsorg för att se till att endotoxin inte återinföras i DNA-provet efter avlägsnande steg.
- Mäta koncentrationen av endotoxin-fri plasmid-DNA genom bestämning av dess absorbans vid 260 nm med användning av en MICRo-volym UV-spektrofotometer enligt nedan eller en standard, kyvett-baserade spektrofotometer.
- Rengör de nedre och övre optiska ytorna hos mikro spektrofotometer provhållningssystem enligt följande. Pipettera 1 jil av ren avjoniserat vatten på den nedre optiska systemet. Stäng hävarmen och knacka på det några gånger för att bada den övre optiska systemet, sedan öppna spaken och torka rent med en vävnad.
- Öppna mjukvaran hos mikro spektrofotometer och välj nukleinsyror modulen.
- Placera 1 l rent avjoniserat vatten på den nedre optiska systemet, sänk hävarmen och välj "initiera" från programmet programvara. När initieringen är klar, ren både optiska ytor med en vävnad ..
- Utför tom mätning genom att ladda ett pl av endotoxinfritt TE-buffert (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) och välja "blank" från programmet programvara. När tom mätning görs, rena både optiska ytor med envävnad.
- Utför provmätning genom att ladda 1 l av endotoxin-fria DNA-prov och välja "mått" från programmet programvara. Notera den DNA-koncentration. Bedöm DNA renhet genom att spela in absorbansförhållandet 260/280 nm som visas på skärmen. Eftersom användningen av rent DNA (260/280 förhållande på 1,8) för höggradig dysplasi är mycket önskvärt, undvika att använda ett DNA-prov med en 260/280 förhållandet under 1.7. När mätningen är klar, rengör både optiska ytor med en vävnad.
2. Vägning av möss
- Mark-möss på ett sätt som är lämpligt för stammen. OBS: märkning av svansen rekommenderas inte för den här proceduren.
- Markera arter mus som har vit päls (t.ex. schweiziska Webster) på ryggen med en svart markering. Applicera varumärken över tid som behövs.
- Mark mus arter som har svart päls (t.ex. C57BL / 6) på gehör stans flera dagar i förväg.
- Väg möss individually genom att försiktigt placera dem i ett djur vågskål eller hinken placeras på en digital laboratorium balans. Notera vikten av varje mus användes i experimentet, på dagen för experimentet.
3. Beredning av sprutor
- Framställning av injektionsblandningen
- Beräkna mängden DNA som behövs genom att ta på 5 till 50 | j, g endotoxin-fri plasmid-DNA för injektion av varje mus.
- Bestämma den optimala mängden av plasmid-DNA experimentellt.
- Vid fastställandet av DNA som krävs, ta tillskott av ytterligare en mus per grupp, som korrekt lastning av sprutorna kommer att kräva någon extra injektion mix. För att hjälpa beräkningar, betrakta följande exempel: injicera 4 experimentella och 4 kontrollmöss, var och en väger 25 g, med 50 mikrogram plasmid-DNA per mus. För att bestämma mängden DNA som behövs i detta fall räkna med 5 möss per grupp: 5 x 50 ^ g = 250 | ig DNA som behövs för varje grupp.
- Bestäm mängden koksaltlösning (0,9% natriumklorid) som behövs genom att anta 10% av kroppsvikten för injektion av varje mus.
- Enligt ovanstående exempel, injicera varje 25 g mus med 50 ^ g av plasmid-DNA i 2,5 ml koksaltlösning (2,5 g vätska).
- Vid bestämning av den mängd saltlösning som behövs för en hel grupp av möss, antag injektion av en ytterligare mus per grupp för att möjliggöra ändamålsenlig laddning av sprutor. Med tanke på det experimentet ges, beräkna den mängd saltlösning som behövs för 5 möss i varje grupp: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml saltlösning i varje grupp (eller 25 ml totalt). OBS: Om möss inom samma grupp är inte samma vikt (mer än 10% skillnad i kroppsvikt), förbereda injektionen blandar sig.
- Använd konserveringsmedel och endotoxin-fri, steril koksaltlösning som har godkänts för human användning, i 10 ml, flera injektionsflaskor.
- Med hjälp av en 20-gauge-nål (0,9 mm x 25 mm) som är fäst till en Luer-Lock-spetsen på en 20 ml spruta,ta ut vätskan från saltflaskor och töm sprutorna i en 50 ml koniska rör. För att hjälpa noggrann pipettering av saltlösning under utarbetandet av de DNA-saltlösning injektion mixar, samla saltare än vad som behövs för injektion av alla mössen i försöket. För experimentet ovan, dra saltlösning från 3, 10 ml injektionsflaskor (totalt ca 30 ml), även om den beräknade mängden salt som behövs för experimentet är bara 25 ml.
