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Neuroscience

一个吞噬含量:一个协议,以评估之间的中枢神经系统吞噬细胞和神经元的相互作用

doi: 10.3791/51482 Published: June 8, 2014

Summary

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)具有高容量,以在它们的胞外环境吞噬或吞噬物质的驻留的免疫细胞。这里,用于可视化和测量突触小部件的小神经胶质细胞介导的​​吞噬一个广泛适用的,可靠的和高度的定量测定法进行说明。

Abstract

吞噬作用是一个过程,其中一个细胞吞噬材料(整个小区的小区,杂物等部件)在其周围的细胞外环境,并随后消化此材料,通常通过溶酶体降解。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的细胞的吞噬功能的广泛的神经退行性疾病( 例如 ,β-淀粉样蛋白的间隙在阿尔茨海默氏病)的健康脑的发展( 例如,突触条件已经描述的驻地免疫细胞修剪)1-6。下面的协议是制定可视化和量化,在发育中的小鼠retinogeniculate系统7的突触前输入,小神经胶质细胞介导的吞噬的吞噬测定。虽然这种测定法用于评估在此特定情况下的小胶质细胞的功能,类似的方法可用于评估其他吞噬细胞在整个脑( 例如,星形胶质细胞)和身体的其余部分( 例如 ,外周血巨噬细胞)以及在其中突触重塑发生( 例如 ,脑损伤/疾病)其他上下文中。

Introduction

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突触电路改造整个动物的生命。在脑发育,突触形成过剩,而且必须经过突触的修剪涉及选择性去除突触的一个子集和那些仍然8-10突触的维持和加强。这个过程是必需的,以实现对成人神经系统的精确的连接特性。在成人中,突触也可以是塑料,特别是在学习和记忆的上下文中。此可塑性的结构相互关系被认为是包括树突棘和突触前boutons 11-13的加法和/或消除。除了 ​​在健康的神经系统这些角色,突触重塑也参与了神经系统疾病/伤害12,14,15。例如,下面的脊髓损伤,轴突切断后必须改造,形成新的突触,实现功能的恢复16-19。

NT“>新兴突触可塑性的一个重要方面是吞噬或拟用于去除3,5,20突触吞噬的过程中,我们最近发现这种现象在健康,出生后小鼠大脑突触7修剪的情况下,特别,小胶质细胞,常住中枢神经系统的免疫细胞和吞噬细胞,被证明在高峰期和发育突触的修剪,丘脑的产后背外侧膝状体核(外膝体)的区域吞没突触前输入。这吞没的遗传或药理封锁导致突触连接持续的赤字。

在这个协议中,我们描述了一种可靠的和高度的定量测定法来测量的突触前输入,吞噬细胞介导的​​吞噬。对于这篇文章的目的,此法将在发展中retinogeniculate系统,其中包括视网膜神经节细胞(RGC的)居住在视网膜的背景下提出的项目突触前输入到外膝体( 图1A)。开始,溶酶体降解抗性顺行标记策略进行说明,这是用于可视化的外膝体RGC特异突触前输入( 1)7,21。以下本说明书中,用于成像的详细方法和使用共聚焦显微镜并结合3维(3D)表面体绘制的定量测定吞噬将得到。此方法是基于固定的组织制备,但也可以适于在实时成像研究使用。重要的是,尽管已经测定在健康,产后retinogeniculate系统的上下文中得到证实,人们可以应用相同的技术来评估其它吞噬细胞 - 神经元相互作用的整个大脑和疾病过程中,以及在其他器官系统的吞噬细胞的功能。