- Pipettera den beräknade mängden av DNA i en annan 50 ml koniska rör. Se till att inte röra vid sidan av röret med pipetten kroppen för att undvika införandet av endotoxin. Enligt exemplet, pipettera 250 pg av kontroll och 250 | j, g av experimentell plasmid-DNA i separata koniska rör.
- Tillsätt erforderlig mängd saltlösning till DNA med användning av en serologisk pipett. Med tanke på prov experiment pipett 12,5 ml saltlösning till var och en av huvudmixar (experimentell och kontroll).
- Låt alla lösningar för att nårumstemperatur före injektion.
- Beräkna mängden DNA som behövs genom att ta på 5 till 50 | j, g endotoxin-fri plasmid-DNA för injektion av varje mus.
- Beredning av sprutor
- För varje mus, fylla en steril 3 ml Luer-Lock-spruta med det DNA-saltlösningsblandning med användning av en steril 20-gauge-nål (0,9 mm x 25 mm). Var försiktig för att undvika luftbubblor. Undvik att använda högre volym sprutor som flödet av injektion inte kan kontrolleras väl, och det är svårt att manipulera större sprutor i ena handen. Mata ut överflödigt DNA-saltlösning mix tillbaka in i koniska röret eftersom detta kan vara återanvändas.
- Byt nålen till en steril, 27-gauge nål. Fyll nålen med vätska helt utan att införa luftbubblor. Justera volymen för DNA-saltlösning mix som beräknas utifrån vikten på musen.
- Låt inte det icke-begränsade nålen att röra någon icke-steril yta. Vid behov nålar kan åter tak med hjälp av enhandsfattning: placera locket på en plan yta, för in nålen utan att hålla i locket med den andra handen och tryck på kanylenmot ett fast föremål för att fästa locket på nålen. Sprutorna är nu redo för svans-ven injektioner.
4. Hydrodynamic DNA-leverans
- Observera att söva möss kan minska lönsamheten. Undvik att utföra HGD i ett rum som är för kallt, eftersom detta också kommer att minska lönsamheten. Om rummet har en omgivningstemperatur på 20 ° C eller om att använda bedövning, placera mössen på en värmedyna inställd på 37 ° C efter proceduren för att undvika förlust av djur. Om du använder anestesi, se till att munnen och nosen på musen är blockerade samtidigt på värmedyna och observera musen tills den helt återhämtat sig. Neka inte mat eller vatten från mössen före HGD.
- Värm mössen att vidga blodkärlen.
- Placera musen bur (med sängkläder ingår) på en värmedyna under 5 minuter, så att temperaturen av strö är cirka 38 till 39 ° C. Temperaturen bör vara tillräckligt låg för att hålla mössen på värmedyna för enlängre period.
- Alternativt, placera musen i en rygg tillgång rainer med minimal återhållsamhet. Värm svansen på musen under 1 minut genom att försiktigt hålla den med en bit gasbinda fuktad i varmt vatten. Låt musen för att placera om, om så behövs. Torka av svansen med en servett för att torka.
- Alternativt varm mus genom att placera buren under en värmelampa för att inte mer än 2 min. Om du använder en värmelampa, vara försiktig för att undvika överhettning av musen.
- Stora volymer injektion i svansvenen
- Immobilisera en rygg tillgång rainer på en plan yta med laboratorie tejp.
- Innehav i svansen, placera musen försiktigt i rainer och sätt i kontakten. Använd så lite återhållsamhet som behövs för att hålla svansen immobiliserade. Se till att musen andas fritt.
- Om musen är i svår nöd när som helst under förfarandet, ta bort musen från rainer omedelbart och låt den vila.
- Placera musen såen av den laterala kaudala vener är synlig. Lokalisera de laterala kaudala vener genom att titta rakt nedåt på baksidan av musen: den röda linjen som löper i mitten av svansen är en artär, medan den blå linjer på vardera sidan av svansen är de laterala kaudala vener.
- Torka av svansen på musen noggrant med en spritservett.
- Användning av icke-injicera handen tag i svansen tätt mellan pek-och långfingret, så att svansen passerar under pekfingret, över mitten och tredje fingrar och under lillfingret. Låt tummen för att vara fria att röra sig. (Figur 1A)
- Med hjälp av den andra sidan, torka området som ska injiceras en gång med en alkoholservett. Låt området torka.