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Protocol

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1,顺行研资局突触前输入的标签

注意:所有涉及使用动物实验,根据美国国立卫生研究院的所有准则审阅及机构动物护理和使用委员会(IACUC)监督。

  1. 消毒领域和手段。
  2. 麻醉用鼠标在一个树脂玻璃感应室4%(体积)的异氟醚(这个体积%异氟醚适用于新生儿,成年小鼠)。观察小鼠的密切合作,以避免过度麻醉。注意:避免吸入用真空废气撤离。
  3. 经过1-3分钟,(年纪较大的老鼠将需要更少的时间)确保麻醉的适当水平是通过捏尾巴(无反应应观察),并观察呼吸频率(速度应缓慢而稳定的)实现的。
  4. 把鼠标在其侧面及地方鼻锥递送3-4%(体积)的异氟烷在炉鼻的立体显微镜下(新生儿<产后10天(P10)〜4%(体积);> P10〜3%(体积))。
  5. 露出巩膜。为新生儿注射前的眼图张开,用一双小弹簧剪刀剪开眼睑拉背部皮肤,露出巩膜。对于年纪较大的老鼠,用手指拉回来眼睛周围,露出巩膜皮肤。注意:在新生儿中,有时是在用眼角的余光另一个垂直切割是必要的。割双眼皮的角落里时,因为有一个血管,如果切割,会流血过多照顾。
  6. 使用无菌30.5号针头刺穿一个小孔眼的一侧在巩膜开始处的线。小心避免通过插入针远远不够的斜面进入眼睛损坏镜头。
  7. 允许玻璃体流出孔,并使用无菌棉签来吸收液体。
  8. 一旦玻璃已经停止流淌出来的孔,插入连接到汉密尔顿注射器预装了顺行示踪染料的钝端针入孔。注意:插入针缓慢,以避免刺穿眼睛的另一侧或损坏透镜。
  9. 慢慢的染料注入到眼睛。通常,霍乱毒素β亚基偶联于Alexa的594,647,或488(CTB-594,CTB-647,或CTB-488,5-6微克/微升)用于顺行迹RGC输入。新生儿(≤10页)1-2微升充足且对小鼠> P10〜3微升就足够了。注:Alexa染料是溶酶体降解特别耐
  10. 留针在洞口几秒钟,然后慢慢放开。
  11. 用棉棒吸去多余的液体,防止染料外泄。
  12. 取少量抗生素软膏的眼睛。如果眼睛被打开了手术,轻轻地重新定位眼皮在一起。
  13. 如果注入双眼,在另一只眼睛重复过程。
  14. 注射后(次),离开鼠标下的热灯或热垫,直到它开始从anesth恢复ESIA。
  15. 返回鼠标到一个干净的家笼和监控,以确保它是返回到殖民地之前完全清醒。

2,准备组织成像

这个组织制备协议用 ​​于在其中吞噬细胞标记有荧光标记物( 例如 ,CX3CR1-EGFP为小胶质细胞)报告小鼠。如果记者行不可用,研究者可免疫染色的组织切片(见讨论)。

  1. 〜24小时,在注射后,牺牲了鼠标和解剖大脑。
  2. 落固定在一个Falcon管中过夜,在4℃下填充有4%多聚甲醛(PFA)的脑注意:PFA是有毒的。通过使用在通风橱中或在下沉气流表和佩戴个人防护装备,避免吸入和皮肤接触。注:固定可短(≥4小时)。另外,代替降定影,4%PFA灌注可用于后跟一个2-24小时滴定位。然而,灌流的比较d来固定掉落新生儿和成人的大脑发现图像质量或定量没有区别。
  3. 漂洗在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中脑3倍。
    1. 倒大脑和PFA到一个空的权衡船。
    2. 用刮刀给大脑转移到另一个称量舟充满PBS。
    3. 脑洗两次在PBS(转移大脑两个称量皿充满PBS)。
  4. 脑转移到Falcon管中填充了30%的蔗糖溶液。离开大脑中的蔗糖在4℃直至大脑沉到管(24-48小时)的底部。
  5. 一旦大脑下沉,准备大脑切片。下面的步骤是准备用一个滑动切片机用冷冻阶段40μm的浮动部(低温恒温器也可以被使用)。
    1. 用刀片去掉不需要的大脑的部分(外膝体,消除大脑的头端和尾端部分)。
    2. 冻结胸罩在铝箔在干冰。在这段时间内,冷冻切片机阶段和填充一个24孔板的每个孔用0.5ml的M 0.1的磷酸盐缓冲液(PB)。
  6. 装载冷冻大脑(它应该会出现不透明)在冻结阶段。
    1. 取少量的最佳切削温度化合物(OCT)的舞台。
    2. 一旦华侨城开始冻结,奠定了大脑中的十月将被削减的大脑到底应朝上( 例如 ,为外膝体,面对尾朝上)。
    3. 覆盖大脑和OCT具有非常精细粉碎的干冰。
    4. 离开干冰上脑/华侨城〜30秒。
    5. 使用大画笔,除去干冰。大脑和OCT应冻结舞台。
  7. 首先通过组织切片,直到感兴趣区域(ROI)的区域为止。
  8. 一旦投资回报率达到,用小画笔从刀片取出部分,并将它们转移到24孔平台Ë含0.1M PB(步骤2.5.2)。保持油漆刷湿润事先从刀片取出部分润湿它在0.1M的PB。注:部分可留在0.1M PB一夜之间在4°C。
  9. 一旦部分已收集,可视化的顺行标记荧光解剖显微镜下,选择包含投资回报率的部分。
  10. 安装在一个用小画笔滑动部分。
    1. 适用0.1M的PB一个小型游泳池的充电显微镜幻灯片。
    2. 转移组织切片在PB的游泳池。
    3. 用PB和画笔的方向和传播组织。
    4. 使用的Kimwipe灯芯多余的PB。注意避免排汗关闭部分。
    5. 允许完全风干。
    6. 取一小颗的安装介质的每个部分,并安装盖玻片上的顶部(​​22×50毫米,1.5号)。
    7. 密封滑动的边缘用指甲油和储存在-20°C,直到成像会议。注意:虽然成像在一周的制备忠告,幻灯片可以保持在-20℃下持续数周前成像。

3,组织成像

所有图像都在旋转盘共聚焦显微镜(的Ultraview Vox的旋转盘共聚焦显微镜配备二极管激光器(405纳米,445纳米,488纳米,514纳米,561纳米和640纳米))所收购。影像也可以收购任何显微镜获取高分辨率的z栈的能力( 例如 ,激光扫描共聚焦显微镜,显微镜啶其次是反褶积等)。帧大小通常为1,000×1,000像素。

  1. 寻找投资回报率在10倍放大倍率和获取图像。在retinogeniculate系统成像的小胶质细胞,投资回报率是最内侧的外膝体部分。
  2. 转移到更高的放大倍率(一60X计划阿婆目标,NA = 1.4,通常使用)。
  3. 收购视图包含使用0.2微米的z一步吞噬细胞第一场秒。
  4. 获得含15-19每只动物吞噬细胞更多的领域。

4,准备定量(ImageJ的)图片

  1. 打开Z堆栈中的ImageJ。
  2. 转到图像菜单中,选择颜色和分离通道。
  3. 从含有吞噬物质的通道(s)减去背景。
    1. 选择包含吞没材料( 例如 ,突触前输入)通道窗口。
    2. 进入处理菜单,并选择减去背景。使用10像素的滚动球半径为于外膝体突触前投入顺行追踪。注:滚球半径凭经验确定。然而,一般应大到不属于背景的部分图像中的最大对象的半径。
  4. 平滑含有吞噬细胞的通道。
    1. 选择含有吞噬细胞( 例如 ,小胶质细胞)的通道窗口。
    2. 进入处理菜单和SELECT过滤器,平均。使用1.5均值滤波(平滑这在后面的步骤中面绘制的图像)。
  5. 从含有吞噬细胞的通道中减去背景。
    1. 选择含有吞噬细胞( 例如 ,小胶质细胞)的通道窗口。
    2. 进入处理菜单中,选择减去背景(设置将需要凭经验确定)。使用50像素的EGFP阳性的小胶质细胞滚动球半径。
  6. 通过进入图片菜单,然后选择颜色,合并通道合并通道。
  7. 作物的ROI含吞噬细胞从合并后的文件(这使得表面渲染速度更快,请参阅步骤5)。
    1. 使用绘制矩形选择工具,在工具栏中围绕投​​资回报率一箱。
    2. 转到图像菜单,然后选择裁剪。
  8. 再次分裂通道(见步骤4.2)。
  9. 每个通道保存为自己的TIFF文件。