- Plocka upp den laddade sprutan med injektions hand och håll den i pipan mellan tummen och de fyra andra siffror. Håll inte på kolven.
- Placera sprutan parallell med svans med nålen pekande mot kroppen hos mus ochavfasningen (sluttande kant) av nålen uppåt.
- Stick in nålen i svansvenen. Fortsätt med injektion endast om venen är korrekt placerad, vilket är uppenbart från nålen glider in utan motstånd. Observera att djupet av nålinförande är en fråga om personlig preferens dock fullt insättning rekommenderas inte på grund av en ökad risk för klippning av venen. Undvik att röra nålen.
- Med hjälp av tummen på svansen-hålla hand, stänga på navet av nålen och trycker på navet mot svansen för att hålla nålen på plats. Inte för hårt tryck och håll inte på nål skaftet, eftersom dessa kommer att hindra flödet av vätska in i venen. Håll i svansen med pekfingret löst vid denna punkt så att de inte hindrar injektion (Figur 1A).
- Åter placera sprutan hållande handen så att pekfingret och långfingret håller på flänsen och tummen är i änden av kolven (Figure 1 A).
- Tryck ner kolven i en kontinuerlig rörelse och injicera hela volymen av vätska i 6-8 sek.
- Avlägsna nålen från venen och stoppa blödningen genom ett lätt tryck på svansen med en vävnad.
- Ta bort musen från rainer och placera musen i en återhämtning bur placerades på toppen av en värmedyna (sängkläder bör vara 37-38 ° C). Om injektionsrummet är kallt, är detta steg avgörande för mus överlevnad. Håll i svansen på musen tills blödningen stannar helt.
- Observera musen i 1 timme efter hydrodynamiska DNA-leverans. En inledande period av flämtande och orörlighet är normalt på grund av den tillfälliga arytmier orsakas av höggradig dysplasi men se till att musen visar tecken på återhämtning i ca 5 min. Om andningen av musen blir ytterst ytlig, massera buken av musen för att underlätta andningen. Observera att återvinnings kan lätt påverkas av musen stam som används.
- Avkastning mustill bostäder bur och se till att musen har ett rikligt utbud av mat och vatten.
- Stora volymer svansvenen injektion med en alternativ handställning
- Placera musen i rainer och förbereda för injektion genom att följa stegen 4.3.1 till 4.3.5, som beskrivits tidigare.
- Vila icke-injicera handen på en plan yta med fyra fingrar böjda i en nittio graders vinkel. Fingrarna (alla utom tumme) skall vila på toppen av varandra, vilket skapar en plattform. Håll svansen på musen mellan tummen och pekfinger (Figur 1B).
- Med hjälp av den andra sidan, torka området som ska injiceras en gång med en alkoholservett. Låt området torka.
- Ta sprutan med injektions hand och håll den vid flänsen och slutet av kolven, färdig för injektion.
- Slutför proceduren genom att följa detta protokoll från steg 4.3.9 till steg 4.3.17, som beskrivits tidigare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt placering av nålen i svansvenen av musen (som visas i figur 1) är en förutsättning för att kunna ge en transgen av hydrodynamik-baserade transfektion. Ofta den mest utmanande delen av tekniken, däremot, är bibehållandet av nålen i svansvenen utan rörelse så att hela volymen av injektionen kan levereras inom 6-8 ar. Mindre fel under insprutningsprocessen kan leda till kraftigt minskade transfektion effektivitet och proteinuttryck. Därför är det absolut nödvändigt att övervaka framgången med HGD för varje experiment. Om det transgena proteinet av intresse är svår att upptäcka genom western blöt på grund av bristen av känsliga antikroppar, som i fallet av babian APOL-I, injektionseffektiviteten kan övervakas genom samtidig injektion av en plasmid som bär en gen för ett protein som är lätt att upptäcka. I experimentet som visas i figur 2, injicerades mössen med 50pg av en plasmid som bär en av tre differentiellt 6XHIS taggade babian APOL-I-gener och 50 mikrogram av en annan plasmid (samma uttrycksvektordesign) som fraktade babian HPR (bHPR, omärkt). Det främsta målet med detta experiment var att bedöma om tillägget av en 6XHIS tag på de valda sekvensplatser stör korrekt bearbetning och utsöndring av babian APOL-I-proteinet. Om emellertid tillsatsen av taggen stör korrekt veckning och därmed utsöndringen av proteinet, blir det svårt att bestämma huruvida förlusten av proteinuttryck har inträffat