5,准备用于图像定量在Imaris里

  1. 打开Imaris里,并确保音量图标在左上角的菜单( 图2)中选择。
  2. 裁剪图像的打开第一通道(任何频道都可以先开,只是保持一致)。
  3. 添加其他通道(s)。进入编辑菜单,选择添加通道和选择文件中的下一个频道。 (重复任何剩余的渠道这一步)。注:要更改颜色,请进入显示调整窗口,点击频道名称( 图3A)。这将弹出一个对话框来调整颜色。如果显示调整窗口不可见,请进入编辑菜单,然后选择显示调整。
  4. 调整像素值。进入编辑菜单,然后选择图像属性。在这个窗口中,调整的x,y和z的像素值(这些值取决于显微镜,物镜,摄像头,和z步收购,可以在用于获取图像的软件中找到)。
  5. 步骤5.5将导致一个非常小图像。要调整,请按一下右下角( 图2)的拟合图标。
  6. 在显示调整窗口,调整亮度和对比度,使用左侧和中间的三角形的每个信道。

6,3维(3D)表面的吞噬细胞的渲染

  1. 在顶部的工具栏,可以肯定的超越模式的选择( 图3C)。
  2. 在显示调整窗口中,取消选中除吞噬细胞通道的所有通道。这会从视野中移除它们。
  3. 点击面绘制图标( 图2)。
  4. 一个创建的窗口将显示在左下角( 图4A),确保分部的投资回报率是选中在这第一个窗口。点击底部的蓝色前进按钮。
  5. 调整平滑。
    1. 在下一个窗口中,从下拉菜单中( 图4B)吞噬细胞的通道。这将调整细节量将浮出水面并且应根据经验确定(0.1μm的平滑通常用于小胶质细胞)。
    2. 选择绝对阈值。
    3. 点击蓝色的前进按钮在底部。
  6. 阈值的图像。
    1. 点击直方图并拖动,直到图像被适当地浮出水面( 图4C)。这是通过旋转该图像,以确保覆盖在荧光图像上的灰度表面是一个精确的表面表示经验确定。注:要旋转,在指针菜单中选择浏览在上屏幕右侧( 图3B)中,单击并按住图像旋转。要恢复图像至原来的方向,选择地底从视图菜单中左。
    2. 点击蓝色的前进按钮在底部。
  7. 在接下来的窗口中,有一个选项按大小等。除非图像是非常嘈杂的过滤掉任何表面,不过滤和删除Ÿ过滤器,自动出现。点击绿色箭头在底部完成面绘制的吞噬细胞。一组新的选项卡会出现( 图5)
  8. 如有必要,删除不感兴趣的吞噬细胞的一部分的任何表面。
    1. 确保在指针菜单( 图3B)选中选择选项。
    2. 单击要删除的任何表面,使它变成黄色。若要删除多个曲面,单击表面上,同时按住控制钮。
    3. 点击铅笔选项卡下删除。
  9. 选择和合并的吞噬细胞的所有表面形成一个表面上。
    1. 点击漏斗( 过滤器选项卡, 图5C)。
    2. 单击添加。
    3. 选择任何过滤器,直方图拖动到最左边(所有表面应为黄色)。
    4. 回到铅笔选项卡并单击统一。
  10. 进入图形选项卡( 图5A 图5D)。对于显示多个参数,去左下角( 图2)的扳手图标,然后选择参数进行记录。
  11. 记录吞噬细胞的体积和文件,然后再继续保存。

吞噬材料7。三维表面渲染

  1. 创建已吞噬细胞引起的吞噬物质的新的信道。
    1. 而吞噬细胞表面被选中,单击铅笔标签。
    2. 单击面膜所有。
    3. 在出现的对话框中,选择相应的吞噬材料( 例如 ,突触前投入顺行追踪; 图5B)的通道。
    4. 检查是否重复申请通道面膜前,点击OK。
    5. 一个新的通道会出现在一个只包含已吞噬的物质和里面的显示调整窗口吞噬细胞。
  2. 表面渲染含总吞噬和nonengulfed材料的通道。
    1. 取消选中在显示调整窗口的所有通道,除了要浮出水面的通道,并取消对吞噬细胞产生的表面。
    2. 再次点击面绘制图标(见步骤6.3),并利用所描述的吞噬细胞相同的步骤通道创建一个面(步骤6.4-6.11)。注意事项:一定要选择正确的通道前,平滑和阈值(步骤6.5; 图4B)。记下阈值(见步骤6.6; 图4C)。该值也可以在表面渲染后得到完成(魔杖标签; 图5A)。
  3. 记录总的吞噬和非吞噬物质的体积和文件,然后再继续保存。
  4. 表面渲染吞噬物质(吞噬细胞内的物质)。
    1. 可视化的荧光只吞噬物质的新渠道(见步骤7.2.1)。
    2. 按照上述相同的步骤(步骤7.2-7.3)。注意事项:一定要选择从下拉菜单中选择正确通道平滑之前(选择步骤7.1中创建新的通道)。在阈值窗口中,手动输入被用于渲染的总吞噬和非吞噬材料(见步骤7.2.2)中设定的阈值。
  5. 记录吞噬物质的量和持续之前保存的文件。

8,计算视场的总容积

  1. 任何通道创建一个新的表面。
  2. 在阈值窗口(步骤6.6),滑动直方图一路向左,使整个场浮出水面。
  3. 堆焊完成整场并记录量(步骤6.7-6.11)。
  4. 保存该文件。

9,计算吞噬物质的量

  1. 计算的密度使用以下算法总吞噬和非吞噬物质的通道:
    场(第8步)的总吞噬和非吞噬材料体积(步骤7.3)/音量。
  2. 使用下面的算法计算出每个单元%吞没:
    (吞噬物质的量(步骤7.5)/的吞噬细胞(步骤6.11)的总体积)×100
    注意:为了计算变化细胞大小,数据被归一化到吞噬细胞的总体积。如果从步骤9.1数字是高度可变的对面域,它可能需要从步骤9.2中的数据归一化,以计算在9.1。

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Representative Results

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最近,我们使用这个吞噬试验,以可视化和量化的显影retinogeniculate系统的突触前输入,小神经胶质细胞介导的吞噬( 1)7。从CX3CR1-EGFP杂合子小鼠视网膜神经节细胞进行顺行追踪与CTB-594和CTB-647进入左眼和右眼分别。在此之后追踪,外膝体中EGFP阳性的小胶质细胞进行成像。这些图像随后的表面呈现为体积测量。

使用这种技术,我们发现,在外膝体(P5)内发育突触重塑的一个高峰期,突触前输入由小胶质细胞( 图6)吞没。少至4天之后,当大量的重塑是几乎完全的(P9),有一个显着减少的吞噬投入量。此外,吞噬和修剪被破坏的短少在属于经典补体级联反应的蛋白质的小鼠( 图6),以及以下操作神经元放电的(数据未显示)7。

图1
图1:战略评估研资局突触前投入7小胶质细胞介导的吞噬A)顺行追踪策略的示意图。左眼和右眼RGC输入追踪与CTB-647(蓝色)和CTB-594(红),分别。投入小胶质细胞介导的(绿色)吞噬随后评估。 二)出生后第5天(P5)鼠标外膝体的代表性低倍率的图像下面的左(蓝色),右(红色)眼输入的顺行追踪。比例尺= 100微米。 次)一个小胶质细胞(绿色荧光蛋白,绿色)采样由左(蓝色的边境地区),右(红色)眼部输入(小图B中)。CII) )。CIII)表面的小胶质细胞的渲染和吞噬研资局的投入。网格线增量= 5微米。 迪)代表小胶质细胞(绿色,EGFP)从P5外膝体。 RGC输入被标记为CTB-594(红)和溶酶体标记有抗CD68(蓝色)。DII)的小胶质细胞体积以外的所有CTB荧光已除去露出了小神经胶质细胞内吞噬RGC输入(红色)和溶酶体(蓝色) 。白色箭头)DIV-V)单独的CD68(组)和CTB(Dv)为渠道;(绿色)DIII)大多数RGC输入(红色)是完全CD68阳性溶酶体(蓝色内本地化。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。


图2。Imaris里的软件图标。

图3
图3。一般的导航窗口中的软件。 A)显示调整窗口B)的指针窗口。选择将允许选择特定的表面。导航将使图像在视场的旋转。C)是必要的是在超越模式下的面绘制的体积。