på grund av nedsatt bearbetning eller misslyckat HGD. Vidare, på grund av brist på tillräckligt känsliga antikroppar, är direkt detektion av babian APOL-I i transfekterad plasma mus svårt även i fall av en framgångsrik genleverans (bestämd genom att skydda möss mot en trypanosome utmaning human-infektiösa). I detta experiment var dessa frågor som behandlasgenom tillsats av en ekvivalent mängd babian HPR plasmid till APOL-Jag HGD blandning för att fungera som ett surrogat insprutningskontroll. Såsom visas i figuren, var babian HPR högt uttryckt i plasma hos nästan alla av den transfekterade möss indikerar att HGD lyckades. Mindre droppar i expressionsnivåer, såsom framgår av en av de två mössen i bAPOL-I 6XHIS grupp 1 I figur 2A är generellt hänförliga till en mycket liten minskning (1-2 s) i insprutningshastigheten. I figur 2B är det första plasmaprovet lane 1 (i bAPOL-I 6XHIS grupp 3) visar en total avsaknad av proteinuttryck som indikerar en misslyckad HGD. I de flesta fall, är detta på grund av ofullständig injektion av hela volymen av den leveransfordon. Eftersom detta experiment bekräftar framgången för höggradig dysplasi i samtliga fall utom ett, effekten av 6XHIS taggning på bAPOL-I sekre kan nu utvärderas av en anti-6XHIS immunoblot (figur 2C och D). Såsom sesi figur 2D, är den enda grupp av möss som hade detekterbara nivåer av 6xHis-märkt protein i plasma var grupp 3. Proteinuttrycksmönstret inom denna grupp bekräftade att injektion av en av mössen i denna grupp var utan framgång. Den totala avsaknaden av detekterbara 6xHis proteiner i grupp 1 och 2 (figur 2C) understryker vikten av att inkludera en spår protein i injektionsmixen för att övervaka framgången med höggradig dysplasi. Utan beaktande av de plasmanivåer av bHPR (Figur 2A och B), kan data från fig 2C och D lätt misstolkas som ett misslyckande för HGD i grupp 1 och 2.
Framgångsrik HGD av babian TLF1 komponenter bAPOL-I och bHPR, ger möss motstånd till Trypanosoma brucei brucei-Vägverkets parasiter humana smitt (Tbb-SRA, ett laboratorium motsvarande T. b.. Rhodesiense) 40. Detta motstånd beror på den transgena expressionen av bAPOL-I </ Em>, som injektion av bHPR ensamt ger inget skydd mot mänsklig-infektiösa parasiter. För att utvärdera huruvida 6XHIS-märkta varianter av bAPOL-I kan fortfarande fungera som lytiska proteiner mössen som erhöll både bAPOL-I och bHPR genom HGD utmanades med 5000 Tbb-SRA parasiter två dagar efter genleverans. Såsom framgår av fig. 3, möss i 6XHIS grupp 2 dukade under för infektionen mycket tidigt, medan de flesta möss i grupperna 1 och 3 överlevde så länge som den omärkta bAPOL-I positiv kontroll. (Baboon APOL-Jag ger partiellt skydd i denna musstam.) Eftersom transgenuttryck i grupp 2 var allmänt hög, kan bristen på skydd i dessa möss korrekt tolkas som förlust av bAPOL-I lytisk funktion på grund av det 6XHIS tagg på det position. Man måste vara försiktig dock att det för tidigt (dag 7) död av en mus i grupp 3 inte misstolkas, eftersom den här musen inte framgångsrikt injicerats med transgener (se fig.ure 2B, bana 1). Mot bakgrund av kombinerade data från figur 2 och 3, drar vi slutsatsen att bAPOL-Jag kan märkas i position 3 (i 6xHis grupp 3) utan negativa effekter, medan märkning av detta protein i position 2 (i 6xHis grupp 2) stör dess lytiska funktion. I 6xHis grupp 1, medan data tyder på skydd antalet möss var otillräcklig för att ge betydande uppgifter. Kraft analyserna bör utföras för att bestämma antalet möss som behövs för varje experiment. Medan den uppenbara bristen på detekterbar protein i mus-plasma från grupp 1 kan tyckas motsägelsefullt att skydda mönstret ses i figur 3, observera att en negativ anti 6xHis western blot i denna grupp kan vara ett resultat av bristande upptäckt på grund av protein behandling snarare än en brist av genuttryck. I grupp 1 fick 6xHis tag sattes nära efter klyvningsstället av den förutsagda signalpeptiden. Den babian APOL-I-aminosyrasekvensen innehåller en ytterligare predicted proteolytiskt klyvningsställe ungefär 20 aminosyror från klyvningsstället för signalpeptiden 40. Därför är det klart att bAPOL-I i dessa möss utsöndras och funktionella ännu förlorat 6XHIS-markeringen som behövs för dess detektion. Således illustrerar vikten av HANS tag placering.