图4
图4。表面渲染软件。一)创建窗口B)平滑ING窗口。请从下拉菜单中(以黄色突出显示)。C)阈值表面荧光图像表面的通道。通过红色框突出显示的是,应作记录,以总吞噬和非吞噬物质的阈值。这个数字将在以后应用到阈值和表面的吞噬物质。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5。获取软件体积的测量。 A)出现以下面绘制标签。注意魔杖,铅笔,漏斗和图表选项卡,是文字。的B标识的面具都采用的吞噬细胞内可视化吞噬物质。注意选择的通道(你们llow盒)。 三)漏斗/过滤器选项卡下的功能允许在该领域的所有表面的选择了,所以看来黄一路滑动直方图的左边。任何过滤器可以选择这个D)在图形选项卡中,体积的测量可以得到和记录。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
从P5 图6。代表数据7 A)代表表面呈现的小胶质细胞(荧光图像示于图1),P9,P30和鼠标外膝体。扩大的插图表示用黑色虚线。研资局投入网格线增量= 5微米B)吞没时显著高峰修剪的外膝体(P5)增加对岁以上人士(P9和P30)。 * P <0.001单因素方差分析中,n = 3只/年。 三)小胶质细胞的短少在补体受体3只小鼠(KO,黑皮棒)吞噬显著减少RGC的投入相比,WT窝(白条)。所有数据均标准化为WT对照值。 * P <0.04,通过Student 的t检验,n = 3只小鼠/基因型。所有的误差棒表示SEM 点击这里查看大图。

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Discussion

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为了准确地测量吞噬作用,吞噬材料必须贴在这样一种方式,研究人员可以直观一次溶酶体降解发生。此外,高分辨率成像是必需的,随后使用软件,使研究者能够可视化整个细胞的体积和量化其内容。在这个协议中,我们描述了用于使用CTB偶联至Alexa染料来标记吞噬材料结合高分辨率共焦显微镜和三维重建测定吞噬细胞介导的​​吞噬一个高度可靠的和定量的方法。这种方法已被用来在实验室成功地分析小胶质细胞介导的吞没的突触前输入发生突触重塑在发育中的小鼠大脑(retinogeniculate系统)7。此外,它已被证明是一种高度灵敏的技术,可以区分在不同的发育年龄在吞噬微妙变化下·R无病理条件以及野生型和敲除小鼠之间。稍作调整,该协议可以适应由时间推移成像研究吞没在活组织中。此外,该协议可以被用于研究疾病吞噬细胞 - 神经元相互作用。

注意事项

一个这种测定法的最有用的方面是在其保持在进入溶酶体降解途径后可见这样的方式标记的神经元突起的能力。然而,由于神经元的标记,这可能是难以区分什么样的细胞的部分被吞噬。这需要非常仔细的分析区域( 例如 ,突触小区域相对于外膝体的非突触区)结合电子显微镜7。此外,这可能被证明在神经元胞体和突起居住在同一地区的其他脑区更为困难。然而,另一种标记策略可使用(见贝尔OW)。此外,由于光学显微镜的分辨率极限,还有一种可能性,即1可能高估吞噬物质的量。因此,必须小心,以验证吞噬物质是溶酶体内。出于这个原因,我们使用抗CD68对小胶质细胞内溶酶体标记,3D渲染,以及正交视图来验证检测的参数。

电池类型

除了 ​​小胶质细胞,此方法也可用于分析其他吞噬细胞在脑( 例如 ,星形胶质细胞),并在周围神经系统和免疫系统( 例如 ,perisynaptic雪旺氏细胞,巨噬细胞等)的作用。另外,由于CTB结合至Alexa染料是这样易于被大多数细胞中,类似的标记策略可用于整个大脑和其他器官系统的标签吞没材料。

吞噬物质的标签

作为一个人ternative到CTB偶联至Alexa染料,我们使用以下策略来标记吞噬材料7:1),其中视网膜神经节细胞进行标记,用荧光蛋白( 例如 ,tdTomato,EGFP,等等)的荧光报道基因小鼠。 2)顺行标记用试剂盒pHrodo染料缀合的葡聚糖,染料,只有荧光一旦它在溶酶体。使用这些不同的策略,可视化和小神经胶质细胞内吞噬突触前输入的量化可以是performedwith相同的成像和定量分析的技术。不过,Alexa的染料结合物是由于Alexa的染料的高抗溶酶体水解酶7,21最强大的。此外,用抗体( 例如 ,抗VGLUT2,突触前小泡蛋白)吞噬物质标记已经尝试。然而,这是检测一个相对不可靠的方法,因为大多数蛋白质在溶酶体迅速分解一次。它是难以区分低荧光,由于蛋白质的降解在背景。