APOL-Jag dödar afrikanska trypanosomer genom porer i parasiten lysosom membranet 36, 37. Naturliga varianter av humant APOL-I, som finns hos personer med nyligen afrikanska anor, har starkt samband med njursjukdom i afroamerikaner, även om mekanismen för njurskada är ännu oklart 41, 42. Sedan HGD resulterar i högsta genuttryck i levern, ville vi undersöka om humant APOL-I eller dess syntetiska sekvensvariant orsakar skador på detta organ. För detta ändamål injicerades möss med 50 ^ g av WT humant APOL-I eller en enda aminosyra syntetisk mutant betecknad ens K4.To utvärdera leverskada, mätte vi aspartataminotransferas (ASAT) i plasma mus insamlats på dag 2 efter injektion. I linje med sin lytiska funktion, WT human APOL-I orsakar en förhöjning av serum ASAT-nivåer (Figur 4A) jämfört med saltlösning injicerade möss. I kontrast injektion av mutant K4, som skiljer sig i endast en aminosyra, orsakade mycket liten AST release. Skillnader i leverskada är osannolikt att hänföras till nivåer av proteinuttryck, som K4 proteinnivåer är likvärdiga eller bättre än de i WT mänskliga APOL-I (Figur 4B). Undersökning av levrar från HGD möss uppsamlades 5 dagar efter injektion visar att humant WT APOL-I orsakar begränsad vävnadsnekros med måttlig makrofaginfiltration (figur 5B) jämfört med saltlösnings injicerade möss som visar normal leverhistologi (figur 5A, purpurfärgade områden) . Att bekräfta de data som erhållits genom att mäta plasma ASAT-nivåer, K4 injiceras i samma plasmid backgrundan som WT visar normal leverhistologi (figur 5C).
Figur 1. Illustration av positioner handen för höggradig dysplasi. A.) Position 1. Rekommenderat handposition för att uppnå maximal injektionshastighet och för att undvika att nålen rörelse efter injektionen har påbörjats. Pilen visar den föreslagna rörelse av tummen efter insättning av nålen i venen. Thumb bör immobilisera nålen genom att försiktigt hålla navet mot svansen på musen. Den hand som håller i sprutan måste flyttas för att kunna trycka ned kolven före injektion. B.) Position 2. Denna position rekommenderas om svansveninjektion måste utföras närmare basen av svansen på grund av upprepade injektioner. När nålen sätts in i venen, behöver denna handställning ingen pälsther justeringar.
Figur 2 Western blot-analys av plasma som samlats in från fem veckor gammal, hona, Swiss Webster (SW) möss som injicerats med en blandning av två separata plasmider. 50 ug babian HPR och 50 ^ g av differentiellt 6XHIS tagged babian APOL-I-gener. Möss injicerades med salin fordon som negativ kontroll. För att bekräfta framgång för HGD, visar detta experiment de cirkulerande plasmanivåer av babian HPR proteinet, såsom babian APOL-I är svåra att upptäcka. Mus plasmaprover uppsamlades två dagar efter HGD och proteinexpressionsnivåer analyserades genom western blöt (plasma utspädd 1:20) på 10% Tris-glycin-polyakrylamidgeler under denaturerande och icke-reducerande betingelser. HPR detekterades med användning av en polyklonal kaninantikropp mot humant haptoglobin (HP), som också rekgnizes babian HPR. Tagged bAPOL-Jag upptäcktes med hjälp av en kanin polyklonala antikropp mot en 6xHis tag. Molekylvikter i kontroll 6xHis proteiner som ingår är 40 och 50 kDa. A.) Panelen visar ett exempel på Western blot-analys av ett utsöndrat protein (HPR) när alla möss i en grupp injicerades med framgång. Notera den enhetligt hög proteinuttryck i den andra His-inmärkta gruppen (bAPOL-I 6XHIS Grupp 2), där injektion var mycket framgångsrik. I den första gruppen (bAPOL-I 6XHIS Grupp 1), är proteinuttryck från en av mössen framträdande men något lägre, troligen beroende på minskad hastighet av injektionen. B.) Panelen visar ett exempel på proteinuttrycksnivåer när en av injektioner (i bAPOL-Jag 6XHIS Grupp 3) misslyckades. C.) Panelen visar på betydelsen av att inkludera en spårprotein (bHPR) att övervaka framgång höggradig dysplasi när detektion av proteinet av intresse (bAPOL-I) är osäkert. Trots den bekräftad framgång för höggradig dysplasi i bAPOL-I
Figur 3. Överlevnad av möss som uttrycker babian APOL-Jag 6xHis varianter och babian HPR. Fem veckor gamla, kvinna, fick schweiziska Webster möss 50 mikrogram av vardera av två separata plasmider av höggradig dysplasi i samma injektion mix. Möss som användes i detta experiment motsvarar plasman analyserades i fig 2. På dag 2 post-injektioner gavs möss infekterades med 5000 mänskliga-infective Tbb-SRA parasiter och parasitemi övervakades. När parasitemi nådde 10 9 parasiter / ml mössen avlivas. Överlevnaden var signifikant från koksalt kontroll där så anges (* - P <0,05, log-rank test). Mus överlevnad på parasit utmaning är ett exempel på hur framgången för höggradig dysplasi påverkar data från efterföljande experiment. När babian APOL-I injiceras lyckas beror genprodukten utsöndras i musblod, där den tas upp av och dödar humana infektioner trypanosomer. Överlevnadskurvan visar att möss som injicerats med 6xHis tag version 3 av babian APOL-Jag var signifikant skyddade mot Tbb-SRA. Den enda för tidig död i denna grupp motsvarar den mus som inte lyckades injicerades med plasmiden som bär transgenen (se figur 2). Denna mus bör uteslutas ur överlevnadsanalys som sin överlevnad på parasit utmaning inte beror på skillnader i transgenen emot men till fel på genen leverans.
Figur 5. En enda aminosyrasubstitution i APOL-I-sekvensen resulterar i olika nivåer av vävnadspatologi. Figuren visar lever från SW möss som erhöll hydrodynamiska injektioner av saltlösning fordonet (A), 50 | ig humant WT APOL-I (B), eller 50 | ig av en syntetisk mutant variant av APOL-I, K4 (C). Levrar avlägsnades på dag 5 efter injektion och behandlades för hematoxylin och eosin-färgning. Representativa exempel är visade i samma möss som analyserades för AST-nivåer i Figur 4. Panels (DF) visar ytterligare exempel på skadade områden i WT-möss. Nekros härdar i paneler (B), (DF) är markerade med svarta rektanglar och förstoras. Vita pilar i dessa paneler pekar på områden av makrofag infiltration. För jämförelse, Normal vävnad från ett representativt område i levern hos en saltlösningsvehikel-injicerade mus är markerade med en ljusblå rektangel och är också förstoras. Paneler (B) och (D) är representativa bilder från samma WT musen, medan paneler (E) och (F) är från två olika WT möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När de utförs på rätt sätt, är HGD ett anmärkningsvärt säker och effektiv sätt att transgen leverans. De kritiska stegen till lyckad HGD är: 1) att leverera rätt mängd DNA i en stor volym av saltlösning fordon 2) i svansvenen av musen 3) på mindre än 8 sekunder.