动物用

在当前的协议,小胶质细胞荧光标记基因使用荧光报告小鼠(CX3CR1-EGFP)22。不过,也有实例中,抗体与标记​​荧光报告结构的遗传表达是必要的。例如,当荧光报道小鼠无法提供所关注的吞噬细胞,使用大鼠是必要的,或研究者希望看敲除小鼠不越位成荧光报道小鼠品系。对于这类情况下,巨噬细胞可通过免疫组化标记和数据具有可比性,从 ​​使用荧光报告7小鼠实验结果。下面的组织切片中,我们通常使用一个标准的免疫染色协议的浮动部分7。选择了针对该标记将在整个小区中的蛋白质的抗体,它是重要的其过程。例如,标签的小胶质细胞,抗Iba1都可以使用。

更广泛的应用:实时成像和疾病

虽然这个协议是基于固定的组织分析,稍作修改将使同样的分析中通过实时成像获得的图像。经过时间的推移成像会议,随后的Z-堆栈可以处理相同的4-9在本协议中的步骤。此外,虽然本公司已申请本协议过程中的健康发育中枢神经系统突触重塑,以可视化的突触吞噬,这个协议也可以在疾病模型应用。特别是,该协议可用于脊髓损伤,与阿尔茨海默氏病等12,14-19,23相关的早期突触损失来研究疾病中的突触发生实质性的改造,如在突触损失和再生的情况下- 26。此外,人们也可以适应这种技术来研究疾病,在PHAG比突触材料等的ocytosis已被描述,如小胶质细胞/巨噬细胞介导的脱髓鞘疾病髓鞘的吞噬( 例如 ,多发性硬化)和β-淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏病5,6,27-29的吞噬。

总之,这里所描述的吞噬试验提供了一个方便,重复性好,灵敏的技术研究与细胞外环境吞噬细胞的相互作用。重要的是,此法具有广泛的用途和功能,将成为神经科学界,以及那些在其他器官系统的工作。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

,NRSA(F32-NS-066698; DPS);工作是由史密斯家庭基金会(BS),达纳基金会(BS),约翰·默克学者奖励计划(BS),NINDS(BS RO1-NS-07100801)资助项目,南希·劳瑞商标基金会(DPS),美国国立卫生研究院(P30-HD-18655; MRDDRC影像核心)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat pad Vet Equip, Inc. 965500 
Warm water source for heat pad Kent Scientific TP-700
Stereo microscope DSC Optical Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
Sliding microtome with freezing stage Leica SM2010 R
Microtome blade Leica 14021607100
Fluorescent dissecting microscope Nikon SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
Spinning disk confocal microscope Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton gas tight syringes Hamilton 80030 Use a different syringe for each color dye/tracer
Hamilton needles Hamilton 7803-05, specifications: blunt, 1.5"
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) Invitrogen 488: C22841 Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647)
594: C22842
647: C34778
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-50TAB
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) Bausch & Lomb 24208-780-55
30.5 G needle Becton Dickinson 305106
Spring scissors Roboz RS-5630
Cotton-tipped applicator Fisher 23-400-125
Paraformaldeyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.
Dissection tools – scissors, forceps, spatula Small scissors: Fine Science Tools Small scissors:14370-22
Large scissors: Roboz Large scissors: RS-6820
#55 forceps: Fine Science Tools #55 forceps: 11255-20
Spatula: Ted Pella, Inc. Spatula: 13504
Sucrose Sigma S8501-5KG Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)
OCT Compound VWR 25608-930
Weigh boat USA Scientific 2347-1426
24-well plates BD Biosciences 353047
Sodium phosphate monobasic Sigma S6566-500G Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O
Sodium phosphate dibasic  Sigma S5136-500G
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 VWR 48393 194
Charged microscope slide VWR 48311-703
Vectasheild Vector Laboratories H-1200

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References

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一个吞噬含量:一个协议,以评估之间的中枢神经系统吞噬细胞和神经元的相互作用
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Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).More

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).

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