Även om processen med injektionen själv kräver onekligen en del fingerfärdighet, framgången för denna sex andra förfarandet ofta ligger i noggranna förberedelser av experimentet. Mängden pDNA nödvändigt för att åstadkomma maximal genexpression kan variera kraftigt beroende på den plasmid som används och den gen som skall uttryckas och därför bör den optimala mängden av DNA som skall injiceras bestämmas experimentellt för varje applikation. För möss är den rekommenderade DNA varierar i allmänhet 5-50 mikrogram, bortom vilken genuttryck skulle kunna nå en platå. I våra händer, injektion av 50 ^ g pRG977 transporterar antingen APOL-I eller HPR-genen leder till höga nivåer av circulatinG-proteinnivåer i de två första dagar efter höggradig dysplasi. Blodnivåer av båda proteinerna minskar betydligt under de närmaste dagarna tills proteinnivåer sjunker under detekterbara nivåer runt dag 10 (38 och opublicerade data). Den optimala mängden av DNA bör sändas i en fysiologisk lösning som motsvarar 8-12% av kroppsvikt hos mus 1, 2. Medan de flesta forskare, inklusive oss, använd koksaltlösning som injektions fordonet har Ringers lösning använts för höggradig dysplasi med jämförbar framgång 2. Observera, att även om det inte är nödvändigt att utföra HGD i en steril miljö, är det absolut nödvändigt att undvika endotoxin kontamination av injektionslösningen under hela förfarandet. För detta ändamål bör den saltlösning som används för injektion vara av högsta renhet och det DNA som skall injiceras skall framställas med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit som tar bort endotoxin. Ett annat viktigt förberedande steg är noggrann vägning av möss. Eftersomvolym injektion är en av de kritiska aspekterna av framgångsrikt HGD, är det viktigt att se till att musen varken under doseras eller över doseras med saltlösning. De före detta fel ger suboptimal transfektion, medan den sistnämnda i den eventuella djurets död. För att ytterligare garantera säkerheten för djuren, rekommenderar vi laddar sprutorna med liten nål för att undvika att införa små luftbubblor som är svåra att bli av med. HGD bör utföras med en 27 - gauge nål som beskrivs i protokollet.
Korrekt injektion underlättas avsevärt om stjärtfenan ådrorna syns tydligt. Att utvidga blodkärlen genom försiktig uppvärmning av musen kan bistå visualisering av venerna om fixeringsutrustning med en svans-illuminator är inte tillgänglig. Placera musen buren på en värmedyna under några minuter eller hålla svansen med en varm, våt trasa fungerar bra i våra händer. Om du använder en värmelampa, måste man vara mycket försiktig att inte överhetta mössen. Vi tycker att viing en värmelampa gör att mössen onödig stress och obehag och därför bör undvikas. Avtorkning svansen med 70% etanol hjälper ytterligare visualisering genom att öka kontrasten mellan svansvenen och huden. Detta steg är också avgörande för att undvika bakteriekontamination under injektion. När musen är förberedd för injektion kan svansvenen injiceras med användning av antingen ett av de hand positioner som beskrivs i detta protokoll. Observera, att även om positionen 2 visas lättare och enklare, kan det vara svårare att injicera hela volymen av vätska utan att flytta sprutan. Däremot upprättande bra nålläge med den första metoden är mer omständligt men när nålen navet hålls säkert mot svansen, sällan misslyckas injektion. Den första metoden rekommenderas också för maximal hastighet, men framgångsrik transfektion är möjligt att använda antingen handställning.
Den rekommenderade hastigheten för höggradig dysplasi injektion i möss är 6-8 sekunder, även ommånga Författarna föreslår att snabbare injektioner ger ännu bättre resultat 1, 12. Långsam injektion ger markant reducerad genuttryck. Men den vanligaste orsaken till en total avsaknad av genuttryck underlåtenhet att leverera full volym injektion. Detta inträffar då nålen förflyttas, efter injektionen påbörjades. Korrekt placerad, kommer in i nålen venen utan motstånd. För att kontrollera att nålen införes i venen på rätt sätt, kan en spruta in en mycket liten mängd (100 | il) vätska in i venen före full injektion. Om du trycker ned kolven möter med extrem motståndskraft, är nålen i fel läge och vätskan kommer in i svansen vävnaden. Om nålen lämnar venen mid-injektion, korrigering av det misslyckade HGD kan prövas efter det att musen tilläts att vila i ett par timmar. Re-injektion efter otillräcklig vila orsakar lidande för musen och kan resultera i förlust av hydrodynamiska trycksatte genom att öppna den första sår på svansen på musen. Om upprepade injektioner är nödvändiga, kan mus injiceras med hela volymen av koksaltlösning (och mängden DNA) antingen närmare basen av svansen i samma riktning eller i den kontralaterala venen. Efter HGD, ska observeras musen i en bur placerades på en värmedyna under åtminstone en timme. HGD orsakar en kraftig ökning av intravaskulär tryck resulterande i en akut oregelbundenhet i hjärtfunktionen, lever expansion, och en störning av membranporerna av leverceller, sinusvågor och fenestrae 12, 14, 43. Trots en fördubbling av sin blodvolym i ett par sekunder, möss tolererar HGD anmärkningsvärt väl. De hjärtfrekvens återgår till det normala i 2 min och den intravaskulära trycket, vilket minskar snabbt strax efter injektionen, närmar basala nivåer i 3 min 12, 43. De störde hepatocyter återför på mindre än 2 minuter och de utökade leverstorlek avkastningtill normal storlek i 30 minuter följt av återvinning av sinusfunktionen i ca 24 timmar 43. Medan många forskare använder anestesi framgångsrikt, i våra händer, förvärrar isofluoran anestesi med andnöd av möss på grund av höggradig dysplasi. Vi finner att sövda möss tar längre tid att återhämta sig och ibland kräver återupplivning för överlevnad. Om injicera en stor grupp av möss med anestesi, kan det vara nödvändigt att ha en extra person i rummet tillägnad övervaka välbefinnande de återhämtar djuren. Utan anestesi, även efter upprepade injektioner, är mus överlevnad 100% och återhämtningstiden är mindre än 5 minuter.
Det protokoll som beskrivs här kan användas för att leverera ett brett spektrum av molekyler till muslever. Använda det utsöndrade proteinet APOL-I som ett exempel, vi visade hur HGD skulle kunna användas för att upprätta en musmodell och studera funktionen av ett skyddsprotein. Vid en jämförelse av funktionen av olika genprodukter, den Succébör bedömas ss av höggradig dysplasi när det är möjligt. För utsöndrade proteiner, är det lätt att övervaka expressionsnivåer genom att analysera plasma musen med western blöt (figur 2 och 4B.) Det är särskilt viktigt att säkerställa framgången för höggradig dysplasi vid analys av naturliga eller syntetiska varianter av ett terapeutiskt protein, som transfektion effektivitet kan allvarligt påverka sjukdomsutfall (figur 2 och 3). Exempel ges för att visa hur denna metod kan utvidgas till att analysera leverskada orsakad av APOLI, som är ett porbildande protein (fig. 4 och 5). Sekvensvarianter av APOL-I i samma plasmid bakgrund resulterar i markant olika skadeprofiler. Detta tyder på att vävnadsskada är associerad med proteinfunktion och inte expressionsvektom eller traumat av själva injektionen. Det bör noteras att, i våra händer, ASAT-nivåer är universellt höga på dag ett efter injektion (data visas ej). På dag 2 emellertid, ASAT-nivåer i möss iprojicerade med saltlösning återgång till det normala och skillnader mellan genvarianter är lätt urskiljbara (Figur 4). Vid dag 3 efter injektion, AST mättes i alla behandlingar återvända till sin basala nivån (data visas ej). Eftersom nekrotisk vävnad och inflammation i levern är uppenbara längre än en övergående ökning av ASAT, får leverskador på grund av ihållande genuttryck bedömas mera tillförlitligt, om än kvalitativt, genom färgning av levern som samlats på dag 5 efter injektion. De exempel som ges visar att varianter av APOL-I att orsaka en ökad frisättning av AST 2 dagar efter injektion även resulterar i mer ihållande leverskada som bedömt genom färgning med hematoxylin och eosin.
Hydrodynamisk genleverans tillåter snabb analys av genuttryck in vivo. Det kräver den enkla konstruktionen av den gen som studeras i en eukaryot expressionsvektor och förmågan att utföra injektionen som beskrivs ovan. Generation av transgenic möss som använder andra former av genen leverans, såsom rekombinanta lentivirusvektorer härledda från HIV-1 eller rekombinanta adenoassocierade virala vektorer, kräver mycket mer specialistkompetens. Dock är deras fördel upprätt genuttryck, även om viral genuttryck orsakar ofta en inflammatorisk reaktion på grund av den mottagande känner av en virusinfektion och svara 15-19. Vidare är de virala vektorerna har en begränsad förpackningsförmåga och därför är begränsade i gen storlek, medan BAC av 150 kb har med framgång använts i HGD 4. Efter att behärska denna teknik, kan användaren transfektera någon nukleinsyra (cDNA eller gDNA eller RNA) in vivo och följa produktionen av protein och de biologiska konsekvenser. Proteinet kan vara intracellulära, membranbundna eller extracellulära; det kan märkas eller modifieras vid nukleinsyran och sålunda aminosyranivå. Viktigast av allt, detta är en mycket snabb och enkel teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) för initialt att lära oss den HGD tekniken och Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) för hans ständiga vägledning i olika aspekter av tekniken. Detta arbete har finansierats av Hunter College, CUNY starta fonder och NSF Bröd utmärkelse IOS-1.249.166. Vi tackar NYULMC Histopatologi Kärna NYUCI Center Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 för histologi på muslevrar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
